BIOLOGÍA

MOLECULAR
CAROLINA DE LA PEÑA FERNÁNDEZ
 01 PCR

02 ELECTROFORESIS

03 CLONACIÓN
 PCR
Técnica que consiste en ampliar moléculas de ADN,
creando una cantidad bastante elevada de copias en
muy poco tiempo. Así se puede analizar muestras que
tienen poca cantidad de material genético.
COMPONENTES DE LA PCR
Agua libre de ADN asa
y ARN asa

Cebadores
Cloruro de Magnesio Los cebadores son moléculas que
optimizan la reacción siendo marcan en la hebra de ADN el punto en
el componente necesario de el que la polimerasa debe de comenzar
la polimerasa para funcionar. la replicación..

Taq Polimerasa Nucleótidos

Enzima utilizada para la La Polimerasa los va
replicación del ADN a partir añadiendo a la hebra
de los cebadores. complementaria

Buffer
solución que regula el pH
 Ciclo
LAS FASES DEL PROCESO DE LA PCR Los ciclos son los cambios
de temperatura

En el termociclador
añadiremos los componentes
de nuestra PCR, y la
programaremos en 4 fases.
1. Desnaturalización: Donde
Desnaturalización
conseguiremos la
95ºC, de 1-5 min.
desnaturalización de la
hebra deADN.
2. Hibridación: Donde los
cebadores se aparearan Hibridación
en las hebras de la Apareamiento de los
cebadores a una
cadena. temperatura de 50-70ºC
3. Enlogación: La Taq
Polimerasa irá Enlogación
Las polimerasas sintetizan las
añadiendo los
cadenas de ADN partiendo
nucleótidos sintetizando de los cebadores.
la nueva hebra. Temperatura de 72ºC.

4. Repeticion de los ciclos

 VARIANTES DE LA PCR
PCR Múltiplex
Se añaden varias muestras de ADN para
amplificar varias parejas de cebadores.
Es muy utilizada para el estudio de
diferentes mutaciones a la vez,
reduciendo así el tiempo y los costes.
PCR asimétrica
Es una PCR en la que se replica las dos
cadenas de ADN.
PCR a tiempo real o PCR
cuantitativa
Nested PCR o PCR anidada Es una PCR normal que cuantifica el
Realizando una PCR normal y material genético amplificado gracias a
posteriormente una PCR partiendo de la unos fluorocromos.
primera con nuevos cebadores,
mejorando así la especificidad. Es muy
utilizada cuando hay pocas copias de un
ADN y se necesita amplificar, o hay dos
genes muy similares y solo necesitamos
uno de ellos.
PCR touchdown
Consiste en ir reduciendo de forma
gradual la temperatura de hibridación 1º
en cada ciclo.
 ELECTROFORESIS
Esta técnica consiste en colocar las muestras de estudios en
una plantilla de gel de agarosa y aplicarle una corriente
eléctrica. Gracias a la corriente y a la composición del gel
podemos ver cómo las moléculas son desplazadas a diferentes
direcciones y a distintas velocidades.
COMPONENTES DE LA
Electrodos
ELECTRIOFORESIS + Ánodo
- Cátodo
Como el ADN es negativo lo
colocaremos en el cátodo y
Pocillos este sera desplazado hacia el
Lugar donde colocaremos la ánodo
muestra de estudio y los
marcadores

Gel de agarosa o
policarilamida
Tampón Gel por el que viaja las
Solución reguladora de pH moléculas del ADN, estasse
desplazarán en relación a la
porosidad y al tamaño de las
partículas
LAS FASES DE LA ELECTROFORÉSIS

Fase 2. Fase 3.
Fase 1.
Dejamos enfriar el gel con el Colocamos el gel en la camara
Preparar el gel de agarras o
peinecillo para queuna vez frio lo dejando en la posición de los
poliacrilamida
retiremos y tengamos los pocillos pocillos en el polo negativo y
cubriremos con el tampón o buffer

Fase 4. Fase 5. Fase 6.

Colocaremos la muestra de Lo pondremos en marcha
Visualización de los resultados
estudio y los marcadores de
referencia con una pipeta enlos
pocillos
 TIPOS DE ELECTROFORESIS

Electroforesis Electroforesis de
bidimensional campo pulsado
Este tipo de electroforésis En este tipo de electoforésis
emplea dos dimensiones es como una convencional
diferentes, para así poder pero en vez de generar una
separar las proteínas por su corriente electrica se generan
tamaño y punto iosoelécrico. dos de forma cruzada

Electroforésis por
capilaridad
En este tipo de de
electroforesis la separación se
realiza por medio de
capilares milimétricos
pudiendo así motorizar el
proceso
 CLONACIÓN
Es la realización de una copia exacta al ADN de partida. El
mejor ejemplo es la mitosis, pues de una célula madre salen dos
células hijas idénticas.
COMPONENTES DE LA CLONACIÓN Célula huesped
Célula en la que insertaremos
el ADN recombinante para su
proliferación.

ADN exógeno
Muestra del ADN a clonar

Enzimas
Necesarias para cortar y unir el ADN
exógeno y el vector.
Las enzimas de restricción reaizan conrtes
cohesivos tanto del ADN como del vector.
Las enzimas Ligasa une los fragmentos que
las enzimas de restricción han obtenido,
tanto del ADN exógeno como del vector,
Vector formando así el ADN recombinante.
Es el vehículo que añadido al
ADN exógeno forman el ADN
recombinante. Plásmido,
fásmico, cósmico, virus y YAC.
 LAS FASES DE LA CLONACIÓN
1. Contrucción del ADN
recombinante
Junto a las enzimas de restricción
y ligada, cortaremos tanto el ADN
exogeno como el vector con
bordes cohesivos y se unirán,
formando así el ADN Recombinate
2. Transferencia a la
célula huesped
Transferencia del ADN
recombinante a la célula huésped.
3. Selección la célula
huesped
Seleccionaremos la célula
huésped escogiendo aquiellas en
las que el ADN recombinante se
haya insertado correctamente
4. Genoteca
Construiremos una genoteca
TIPOS DE CLONACIÓN

Clonación celular Clonación acelular

Empleo de células para la replicación del ADN Amplificación por PCR
GRACIAS POR
EL PUNTO
COMPLETO
CAROLINA DE LA PEÑA FERNANDEZ