Instituto tecnológico de acapulco

Ingeniería bioquímica

Semestre 7

Microbiología de los alimentos

José Ángel Marcial Moreno

No control 19320393

Prof.: Miguel Ángel Diaz Alday

Miércoles 5 de octubre del 2022

Acapulco gro
MARCO TEÓRICO

Coliformes

Las bacterias coliformes a menudo se denominan "organismos indicadores"

porque indican la presencia potencial de bacterias que causan
enfermedades en el agua. La presencia de coliformes en el agua no
garantiza que beber el agua cause una enfermedad. Más bien, su
presencia indica que existe una vía de contaminación entre una fuente de
bacterias (agua superficial, sistema séptico, desechos animales, etc.) y el
suministro de agua. Las bacterias que causan enfermedades pueden
utilizar esta vía para ingresar al suministro de agua.

Se pueden analizar tipos específicos de bacterias coliformes,

especialmente después de que una prueba de bacterias coliformes totales
sea positiva. Estos subgrupos de bacterias coliformes incluyen coliformes
fecales y Escherichia coli o E. coli. Las bacterias coliformes fecales son
específicas del tracto intestinal de los animales de sangre caliente,
incluidos los humanos, y por lo tanto se requiere una prueba más
específica para detectar la contaminación por aguas residuales o
desechos animales. La E. coli es un tipo de bacteria coliforme fecal que se
encuentra comúnmente en los intestinos de animales y humanos. Un
resultado positivo de E. coli es mucho más serio que las bacterias coliformes
por sí solas porque indica que los desechos humanos o animales están
ingresando al suministro de agua. Hay cientos de cepas de E. coli, la
mayoría de las cepas son inofensivas y viven en los intestinos de humanos y
animales sanos, pero algunas cepas pueden producir una poderosa toxina
y causar enfermedades graves y la muerte.
Coliformes Totales

Este grupo de bacterias pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Bacilos

Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos,
fermentan la lactosa a 35ºC +/- 2ºC con la producción de ácido y gas,
catalasa positiva, móviles en su gran mayoría por medio de flagelos
peritricos. Las bacterias de este grupo son: Escherichia coli y miembros de
los géneros Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella.

Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino

de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir,
homeotermos, pero también ampliamente distribuidas en la naturaleza,
especialmente en suelos, semillas y vegetales.

Coliformes Fecales

Las bacterias coliformes fecales forman parte del total del grupo coliforme.
Estas son definidas como bacilos gran – negativos, no esporulados que
fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 44.5 °C + 0.2°C
dentro de las 24 + 2 horas. La mayor especie en el grupo de coliforme fecal
es Escherichia coli.

El número más probable

Calcular el NMP de E. coli basada en la proporción de los tubos positivos
de caldo EC confirmados. Con frecuencia es necesario calcular el NMP
con cantidades de muestra diferentes de los enlistados en las Tablas H.8.4
desde el primer número de la combinación encontrada. Si la cantidad de
muestra >0.01g multiplicar el NMP enlistado en la tabla utilizada
dependiendo del procedimiento realizado por 10.
Prueba Presuntiva

Preparación de la muestra e inoculación del medio, mezclar la muestra

agitándola vigorosamente para lograr una distribución uniforme de los
microorganismos dependiendo de la naturaleza del agua y el contenido
bacteriano esperado, hacer las diluciones necesarias en esta etapa.

Para preparar la muestra, realizar diluciones e inocular alícuotas en el

medio presuntivo. Para alícuotas superiores o iguales a 10 mL, usar tubos
conteniendo medio de cultivo de doble concentración.

Incubar los tubos inoculados de 24 h a 48 h ± 3 h a 35 ºC ± 0,5 ºC. Examinar

los tubos de cultivo a las 24 h de incubación y registrar como reacción
positiva aquellos que muestren turbidez y formación de gas en el interior
del tubo invertido (tubo de Durham). Continuar la incubación por 24 h ± 3 h
en aquellos tubos que no presenten estos cambios y examinar
nuevamente.

Prueba confirmativa

La formación de gas y turbidez son resultados presuntivos de coliformes y es

necesario realizar pruebas confirmativas, resembrar cada uno de los tubos
con reacción positiva a tubos con caldos para prueba confirmativas según
sea la determinación para coliformes totales, coliformes fecales
termotolerantes y/o E. coli.

Para confirmar la presencia de organismos coliformes, incubar los tubos

con caldo lactosa bilis verde brillante resembrados a 35 ºC ± 0,5 ºC y
examinar la producción de gas en un periodo de 24 h a 48 h ± 3 h.
Prueba Complementaria

Esta es una prueba optativa de calidad para todas las muestras de agua
que tiene como objetivo confirmar el 10% de los tubos positivos de
coliformes totales en caldo verde brillante. Tomar una asada de cada uno
de los tubos positivos de caldo verde brillante y sembrar por estría cruzada
en agar Mc Conkey. Incubar a 35°C ± 0.5°C por 24h ± 2h. Observar
las colonias típicas fermentadoras de color rosa intenso que pueden estar
rodeadas de un halo opaco de precipitación de las sales biliares.

