PCR TIEMPO REAL

Biología Molecular
Facultad de Ciencias Químicas

Alumnas:
Cartas Domínguez Ivette del Carmen
Quintas Santiago Paola
 La PCR a tiempo real o PCR cuantitativa es una variación de la PCR
estándar utilizada para la cuantificación de DNA o de RNA mensajero
(mRNA) de una muestra.

Características importantes:

*Alta especificidad

*Amplio rango de detección

(de 1 a 107 equivalentes genómicos
de la secuencia blanco)

*Rapidez en la visualización
del producto.
 SISTEMAS DE DETECCIÓN USADOS EN LA PCR EN
TIEMPO REAL

Los termocicladores para llevar a cabo la qPCR incorporan un lector de

fluorescencia y están diseñados para poder medir la fluorescencia emitida
en cada uno de los viales donde se realice la amplificación.

Pueden ser de dos tipos:

a) AGENTES INTERCALANTES ( Métodos No Específicos)
Son moléculas planas que se insertan entre 2 pares de bases del ADN,
separándolas entre sí.
Estos fluorocromos emiten fluorescencia cuando se unen al ADN.
1.- BROMURO DE ETIDIO

Emite una luz roja-anaranjada, que se

intensifica unas 20 veces después de
haberse unido a una cadena de ADN.

2.- EVA GREEN

Baja inhibición de PCR
Alta sensibilidad
No mutagénico
Compatible con protocolos rápidos de PCR
3.- SYBR GREEN
Esta molécula se introduce en la estructura
secundaria de la doble hélice del ADN y
se acopla energéticamente a los ácidos
nucleicos que lo forman, de manera que se
incrementa notablemente su tasa de
emisión fluorescente.
b) SONDAS ESPECÍFICAS (Métodos Específicos)

Todas se basan en el principio FRET que

consiste en la transferencia de energía
entre dos fluoróforos: un donador (reportero)
y un aceptor (apagador o quencher), los
cuales emiten fluorescencia a diferente
longitud de onda.
1.- SONDAS HIDROLIZADAS

En este sistema se utiliza una sonda, es

decir, un oligonucleótido específico
(~20 bases) para la secuencia del gen
de interés marcado con dos fluoróforos,
un reportero unido al extremo 5’ y
un apagador en el extremo 3.
SONDAS TAQ MAN
VENTAJAS Y DESVENTAJAS
EQUIPOS PARA PCR

• Compuestos por un
termociclador y por un
lector de fluorescencia

• Las diferencias más

importantes entre estos
equipos hacen
referencia a la rapidez
y al número de
muestras que se
pueden procesar al
mismo tiempo.
Métodos de cuantificación

Se utiliza para conocer el número

exacto de copias amplificadas del
Absoluta
blanco o la concentración precisa
de ácidos nucleicos

Se aplica cuando se desean

evaluar los cambios en la
Relativo
expresión de genes en distintos
estados fisiológicos.
ETAPAS DE LA PCR-TIEMPO REAL
 Aplicaciones a la microbiología
clínica
■ Identificación de organismos fácilmente cultivables
■ Poporciona métodos ágiles y sencillos para la identificación
de mutaciones puntuales asociadas con resistencias a
fármacos antimicrobianos.
■ Diagnostico de patalogias a temprana edad