INSTITUTO TECNOLOGICO DEESTUDIOS SUPERIORES DE ZAMORA

Gobierno del Estado de Michoacn

INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

Microbiologa de alimentos
Prctica n. 3- Recuento de mohos y levaduras y psicotroficos

RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS OBJETIVO.Realizar el recuento de mohos y levaduras y psicotroficos presentes en un alimento mediante el mtodo cuenta en placa.

INTRODUCCIN.Los mohos son hongos multicelulares que forman estructuras ramificadas extensas, coloreadas o no, conocida en la industria alimenticia con el nombre de micelios. Los mohos son considerados como organismos que alteran los alimentos, la alteracin se pone de manifiesto con su crecimiento caracterstico, aunque a veces los degradan antes de crecer de forma visible, algunos elaboran micotoxinas, que son sustancias txicas perjudiciales para la salud sobre en aquellos alimentos de pH bajo, frutas, jugos, yogurt, etc., o los de presin atmosfrica elevada, harinas, copos de avenas, miel, leche concentrada y productos salados. Por ser los mohos agentes contaminantes de productos cidos y de baja actividad de agua, productores a veces de micotoxinas, su presencia en los alimentos deben alentar sobre la posibilidad de presencia de micotoxinas en los mismos. Las levaduras son hongos unicelulares de forma esfrica, alargada, ovoide, piriforme y a veces en forma de micelios. Su tamao supera al de las bacterias. Al igual que los mohos, pueden producir alteraciones de los productos alimenticios, sobre todo en aquellos con pH bajo y presin atmosfrica elevada. Recuento total de mohos y levaduras Se entiende por recuento total de mohos y levaduras revivificables, el nmero de colonias que se desarrollan a partir de 1 gramo o mililitro de alimento, sobre un medio de Agar Papa dextrosa durante 5 das a 22-25C.

MATERIAL 8 Placas de Petri estriles 5 pipeta de 10 mL 5 pipetas de 1 mL Asa de siembra Estufa de cultivo Contador de colonias 8 Tubos de dilucin Mechero bunsen 2 Matraces aforados de 1 L Vaso de pp de 100 mL Medio de cultivo Agar papa dextrosa Preparacin del medio de cultivo

REACTIVOS -Fosfato de potasio monobsico - cido tartrico

Seguir las instrucciones del fabricante para la preparacin del medio de cultivo y despus de esterilizar, enfriar en bao de agua a 45 1C, acidificar a un pH de 3.5 0.1 con cido tartrico estril al 10% (10 g aforar a 100 mL de agua destilada) y agregar aproximadamente 1.4 mL de cido tartrico por 100 mL de medio. Despus de adicionar la solucin, mezclar y medir el pH con potencimetro. Dejar solidificar una porcin del medio. Al fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar despus de agregar el cido tartrico. Solucin reguladora de fosfatos Disolver 34 g de fosfato de potasio monobsico en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2 con NaOH 1N, aforar a 1 L de agua destilada. (Solucin concentrada) Tomar 1.25 mL de la solucin concentrada y llevar a 1 L con agua destilada (Solucin de trabajo). Distribuir en tubos de dilucin (90 y 9 mL segn se requiera). Esterilizar a 121C durante 15 min.

Preparacin de la muestra La preparacin de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994. Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Procedimiento Colocar cajas Petri 1 ml de la muestra lquida directa o de la dilucin primaria, utilizando para tal propsito una pipeta estril. Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estril diferente para cada dilucin. Verter de 15 a 20 ml de agar papa dextrosa acidificado, fundido y mantenido a 45 1 C en un bao de agua. El tiempo transcurrido entre la preparacin de la dilucin primaria y el momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrs para adelante, sobre una superficie lisa. Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fra. Preparar una caja control con 15 ml de medio y una caja para medio ambiente, para verificar la esterilidad. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 1C. Despus de 5 das, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difcil contar colonias bien aisladas, considerar los conteos de 4 das de incubacin y an de 3 das. En este caso, informar el periodo de incubacin de 3 o 4 das en los resultados del anlisis. Si es necesario, cuando la morfologa colonial no sea suficiente, examinar microscpicamente para distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias. Preparacin de diluciones decimales.