Seleccionar 1 o más colonias aisladas con las características anteriores o lo

más parecido a esta descripción e inocular igual número de tubos de
fermentación con caldo lauril triptosa y a tubos con agar nutritivo
inclinado. Incubar a 35°C ± 0.5°C examinar los tubos a las 24h y
observar si hay formación de gas. Anotar los resultados. Si la formación de
gas no se observa, incubar 24h más y anotar los resultados. Realizar tinción
de Gram a partir del crecimiento en el agar nutritivo para observación de
la morfología microscópica de las colonias.

La formación de gas en los tubos de caldo lauril sulfato dentro de las 48h
± 3h y la observación de bacterias Gram negativas, en forma de bacilos
no esporulados constituyen una prueba positiva a la presencia del grupo
coliforme

OBJETIVOS
Identificar la presencia de coliformes totales y fecales en la muestra
aplicando la técnica del número más probable.

Objetivos específicos
 • Realizar correctamente las 3 etapas para la identificación de
coliformes totales y fecales.
• Estriar correctamente con el asa bacteriológica micológica.
• Aplicar correctamente la técnica del número más probable.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Identificar si la muestra analizada tiene coliformes que puedan dañar
nuestra salud al momento de ingerirlos.

METODOLÓGIA

Prueba Presuntiva
1.- Se pesa el caldo lactosado para 9 tubos de 15x150.

2.- Se deja reposando 10 – 15 minutos el caldo lactosado y posteriormente

se pone en el Hot plate.

3.-Se le agrega una campana de Durham a cada uno de los 9 tubos de

ensayo.

4.- Se vacían 12 mL de caldo lactosado en cada uno de los 9 tubos de

ensayo.

5.- Se meten a esterilizar los 9 tubos de ensayo, un matraz Erlenmeyer con

100 mL de solución salina, 5 pipetas de 1 mL, 1 pipeta de 10 mL, 1 cuchara.

6.- Se realiza la muestra madre, licuando 10 gr.

7.- Se realizan las diluciones de 10-1 a 10-5.

8.- Se inoculan 3 series de 3 tubos diferentes.

9.- Incubar a 37 °C de 24 – 48 hrs.

10.- Realizar un código para las 24 y otra para 48 hrs.

Prueba Confirmativa
11. Se toman los tubos positivos de 48 hrs para realizar la prueba
confirmativa.

12.- Se pesa el caldo Billis Brillante al 2% para la cantidad de tubos positivos

para coliformes fecales y totales.

13.- Se le agrega una campana de Durham a cada uno de los tubos de

ensayo.

14.- Se vacían 12 mL de caldo Billis brillante al 2 % en cada uno de los tubos

de ensayo.

15.- Se meten a la autoclave.

16.- Se inoculan con los tubos positivos de la prueba presuntiva.

17.- La mitad de los tubos se mete a incubar de 44 – 45 °C para coliformes

fecales de 24 – 48 hrs.

18.- La otra mitad de los tubos se mete a incubar a 37°C para coliformes
totales de 24 – 48 hrs.

19.- Realizar un código para las 24 y otra para 48 hrs.

20.- Con los resultados obtenidos se aplica la técnica del número más
probable.

Prueba Complementaria
21.- Realizar la prueba complementaria para los tubos positivos para
coliformes totales y fecales.

22. Pesar Agar Endo o MacConkey respecto a los tubos positivos.

23.- Meter a esterilizar el agar en la autoclave.

24.- Hacer vaciado en placa.

25.- Inocular y realizar estriado con asa bacteriológica.

26.- Incubar durante 24 hrs.

27.- Realizar prueba IMvic.

28.- Preparar caldo SIM, Rojo de metilo, Voges Proskauer y agar Simmons
citrato.

29.- Tomar muestra del agar MacConkey.

30.- Inocular e incubar durante 24 hrs.

JUSTIFICACIÓN
Al realizarse esta práctica los estudiantes aplicarán sus habilidades
anteriormente aprendidas en el curso de microbiología para lograr
identificar coliformes fecales y totales presentes en la muestra que se
utilizará como muestra el cual es vendido por personas que no realizan
buenas prácticas de manufactura.

Materiales:

• Tubos de 15x150
• Probeta
• Licuadora de aluminio
• Asas bacteriológicas micológicas
• Campanas de Durham
• Cuchara
• Matraz Erlenmeyer
• Agitador
• Mechero
• Pipetas de 1 mL
• Pipeta de 10 mL
 • Papel
• Gradilla
• Vaso deprecipitado

Bibliografía:

Paz, A. (10 de 07 de 2006). Coliforme Fecal. Obtenido de

https://web.archive.org/web/20110219213611/http://www.bvsde.paho.org/bvsac
d/scan/013761/013761-03.pdf

PennState Extension. (19 de 10 de 2020). Bacterias Coliformes. Obtenido de

https://extension.psu.edu/bacterias-
coliformes#:~:text=Las%20bacterias%20coliformes%20incluyen%20un,pueden%20a
parecer%20en%20la%20piel.

Rodriguez, R. (2020). Evaluación de Coliformes totales y Escherichia. Nicaragua.