Variantes de PCR

PCR real time Es una técnica que combina la

amplificación y la detección en un
mismo paso, al correlacionar el
producto de la PCR de cada uno de los
ciclos con una señal de intensidad de
fluorescencia.

Características
• Alta especificidad
• Amplio rango de detección y rapidez en la
visualización del producto ya que no es necesario
realizar una electroforesis posterior.
• Los ensayos de la PCR en tiempo real son entre
10,000 y 100,000 veces más sensibles y pueden
detectar diferencias de una sola copia del ADN.
• Además, se ha reportado que para la PCR
convencional (punto final), la cantidad final de
producto amplificado puede verse afectada por
inhibidores, saturación de la reacción o bien por
falta de una estandarización adecuada.|
Variantes de PCR
PCR real time DETECCIÓN POR
FLUORESCENCIA
Los termocicladores para llevar a cabo la
PCR a tiempo real incorporan un lector de
fluorescencia y están diseñados para poder
medir, en cualquier momento, la
fluorescencia emitida en cada uno de los Agentes sondas
viales donde se realice la amplificación. intercalantes específicas
marcadas

Sondas de Molecular Sondas

hidrólisis beacons FRET
Variantes de PCR

PCR real time

DETECCIÓN POR
FLUORESCENCIA
Agentes intercalantes

El más empleado en
PCR a tiempo real es el
SYBR Green I. El
Son fluorocromos que incremento de ADN en
aumentan notablemente cada ciclo se refleja en
la emisión de un aumento proporcional
fluorescencia cuando se de la fluorescencia
unen a ADN de doble emitida.
hélice.
Variantes de PCR

PCR real time

Son sondas marcadas con dos tipos de
DETECCIÓN POR fluorocromos, un donador y un aceptor. El
FLUORESCENCIA proceso se basa en la transferencia de energía
Sondas de hibridación específicas fluorescente mediante resonancia (FRET)entre
las dos moléculas

Sondas de hidrólisis

Son oligonucleótidos
marcados con un
fluorocromo donador en
el extremo 5’ que emite
fluorescencia al ser
excitado y un aceptor en
el extremo 3’ que absorbe
la fluorescencia liberada
por el donador.
Variantes de PCR

PCR real time

DETECCIÓN POR
FLUORESCENCIA Molecular beacons
Sondas de hibridación específicas

Tienen una molécula donadora en el

extremo 5’ y una aceptora en el
extremo 3’ pero, además, presentan
una estructura secundaria en forma de
asa, en la que reside la secuencia de
unión específica con el ADN diana.

Los extremos permanecen plegados

cuando la sonda no está hibridada, lo
que conlleva que donador y aceptor
estén muy cerca uno de otro.
Variantes de PCR

PCR real time

El sistema se compone de dos sondas
DETECCIÓN POR que se unen a secuencias adyacentes del
FLUORESCENCIA ADN diana. Una de las sondas lleva un
Sondas FRET. donador en el extremo 3’ y la otra un
aceptor en el extremo 5’.

Estrategias de cuantificación:
• Cuantificación Absoluta: Determina el
número exacto de moléculas de ADN
(qPCR) ó ARN (qRT-PCR) presentes en
una muestra determinada.
• Cuantificación Relativa: No es necesario
saber la cantidad precisa de la secuencia
de interés, para poder hacer su
cuantificación.
Variantes de PCR
RT-PCR
Amplificación de RNAa través de la
síntesis previa de su cDNA, que
después se amplifica por PCR.

La transcriptasa inversa también tiene una función

RNasa H, que degrada la porción de RNA del
híbrido.
Variantes de PCR

Estos marcadores se basan en la

RFLP- PCR identificación de diferencias en el tamaño
“El polimorfismo de largo de fragmento de fragmentos generados mediante
restricción con endonucleasas
de restricción”
Visualización del polimorfismo

Extracción del DNA

Digestión del DNA extraído

Separación mediante electroforesis

Transferencia

Hibridación

Detección
 La secuenciación de ADN es el proceso que determina la
secuencia de bases de los nucleótidos (As, Ts, Cs y Gs) de un
fragmento de ADN.

Secuencia SANGER En la secuenciación de Sanger,

el ADN blanco es copiado
muchas veces y se hacen
fragmentos de diferentes
longitudes. Nucleótidos
fluorescentes que actúan como
"terminadores de cadena" marcan
los extremos de los fragmentos y
permiten la determinación de la
secuencia.
 Elementos
Secuencia SANGER
• Una enzima ADN polimerasa
• Un cebador, que es un fragmento pequeño de
ADN monocatenario que se une al molde de ADN
y actúa como un "iniciador" de la polimerasa.
• Los cuatro nucleótidos del ADN (dATP, dTTP,
dCTP, dGTP).
• El molde de ADN que será secuenciado.

Sin embargo, una reacción de secuenciación de

Sanger también contiene un ingrediente único:
• Versiones didesoxi, o terminadores de la
cadena, de los cuatro nucleótidos (ddATP, ddTTP,
ddCTP, ddGTP), cada uno marcado con pigmentos
de color diferente.
Secuencia SANGER Método de secuenciación de
Sanger
Secuencia SANGER Método de secuenciación de
Sanger
Aplicaciones
Clonación acelular de fragmentos de DNA
Detección de secuencias sin purificación previa
Preparación de muestras para secuenciación de ácidos nucleicos
Establecimiento de polimorfismos de secuencia
Rastreo de mutaciones
Tipificación de DNA para trasplantes
Diagnóstico de enfermedades genéticas (incluido el diagnóstico prenatal)
Determinación de secuencias específicas de DNA relacionadas con situaciones patológicas definidas
Resolución de problemas forenses o arqueológicos,
Estudios evolutivos
Detección de microorganismos infecciosos
Detección de células tumorales
Amplificación de DNA para su posterior clonación celular
Técnica PCR-
RFLP para el
diagnóstico de
dos
mutaciones en
el gen VHL

Técnica PCR-RFLP para el diagnóstico de
dos mutaciones en el gen VHL
¿Qué se realizo?
Análisis directo (PCR-RFLP) de las
mutaciones c.362A>G (p.Asp121Gly) y
c.481C>T(p.Arg161ter) del gen VHL.
ESTUDIO
Se estudiaron pacientes con diagnóstico
clínico de enfermedad de Von Hippel-Lindau
y familiares en riesgo atendidos en la
consulta de genética clínica del Hospital
Hermanos Ameijeiras.
Este es un gen supresor tumoral
localizado en el brazo corto del
cromosoma 3(3p25-26) que
codifica una proteína ubiquitina
ligasa involucrada en la respuesta
celular a la hipoxia
FINALIDAD
Para determinar la existencia de
endonucleasascuyos sitios de
restricción resultaran
afectadospor la presencia de las
mutaciones c.362A>G yc.481C>T
 Técnica PCR-RFLP para el diagnóstico de
dos mutaciones en el gen VHL
• EL ADN se aisló mediante el método de precipitación salina
• Cuantificación por espectrofotometría
• Para la amplificación del ADN se emplearon los cebadores: 5’-AGCCACCGGTGTGGCTCTTTA-3’ y 5’-
ACATCAGGCAAAAATTGAGAACTGG-3’ para el exón 2, y 5’CCTTGTACTGAGACCCTAGTCTGTCACT-3’ y
5’-CAAGACTCATCAGTACCATCAAAAGCTG-3’ para el exón 3 del gen VHL

se llevaron a cabo en volúmenes de 25

µL que contenían 0,4µM de cada
Metodología Mediante el análisis
bioinformático de la secuencia de
REACCIONES

cebador • PCR
los exones 2 y 3 del gen VHL se
0,1 mM de dNTPs • DIGESTION
determinó que la mutación
ENZIMATICA c.362A>G elimina el sitio de
2,5 U deTaq ADN Polimerasa • ELECTROFORESIS
restricción de la enzima SfaN I en
• COMPARACIÒN
el segundo exón del gen. Así
1x de solución tampón dela polimerasa mismo, la mutaciónc.481C>T
elimina el sitio de restricción de la
1,5 mM de MgCl2 y de 50 a 100 ngde enzima BtgZ I en el tercer exón del
ADN genómico. gen VHL
 10 la
11 tenían la
RESULTADOS mutación
c.362A>G
mutaciónciòn
481C>T en el
gen VHL.

Los casos De la misma manera la

diagnosticados con la digestión con la
mutación c.362A>G se endonucleasa BtgZ I del
producto de PCR del exón 3,
obtenía un fragmento no producía un fragmento no
digerido de 266 pares de digerido de292 pares de
bases correspondiente bases en todos los casos
con el alelo mutado. con la mutación c.481C>T
 TECNICAS

PCRs para la amplificación de un

solo sitio conocido del genoma
(locus).

Estos PCRs requieren conocer

la secuencia que se trabaja ,en
cuyo caso se utilizan
oligonucleótidos diseñados a
partir de la secuencia de ese
gen y se obtiene un solo
fragmento de un tamaño ya
conocido.
 TECNICAS
PCRs en los que no es necesario
conocer la región que se está
amplificando.

Se amplifican regiones no
conocidas, como zonas
hipervariables del genoma,
por lo cual no se sabe el
tamaño del fragmento (o
fragmentos) que se esperan.