RESULTADOS.La muestra fue tomada de la cafetera Caf Marta que se encuentra en afuera del ITESZ. Resultados utilizando cuenta en placa en inmersin para mohos. Prueba 10-1 30 Mohos 10-2 400 DILUCIONES 10-3 10-4 UFC/g o mL 10-5 10-6 1,000,000 1,000,000

Resultados utilizando cuenta en placa en inmersin para Levaduras. Prueba 10-1 Levaduras 50 10-2 400 DILUCIONES 10-3 10-4 UFC/g o mL 10-5 10-6 400

Mohos en agar papa dextrosa acidificado, incubadas por 5 das. a 20 +-2 C: 1,000,000 UFC / g ( / mL) de muestra.

Levaduras en agar papa dextrosa acidificado, incubadas por 5 das. a 20 +2 C: 400 UFC / g ( / mL) de muestra.

Normas Oficiales Mexicanas NOM-111-SSA1-1994 Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. La (NOM-093-SSAI-1994) establece para salsas y aderezos el mximo permitido para mohos es de 20 UFC/ml y para levaduras 50 UFC/ml OBSERVACIONES: El testigo abierto resulto contaminado con mohos y levaduras. Esto se debe en parte a todos los microorganismos que hay en el ambiente.

En cuanto al testigo cerrado no hubo contaminacin esto quiere decir que trabajamos adecuadamente.

Observamos que hubo crecimiento de mohos y levaduras en las diluciones 10-1 y 10-2 . En las diluciones 10-3, 10-4 y 10-5 pudimos observar que no hubo crecimiento. En la dilucin 10-6 observamos crecimiento de mohos.

Las muestras tomadas de salsa estaban muy contaminadas, ya que en algunas cajas petri no se logro contar debido a la gran presencia de levaduras y mohos. Nuestros testigos cerrados no fueron contaminados, ya que en estos no hubo presencia de factores que intervinieran ya que nuestra zona estaba muy esterilizada. Las levaduras eran de color amarillo y blancas. Los mohos no eran uniformes y eran demasiado fibrosos. Conclusin La identificacin de levaduras y mohos en alimentos tiene un inters desde el punto de vista esttico, pero a nivel de salud pblica no representa inters alguno ya que conforman menos del 25 % de las especies identificadas y de stas, un nmero muy bajo son de forma daina. Por otro lado es de gran de inters la determinacin de bacterias entre ellas Clostridium ssp. Ya que est relacionada con diferentes sndromes que afectan a nivel gastrointestinal llegando a comprometer la vida de los consumidores. Por tal razn ha sido de gran importancia la realizacin de este informe que nos ha dado a conocer la importancia de la determinacin de microorganismos en alimentos y el mtodo para poder evaluar y cuantificarla presencia de estos, aprendiendo a su vez los parmetros microbiolgicos permisibles para cada alimento Se consideraron las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para este informe. Se multiplico por el inverso de la dilucin, tomando en consideracin los criterios de la NOM-092-SSA1-1994 lo cual nos arroj 1000000 UFC/ mL de mohos y 400 UFC/mL de levaduras.

CUENTA EN PLACAS DE BACTERIAS PSICOTROFICOS OBJETIVO.Realizar adecuadamente la tcnica de cuenta en placa para diversos grupos microbianos de importancia en alimentos. Interpretar adecuadamente los resultados de la cuenta en placa y sus implicaciones en la calidad del alimento. INTRODUCCIN.Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta tcnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxgeno, permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias mesoflicas aerobias, o mesfilos aerobios son un indicador general de la poblacin que pueden estar presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el producto. Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero para algunos productos, tambin es importante determinar la presencia de bacterias termoflicas, psicroflicas y/o psicrotrficas para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. La tcnica bsica es la misma, pero cambian las condiciones de incubacin, medios de cultivo y algunos otros detalles, que se mencionan en la tcnica. Si se modifican las condiciones de incubacin o se somete la muestra a algn tratamiento previo, el mtodo puede aplicarse tambin a la deteccin de otros grupos como anaerobios o

esporulados, desde luego, con la adecuada seleccin de medios de cultivo. La tcnica se basa en contar las unidades formadoras de colonias o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de eleccin despus de un cierto tiempo de incubacin a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo. El medio de cultivo no debe fundirse ms de una vez, y debe mantenerse en bao de agua regulado a 45 C, durante el tiempo suficiente para que alcance esta temperatura, y hasta su utilizacin. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente, hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. MATERIAL 8 Placas de Petri estriles 1 pipeta de 10 mL 3 pipetas de 1 mL Asa de siembra Estufa de cultivo Contador de colonias 6 Tubos de dilucin Mechero bunsen 2 Matraces aforados de 1 L Medio de cultivo Agar tripotna-glucosa-extracto de levadura (agar cuenta estndar) PROCEDIMIENTO REACTIVOS -Fosfato de sodio monobsico

