Análisis microbiológico

INTRODUCCION

Los análisis microbiológicos consisten en una inspección de alimentos o sustancias por medio
de pruebas que permiten detectar si se presentan o no elementos patógenos. De acuerdo con
la cantidad de agentes patógenos encontrados y el grado de contaminación que tengan los
alimentos o sustancias analizadas, se puede determinar si es apto o no para su posterior
procesamiento y consumo en humanos o animales.

El método del número más probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue
siendo ampliamente utilizado. En un principio este método fue empleado para estimar el
número de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha
demostrado que también puede ser aplicado para la determinación de microorganismos
aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este
método es aplicable para estimar el número de microorganismos en muestras de suelo y agua,
tanto para bacterias aerobias como anaerobias.

Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la
lactosa a 44º C en vez de 37 ºC como lo hacen los totales.

Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están formados por
Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran
casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan
mejor la presencia de contaminación fecal. Éstos últimos se denominan termotolerantes por
su capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta es la característica que diferencia a
Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del
intestino de los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones
adecuadas de materia orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado
como indicador ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta como una indicación
de que los organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el
alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades.
MARCO TEORICO

Coliformes: Son un grupo de Géneros Bacterianos que tienen ciertas características

bioquímicas en común: 1. Ser aerobias o anaerobias facultativas; 2. Bacilos gran negativos; 3.
No ser esporógenas; 4. Fermentar la glucosa a 35ºC en 48 horas, produciendo ácido láctico y
gas. Adicionalmente tienen importancia relevante como indicadores de contaminación del
agua y los alimentos. Se encuentran comúnmente en las plantas, el suelo, los animales y los
humanos. La presencia de bacterias Coliformes en el suministro de agua es un indicio de que el
suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos en
descomposición.

Coliformes fecales: Son Coliformes totales de origen intestinal que como característica
diferencial fermentan la lactosa a 44,5 – 45,5ºC, Desde el punto de vista de la salud pública
esta diferenciación es importante puesto que permite asegurar con alto grado de certeza que
la contaminación que presenta el agua es de origen fecal.

Escherichia coli (E. coli): Bacteria cuyo hábitat natural son los intestinos de la mayor parte de
los mamíferos sanos. Es el principal organismo anaerobio facultativo del sistema digestivo. El
aislamiento de esta bacteria en el agua da alto grado de certeza de contaminación de origen
fecal, alrededor del 99%.

Colilert: Tecnología de Sustrato Definido que detecta simultáneamente Coliformes Totales y E.

coli en agua para Consumo Humano, Agua Potable Tratada Envasada, Aguas de Estanques de
Piscina y estructuras similares. . Dos nutrientes indicadores, ONPG y MUG, son las principales
fuentes de carbono en Colilert y pueden ser metabolizados por la enzima coliforme β-
galactosidasa para metabolizar ONPG y cambiarla de incolora a color amarillo. y E. coli usa la β-
glucuronidasa para metabolizar MUG y crear fluorescencia.

NMP: El método del Número más probable (NMP) (Most probable number - MPN - en inglés),
también conocido como el método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos
cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia
positiva/negativa.

Fundamento Sustrato Definido- Coliler Colilert

Es un sistema de reactivos diseñado para un diagnóstico de Coliformes totales y E.coli en

aguas. En su formulación solo se encuentran presente dos únicas fuentes de carbono ONPG y
MUG, lo que permite que solo los microorganismos enzimáticamente equipados para hacer el
metabolismo de estos azucares, tengan oportunidad de desarrollarse y entonces evidenciar
una señal positiva. Si bien es cierto que las enzimas B-D Galactosidasa y B-D Glucoronidasa, se
encuentran presentes en la mayoría de las bacterias Coliformes y E coli, respectivamente, es
importante aclarar que estas dos enzimas necesitan ser INDUCIDAS, esta inducción es
netamente restrictiva (necesita la ABSOLUTA restricción de otras fuentes de carbono, para su
expresión de forma adecuada) Cuando los coliformes crecen en Colilert, utilizan ß-
galactosidasa para metabolizar la nutriente indicador ONPG y el cambio de incoloro a amarillo.
 E. coli utilizan ß-glucuronidasa para

metabolizar el MUG y
crear fluorescencia.

Fundamento - Quanti-Tray

El sistema utiliza el mismo modelo de distribución estadística de Poisson en que se basa la

fermentación en tubos múltiples, pero utiliza muchas más submuestras (es decir, tubos) y
realiza el trabajo automáticamente. El sellador Quanti-Tray distribuye automáticamente la
mezcla de muestra y reactivo en pocillos discretos. Este proceso elimina el pipeteado manual
de los métodos tradicionales. El diseño con dos tamaños de pocillos Quanti-Tray/2000
aprovecha el mismo modelo de probabilidad usado por el procedimiento de dilución en serie
de números más probables. Los pocillos de mayor tamaño funcionan como submuestras no
diluidas; los pocillos pequeños como submuestras diluidas. Sin embargo, no se requiere un
diluyente. Los 97 pocillos de Quanti-Tray/2000 dan lugar a márgenes muy amplios de conteos
(1 a 2.419) y a límites de confianza del 95% muy precisos.

