PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real es una variante de la

PCR donde que se emplea para la
cuantificacin de muestras de ADN
En esta tcnica se usan sondas que son
oligonucletidos que presentan fluorocromos
en ambos extremos y tienen una secuencia
complementaria a parte del fragmento de
ADN que se quiere amplificar.

Que es PCR
La PCR (polimerase chain reaction) es una tcnica con la que se
pueden producir varias copias de un fragmento de ADN
especifico millones de estas incluso en la presencia de otras
clulas,los nicos requerimientos es que este la materia prima
para fabricar el ADN y una pequea cadena de ADN que se
pueda unir a la cadena que vamos a copiar la cual se llama
primer o cebadora.
Es una tcnica se fundamenta en la propiedadnatural de las
ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual
emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para
separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada
fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse
las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

Aplicaciones
Cuantificacin viral
Control de eficacia de frmacos
Deteccin de patgenos
Diagnostico de tumores
Cuantificacin de expresin gnica

Instrumentacin
Termociclador
Lector de
fluorescencia
Recolector de
datos

Reactivos necesarios
4 desoxirribonuclesidos-trifosfato (dNTP), sustratos para
polimerizar nuevo ADN.
2 cebadores o primers que delimitan la zona de ADN a
amplificar
ADN molde donde se contiene la regin de ADN que se va a
amplificar
1 iones monovalente
1 iones divalentes

Sistemas de deteccin usados en

pcr en tiempo real
Sist. de
Deteccin
Colorantes de
unin al ADN

Oligonucleti
dos
especficos
Primers
fluorescente
s

Sondas
fluorescentes

Las tecnologas fluorecentes

usadas incluyen
Colorantes de unin al ADN
Sondas que fluorecen luego de su hidrolisis
(sondas taqman)
Sondas de hibridacin

SYBER Green
Con sucesivos ciclos se va acumulando el producto de
la reaccin ,en el cual se intercala el colorante
aumentando la fluorescencia emitida en cada ciclo

Curvas de disociacin

PCR en tiempo real: Deteccin

mediante sondas de hibridacin
El mtodo utiliza dos primers (F y R) y dos sondas marcadas con
fluorocromos, las cuales hibridan adyacentemente

Ventajas y desventajas
Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un
donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de
energa fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos
molculas.

PCR en tiempo real: deteccin

mediante sondas de hidrolisis
Se lleva a cabo mediante la hibridacin con una sonda
complementaria a una regin interna de la secuencia blanco,
previamente a la amplificacin. Tm sonda debe ser 10C >
que el de los cebadores, de modo que hibride antes que los
mismos.

Ventajas y desventajas

Sondas beacon
Estas son similares a las sondas de hidrolisis, tienen una
molcula donadora en el extremo 5 y una aceptora en el
extremo 3 pero, adems, presentan una estructura secundaria
en forma de asa, en la que reside la secuencia de unin
especfica con el ADN diana.

Tipos de cuantificacin