PCR en Tiempo Real

Repasemos…

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Técnica que permite copiar o replicar millones de veces

pequeñas cantidades de ADN in vitro.

MUY SENSIBLE
Y
MUY ESPECÍFICA
 PCR
PCR

Molécula de ADN polimerasa

ADN (molde) termoestable

Cebador sentido Cebador Antisentido

dNTPs (A;G;T;C) Cofactor Mg2+

 PCR
Tres pasos básicos

Desnaturalización

Primers
complementarios

Apareamiento

Elongación
PCR
 PCR

Verificación del producto de PCR

en gel de agarosa

Marcador de tamaño molecular Productos de PCR

¿La PCR puede ser cuantitativa?
 PCR en Tiempo Real
 En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación
y detección se producen de manera simultánea en el
mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción
posterior.

 Además, mediante detección por fluorescencia se

puede medir durante la amplificación la cantidad de
ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisión
de fluorescencia producida en la reacción es
proporcional a la cantidad de ADN formado.
 Northern Blot PCR tradicional PCR en tiempo real

• Semi-
• Cuantitativa
• Gold Standard cuantitativa
• Requiere
• No requieren • Requiere
amplificación
amplificación amplificación
• Pequeñas
• Grandes • Pequeñas
cantidades de
cantidades de cantidades de
ARN
ARN ARN
• Sensible
• Radioactividad • Sensible
PCR enPCR en tiempoReal:
Tiempo real: PasosPasos

Aislamiento y Caracterización ARN

Síntesis de cDNA

Adquisición datos de Real Time PCR

Generación de factores de normalización

Datos normalizados

Análisis de Datos
 PCR Tiempo
PCR en en tiempo real
Real
Aislamiento y Caracterización del ARN

Extracción de
ARN

28 S
18 S

5S

28 S
18 S

5S
Muestra
 PCR en
PCR Tiempo Real
en tiempo real

mRNA cDNA
Retrovirus

Transcriptasa Reversa hace el cDNA complementario del RNA

 PCR en
PCR Tiempo Real
en tiempo real

Transcripción Reversa (RT-PCR)

OligodT se
une al mARN

mRNA cDNA

Copia de la primera
hebra de cDNA

Digestión y
desplazamiento
del mARN

Copia de la segunda
hebra de cDNA
 PCR en Tiempo Real
DETECCIÓN: AGENTES
INTERCALANTES O SONDAS

Molécula de ADN polimerasa

ADN (molde) termoestable

Cebador sentido Cebador Antisentido

dNTPs (A;G;T;C) Cofactor Mg2+

 PCR en tiempo real
Métodos de Detección

• Agentes intercalantes

• Sondas de Hibridación
 PCR en tiempo real
Colorantes de unión al ADN: SYBR GREEN

• Unión al surco menor del ADN doble cadena.

• Emite fluorescencia cuando está unido al ADN doble

cadena (dsADN).

• La intensidad de fluorescencia aumenta

proporcionalmente a la concentración de dsADN.
 PCR en tiempo real
Colorantes de unión al ADN: SYBR GREEN

• No se unen de manera secuencia-específica, pueden generar falsos positivos.

• Se puede usar un colorante para evaluar varios genes.

• No se puede usar para reacciones en multiplex.

• Los diferentes productos de PCR se reflejan en la temperatura de melting (Tm).

 PCR en tiempo real
Sondas de Hibridación

• Se necesitan 2 primers y dos sondas específicas de secuencia.

• Las sondas se unen en un arreglo cabeza con cola.

• La primera sonda (upstream) está marcada con un fluoróforo

donante (D) en el extremo 3´. La segunda sonda (downstream) está
marcada con un fluoróforo aceptor (A) en el extremo 5´.

Fluoróforo Donante Fluoróforo Aceptor

 PCR en tiempo real
Sondas de Hibridación

• Cuando se unen, los fluoróforos experimentan una

transferencia de energía (FRET) del fluoróforo
donante al aceptor con aumento de fluorescencia.
 PCR en tiempo real
Sondas de Hidrólisis: Sondas Taq Man

• La sonda se hibrida con el amplicón blanco.

• Se encuentra bloqueada en el extremo

3´(fosforilada, no puede ser amplificado por la
polimerasa).

• Tiene dos colorantes fluorescentes unidos

(R= reportero y Q= quencher).