1) Se pesa 34 g de fosfato de sodio monobsico y se afora a 1 L de agua destilada. Despus de esta solucin, se toma una muestra de 1.25mL y se afora a 1 L y esta ser mi solucin de trabajo. Se utiliza como diluyente y para enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos. 2) Distribuir la solucin de trabajo, colocando en un frasco 90 mL y en tubos de cultivo se agrega 9 mL para preparar las 6 diluciones decimales correspondientes (10-1 10-6). Esterilizar a 15 PSI durante 15 min. 3) Se coloca 10 mL de muestra en 90 mL de solucin de trabajo y despus realizar las diluciones. 4) Con una pipeta perpendicular a la caja Petri poner 1 mL de cada una de las diluciones. Poner aproximadamente 15 mL de agar fro y templado a 45C. Mezclar perfectamente medio e inculo sobre la mesa de trabajo haciendo movimientos circulares con la placa, a favor y en contra de las agujas del reloj, y en forma de cruz, evitando al mismo tiempo que el medio se impregne la tapa. Dejar solidificar el agar de las placas sobre una superficie horizontal. 5) Cuando se ha solidificado perfectamente el agar, incubar. 6) Realizar el conteo de colonias. Tcnica de vertido en placa. 1.- Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin y la adicin de medio de cultivo se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular. 2.- Inocular por duplicado, 1 mL de la dilucin correspondiente en cada caja, mediante pipeta estril. Agregar de 18 a 20 mL del medio fundido y mantenido a 45 C. 3.- El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. 4.- Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. 5.- Incubar las cajas en posicin invertida durante el tiempo y a la temperatura que se requiera, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate. Tcnica de extensin superficial en placa.

1.- Distribuir las cajas con el medio estril en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin se pueda realizar cmoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular. 2.- Inocular por duplicado, 0.1 mL de la dilucin correspondiente en cada caja, mediante pipeta estril. Para distribuir de manera homognea, extender el inculo utilizando una varilla de vidrio estril (en forma de escuadra o L) haciendo movimientos giratorios de manera perpendicular al medio de cultivo, hasta lograr la completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el inculo se absorba antes de incubar (se recomienda un tiempo de espera aproximado de 10 minutos). El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se inocula en el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. 3.- Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. 4.- Incubar las cajas en posicin invertida durante el tiempo y a la temperatura que se requiera, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, como se indica a continuacin. Condiciones de incubacin para cuenta en placa de diferentes grupos Bacteriano ( Temperatura y Tiempo de Incubacin) Termfilos 55 2C 48 2 h Psicrotrficos 20 2C de 3 a 5 das Psicroflicos 5 2C de 7 a 10 das RESULTADOS: La muestra fue tomada de la cafetera Caf Marta que se encuentra en afuera del ITESZ. Resultados utilizando cuenta en placa en tcnica vertido en placa para Psicrotrficos. Prueba 10-1 Psicotroficos 10-2 DILUCIONES 10-3 10-4 10,000 50,000 UFC/g o mL 10-5 100,000 10-6 100,000

Psicrotrficos en agar cuenta estndar, incubadas por 5 das. a 20 +-2 C: 100,000 UFC / g ( / mL) de muestra. Normas Oficiales Mexicanas Cuenta total de Psicrfilos aerobios (UFC/g) a 51 C por 7-10 das * NOM092-SSA1-1994 Para la E. Coli en salsas se permiten 0 UFC/g *Consideramos a E. Coli como un microorganismo Psicrofilo ya que puede crecer por debajo de los 20 0C.

Observaciones: El testigo abierto resulto muy contaminada ya que el rea donde se realiz el inoculo no estaba completamente estril debido a las corrientes de aire que causaban las personas al estar caminando por el laboratorio.

En la dilucin 10-6 microorganismos. Al momento de inocular no debamos mover mucho las cajas ya que el inoculo poda alojarse en las paredes de la caja y al agruparse es muy difcil contar las colonias. Debido a que la muestra era liquida no fue necesario filtrarla.

Las diluciones 10-1 y 10-2 resultaron muy contaminadas por lo cual no pudimos contar. pudimos observar que no hubo crecimiento de

CONCLUSIONES En consideracin de la NOM-092-SSA1-1994 se realiz la cuenta en placas de bacterias la cual nos arroj como resultado final despus de ya hechas las operaciones para determinar UFC el cual fue de 100 UFC/mL ya que trabajamos con muestra liquida observando solo crecimiento de colonias en las placas 10-1, 10-2, 10-3 por tanto se determinaron ese valor de UFC.