Practica N° 1

TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NPM)

Diversas enfermedades son transmitidas vía fecal-oral utilizando como vía de

ingreso alimentos y agua, es necesario reconocer microorganismos que funcionen
como indicador de contaminación fecal. Estos deben ser exclusivos de las heces,
constantes y abundantes, y tener la capacidad de sobrevivir en los intestinos y
desarrollarse extra intestinalmente.

El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin

embargo, las características de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse
fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que el grupo
coliformes se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; conforme
mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar
frente a una contaminación reciente.
Cuando hay presencia de coliformes en los alimentos estos se multiplican e indican
la deficiente calidad del producto, más si estos han pasado por procesos térmicos
como pasteurización, cocción etc.

El grupo de bacterias coliformes totales son bacilos gram negativos aerobios o

anerobios facultativos no esporulados fermentadores de lactosa, producen gas
entre 24-48 hr a 35 +/-2 °C. Entre ellas tenemos: Escherichia coli, Enterobacter,
Citrobacter, y Klebsiella.

El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas

capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h de incubación a
44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más
común es Escherichia coli.

La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante

el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y
diferenciales.

Fundamento de la técnica

La técnica del número más probable (NPM), es un medio para estimar la densidad
de microorganismos viables en una muestra; la determinación de microorganismos
coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta
en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción
de ácido y gas al incubarlos a 35°C  2C durante 48 h., utilizando un medio de
cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase
presuntiva y la fase confirmativa.

La búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo

brila, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales
(Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las
pruebas bioquímicas básicas a las colonias típicas.

La metodología de la técnica está basada en siembra de volúmenes secuenciales

de base 10 (10,1 ,0.1,0.01) de la muestra pura o diluciones decimales, el número
de dilución depende del grado de contaminación supuesto en la muestra y/o
estándares de calidad del producto, no hay límite para el numero de tubos usados
por dilución, pero en la práctica se considera la cantidad de medio de cultivo, el
número de tubos y el tiempo de incubación requerido para realizar el análisis.

La relación de volumen de muestra a volumen de medio debe mantenerse en 1:10,

es decir si siembra 1 mL de muestra debe utilizarse 10 mL de medio. Cuando la
relación medio-muestra no se cumple se hace necesario prepara el medio de cultivo
más concentrado, de tal forma que se corrija el efecto de dilución de nutrientes o
inhibidores causados en el medio por el volumen de la muestra adicionada.

OBJETIVO

• Diferenciar los organismos coliformes totales de microorganismos coliformes

fecales.
• Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua mediante la búsqueda de
microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
• Leer, interpretar e informar los resultados adecuadamente obtenidos
aplicando la técnica de NMP

MATERIALES

• Muestra a analizar según corresponda al grupo de trabajo (agua)

• Tubos de ensayo con 10 mL de medio de cultivo Brila con campanas de
Durham en su interior
• Pipetas
• Gradilla
• Incubadora
• Tubos con caldo de enriquecimiento
 • Placa de Petri con agar EMB

PROCEDIMIENTO

• Agitar la muestra y transferir 10 ml a un frasco que contenga 90 ml de caldo

de enriquecimiento mezclar y dejar reposar (2 a 3 min) completando el
volumen de 100 ml.

• Tomar de los 100 ml (caldo + muestra) 1mL y realizar diluciones en series (2

tubos) así tendrán en total tres diluciones en serie (10-1; 10-2; 10-3)

• Añadir 1 mL de la dilución 10-1 a cada uno de los 3 tubos con 10 mL de caldo

brila. Tener el tubo control en cada serie.

• Añadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 y 10- 3 a dos series de 3 tubos cada una
con caldo brila.

• Incubar a 35-37°C durante 24-48 h.

• Los tubos después de la incubación se registrarán como positivos si

presentan crecimiento (turbidez) y producción de gas (burbujeo).

NOTA: la muestra de agua también se servirá 1 mL en placa con medio

selectivo para observar características macroscópicas de las bacterias.

EXPRESION DE RESULTADOS

Calcular la densidad microbiana con base en el número más probable (NMP)

conforme al procedimiento señalado en la tabla 1, (que se muestra a continuación y
es utilizado para el análisis de agua), para estimar la población de bacterias
coliformes totales,bacterias coliformes fecales y Escherichia coli de acuerdo con las
diluciones empleadas.
El informe de laboratorio debe contener:

• Introducción (máximo 2 hojas)

• Marco teórico (Máximo 4 hojas)
• Descripción del procedimiento (Describir la metodología del análisis
NMP paso a paso)
• Resultados y Análisis (Interpretar resultados según la tabla de NMP)
• Conclusiones (Bien justificadas)
• Actividad
• Bibliografía
Agradezco que realicen una buena redacción, con márgenes, texto justificado, letra Arial (12).

Actividad

1. ¿Cuál es el fundamento de los medios de cultivos utilizados y de la

técnica de NMP?

2. ¿Porque fue necesario hacer una siembra en la caja de agar

directamente desde la muestra?

3. Ventajas y desventajas de la técnica de NMP

4. En que otros productos es válido aplicar la técnica de NMP, justifique su

respuesta.
BIBLIOGRAFIA

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas

para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM.
México.

Ministerio de la protección social, Resolución 2115-2007

Hernández Urzúa, Microbiología de los alimentos. Editorial Panamericana, 2015

Agua para todos, Agua para la vida: Informe de las naciones unidas sobre eldesarrollo
de los recursos hídricos en el mundo.

Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiología Médica de
Jawetz. Manual Moderno 17a Edición 2002.

www.invima.gov.co