• El Q reduce la intensidad de fluorescencia

del reportero cuando la sonda está intacta.
 PCR en tiempo real
Sondas de Hidrólisis: Sondas Taq Man

• Método consiste de 2 primers y dos

sonas específicas de secuencia. Desnaturalización

Pegado de primers y sondas

Extensión por la ADN Polimerasa

• Sirve para evaluar múltiples genes con

distintos colorantes (multiplex). Extensión por la ADN Polimerasa y clivaje del Reportero

Fluorescencia
 PCR en tiempo real
Molecular Beacons

• Es una sonda en horquilla.

• Tiene una región específica de secuencia

flanqueada por dos repeticiones invertidas.

• Los fluoróforos reportero y quencher están

unidos a los extremos, reduciendo la
fluorescencia cuando está libre en solución.

• Cuando se unen a la secuencia, el Q y el R se

separan, permitiendo la emisióm del R.
 PCR en tiempo real
Molecular Beacons
• Tienen mayor sensibilidad que las sondas lineares.

• Aplicación: Discriminación de alelos con fluoróforos distintos.

PCR en Tiempo Real
 PCR en Tiempo Real
• El sistema de real time PCR se basa en la detección y cuantificación de
un reportero fluorescente.
• Puede monitorearse la reacción de PCR en la fase exponencial.

• Se utilizan aparatos, placas y programas especiales para llevar a cabo

la reacción y análisis de datos.
 PCR en Tiempo Real
• Las reacciones se caracterizan por el punto en el
tiempo (ciclo de PCR) donde la amplificación es
detectada por primera vez: Ct o Cp.
• El Ct es el tiempo al cual la intensidad de fluorescencia
es mayor que la fluorescencia de fondo (umbral de
detección = threshold).

Fase Plateau

Fase Exponencial
 PCR en Tiempo Real
• Cuanto mayor cantidad de ADN inicial, habrá un
aumento más rápido de la señal fluorescente, resultando
en un Ct más bajo.
 PCR en Tiempo Real
Cuantificación Absoluta
• Se determina la concentración de las muestras.
• Se necesita un estándar (ARN, ADN o cADN) cuya concentración se
conozca con total exactitud.
• Se realiza una curva de diluciones con las concentraciones conocidas
del estándar.
• Se intrapola el valor de Ct obtenido para conocer la concentración de
ADN inicial de la muestra.
• Se utiliza para determinar la carga viral de una muestra.
 PCR en Tiempo Real
Cuantificación Relativa
• Se necesita un control interno o calibrador (housekeeping gene).
•Se determina cambios en el nivel de expresión de las muestras
basados en una muestra de referencia o estándar.
•Se utiliza para comparar los niveles de expresión de un
determinado gen en muestras diferentes (por ejemplo tratadas o
no).
PCR tradicional vs. PCR en tiempo real
 PCR en tiempo real
Beneficios
• No requiere manipulación post-amplificación.
• Método muy sensible.
• Puede detectar una simple copia de un transcripto específico.
• Puede detectar diferencias de expresión menores al 23%.
• Requiere menos cantidad de RNA.
Desventajas

• Requiere equipamiento y reactivos muy costosos.

• Debido a su alta sensibilidad, se necesita un correcto diseño

experimental y técnicas de normalización para obtener
conclusiones precisas.
 PCRPCR
enentiempo
tiempo realreal

Aplicaciones en Investigación

DNA:
• Identificación de genes de virulencia o de resistencia a drogas.
• Genotipificación de cepas o subespecies
• Detección de mutaciones puntuales
• Estudio de de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs)
• Cuantificación del número de copias por célula, o determinación de células
iniciales en una muestra.
RNA:
• Detección de la expresión de genes
• Efecto de mutaciones sobre la expresión
• Análisis de mRNAs variantes producidos por procesamiento diferencial
• Cuantificación de la expresión
 PCR en tiempo real
PCR en tiempo real
Aplicaciones en Diagnóstico Clínico

 Detección /Cuantificación / Genotipificación de patógenos:

 Virales (carga viral, carga pro-viral)
 Bacterianos
 Protozoarios
 Hongos

 Diagnóstico temprano (pacientes asintomáticos)

 Detección de genes de resistencia – mejor elección de terapia

 Monitoreo de terapia (enfermedad residual - recaída)

 Detección de marcadores tumorales

 Estado del desarrollo / progresión de la enfermedad