MATERIALES

Equipos

• Cabina de Flujo Laminar

• Equipo Sellador Quanty Sealer-Sellador Modelo 2x
• Incubadora a 35°C+/- 2 °C
• Lámpara de Luz Ultravioleta 365 nm
Reactivos
• Agua estéril
• Reactivo Colilert
• Bolsas Quanti tray 2000
Otros
• Frascos schott estériles 100ml y 1000ml
• Asas Bacteriológicas
• Marcador
• Guantes
• Tapa bocas
• Bata

• Cofia

PROCEDIMIENTO

Condiciones generales

 Realizar procesos de limpieza y desinfección del laboratorio Microbiológico de Aguas y

Alimentos.
 Realizar procesos de limpieza y desinfección de Equipos: la cabina de flujo laminar,
Incubadora y Quanty Sealer-Sellador Modelo 2x ü Esterilización de Frascos
 Consultar las fichas de seguridad de los reactivos químicos a emplear para la
realización del análisis.
 El material debe desecharse de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio.
 Verificar la identificación y numeración de las muestras que ingresan con cada Acta de
toma de Muestra.
 Realizar el registro de la muestra que ingresa en el Libro
Resultados Microbiológicos de Aguas y
Alimentos.

Descripción del Método

Detección de Coliformes Totales y Escherichia coli por la Técnica de

Sustrato Definido - Colilert* NMP.

 Mezclar la muestra de agua por 15 a 20 segundos con

movimientos rotación.
 Servir en el frasco estéril de 100ml de la muestra en Cabina.
 Adicionar el contenido del vial de Colilert en su totalidad del sobre los 100ml de agua
(muestra).

 Tapar y agitar el recipiente, asegurarse de que el reactivo se disuelva completamente.

 Mezclar por 15 a 20 segundos, dejar en reposo, mezclar nuevamente y verificar la
completa disolución del reactivo
 Transferir del contenido del frasco (agua a analizar + reactivo) a una Bolsa Quati Tray.
 Tomar la bolsa Quanty tray colocarla en el porta bandeja del sellador Quanti tray y
pasarla a traves del sellador con los pozos hacia abajo con la bandeja de soporte de
abajo hacia arriba.

 Llevar la Bandeja de incubación a 35°C ±

2ªC por 24 horas.

Coliformes Totales:

Realizar la lectura de Coliformes Totales contando el número de pozos grandes y pequeños

que presentan color amarillo pasar el dato a la tabla de NMP Anexo 1 interpolar los 2
numeros (pozos grandes versus pozos pequeños) y obtener el numero coincidente a estos
que indica el número de micoorganismos en 100ml .

Reportar: Coliforfes Totales = X microorganismos en 100 ml (X = Numero hallado en la

Tabla)

Escherichia coli

Realizar la lectura de Escherichia coli contando el

número de pozos grandes y pequeños que presentan color
Amarillo y Fluorescencia al exponer la Bandeja a la luz UV de
365nm en la cabina para lectura de UV pasar el dato a la
tabla de NMP (Anexo 1) interpolar los 2 numeros (pozos grandes versus pozos pequeños) y
obtener el numero coincidente a estos que indica el numero de micoorganismos en 100ml
Reportar: E. coli = X microorganismso en 100 ml:

(X = Numero hallado en la Tabla)

Los resultados son definidos de 24-48 horas. Además Para Coliformes y E.coli observado
antes de las 24 horas y Negativos observados después de 28 horas.

 Interpolar los dos numeros ( Pozos grandes vs Pozos pequeños ) en la tabla de NMP y
hallar el numero conicidente a estos que equivale al numero de microoganismos en
100 ml
 Reportar asi Escherichia coli = X microorganismso en 100 ml (X = Numero hallado en la
Tabla)
 Si la totalidad de los Pozos Grandes y pequeños se presentan sin fluorescencia indica la
no presencia de Escherichia coli en la muestra y se reportara Escherichia coli = 0
microorganismso en 100 ml

BIBLIOGRAFIA
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 http://www.ubu.es/investig/aulavirtual/trabajos_05/Analisis_microbiologico_del_agu
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 FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo en Microbiología:
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 FUENTES, A. F. y otros (2005). Calidad Sanitaria de Alimentos Disponibles al Público de
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 MICROBIOLOGIA APLICADA: Manual de Laboratorio (2006) Coliformes totales y Fecales
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http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf