UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA

AMBIENTAL
TEMA:
PCR en Tiempo Real: la nueva era de la información
genética celular
CURSO:
BIOTECNOLOGÍA

DOCENTE:
ING. SOTO GONZALES, HEBERT HERNAN

ALUMNO:
PALOMINO APAZA JENRRY ALEXANDER

CICLO:
VII
MOQUEGUA
2021
 PCR en Tiempo Real: la nueva era de la información genética celular

1. INTRODUCCION 2. OBJETIVO 4. MARCADORES FLUORESCENTES

La técnica de PCR en tiempo real, se basa en la • Identificar los principales conceptos en la estimación de
reacción en cadena de polimerasa (PCR) y se usa para la expresión genética mediante la utilización de PCR en Una de las ventajas de la PCR en tiempo real es que el proceso completo se realiza en el
amplificar y al mismo tiempo cuantificar moléculas de tiempo real termociclador. ayuda a disminuir el riesgo de posterior contaminación en el laboratorio y
ADN o ADN complementario (ADNc) específicas y así • Explicar el manejo básico de los datos obtenidos con permite aumentar el rendimiento de la prueba en tiempo real.
acceder a datos fiables y precisos sobre la expresión esta técnica.
genética de las células en estudio. Una característica • Se busca revisar las aplicaciones que hoy en día tiene
importante de PCR en tiempo real es su amplio rango esta técnica y sus futuras tendencias en la ciencia
dinámico. aplicada. elementos ópticos integrados al
Marcadores
fluorescentes termociclador

específicos genéricos
3. TRANSCRIPCIÓN REVERSA EN LA PCR EN
TIEMPO REAL Emplean sondas de ácidos
Se basa en la utilización de
nucleídos que se unen a
colorantes que se unen a
amplicones específicos
Una limitación es que se debe utilizar ADN como secuencia diana, ya que las ADN todas las secuencias de doble
(producto de PCR). La
polimerasas no pueden amplificar ARN de una manera similar. cadena de ADN en una
mayoría de estas sondas
Con el uso de la enzima transcriptasa inversa para generar ADNc a partir de reacción de PCR.
una plantilla de ARN se supera esta limitación. usan el fenómeno FRET
para emitir las señales
Por ello la RT-PCR en tiempo real se ha convertido en el método de elección para luminosas que se van a
realizar un examen rápido y cuantitativo de la expresión de genes específicos. medir en el termociclador
a medida que se obtenga
el producto de la PCR.

Los marcadores más utilizados son los colorantes: SYBR ® Green y SYBR ® Gold
Estos marcadores son populares porque son baratos y son distribuidos por los proveedores
de reactivos como cócteles listos para usar y no requieren un diseño experimental adicional.
 5. ANÁLISIS DE LA CURVA DE FUSIÓN 7. OPTIMIZACIÓN DE PCR EN TIEMPO REAL

El análisis de la curva de fusión puede llevarse a cabo en la La optimización consiste en hacer que las variaciones normales de la
mayoría de plataformas disponibles para la PCR en tiempo prueba no causen efectos importantes en los valores Ct y que tengan un
real, por lo general al final de la reacción de amplificación. impacto mínimo en la cantidad de fluorescencia observada.
La mayoría de los instrumentos proporcionan un análisis de
estos datos teniendo en cuenta el punto en donde aparece el
Los criterios más importantes para la optimización son:
primer diferencial negativo de la señal de fluorescencia con
respecto a la temperatura y la temperatura de fusión.
• Especificidad
EL método de análisis de la curva de fusión es análogo al de • Sensibilidad
electroforesis en gel de agarosa. Con ambos métodos se • Eficiencia
puede evidenciar la presencia de productos no específicos, • Reproducibilidad de la PCR en tiempo real
sin embargo también están expuestos a errores.
Los factores que deben ser optimizados son:
• Las mezclas maestras de reactivos
6. UMBRAL Y VALORES UMBRAL DEL • La concentración de los primers
CICLO (THRESHOLD CYCLE VALUES) • Concentración de los marcadores fluorescentes
• La concentración de la muestra.
los resultados de la PCR en tiempo real se basan en
la detección y cuantificación de los marcadores
fluorescentes a lo largo de la reacción de la PCR.

Para obtener estos resultados, los valores umbral

de ciclo deben ser obtenidos. Anteriormente, un
umbral adecuado debe ser fijado por el operador
en un punto significativamente por encima de la
línea base.

Los valores Ct son determinados por la

identificación del ciclo en el cual la emisión de la
intensidad del marcador fluorescente se eleva por
encima del ruido de fondo en la fase exponencial
de la reacción de la PCR.

un valor Ct superior a 40 ciclos indica que no hay

amplificación y por consiguiente no deben incluirse en
los cálculos.
 8. ESTRATEGIAS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE ARNM EN PCR EN TIEMPO REAL 9. GENES DE REFERENCIA

Algunos de los genes de referencia más utilizados incluyen:

8.1 CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA • β-actina
• Glyceraldehyde 3-fosfato deshidrogenasa
La técnica de cuantificación absoluta relaciona la señal obtenida con la PCR en • hipoxantina guanina
tiempo real al número de copias fijo de una secuencia estándar utilizando una curva • phosphoribosyl-transferasa
de calibración. Las curvas de calibración son altamente reproducibles y permiten la • 18S del RNA ribosomal
generación de datos específicos y sensibles. La elección correcta de los genes de referencia para la normalización de PCR en tiempo real es esencial para
reflejar datos fiables sobre los procesos biológicos de las proteínas objeto de estudio.

8.2 CUANTIFICACIÓN RELATIVA 10. APLICACIONES DE LA PCR EN TIEMPO REAL

Esta técnica se utiliza para obtener la magnitud de los cambios fisiológicos en los La PCR en tiempo real tiene amplias aplicaciones en investigación científica y como herramienta de diagnóstico.
niveles de expresión genética de un gene en estudio en comparación con uno o más También es ampliamente utilizada en identificar mutaciones o polimorfismos genéticos valiéndose de sondas
genes de referencia. específicas y sus resultados en el análisis de los cambios de la curva de fusión. La PCR en tiempo real se utiliza
Los cálculos en cuantificación relativa de expresión genética se basan en la para acceder a datos relevantes a la biodinámica de los organismos que producen enfermedades.
comparación de los valores Ct utilizando la eficiencia de la reacción de la PCR como
factor de corrección. Los campos de mayor aplicación de esta técnica es:
El método 2 delta-delta Ct expresa la proporción obtenida de la relación entre los • La investigación de cambios en la expresión genética de células
valores Ct de la muestra y los valores Ct del control tal y como se muestra en la • Investigación forense y la bioseguridad
siguiente ecuación: • La seguridad alimentaria

11. FUTURAS PERSPECTIVAS DE LA PCR EN TIEMPO REAL

Uno de los usos que se desprende de la tecnología utilizada en la PCR en tiempo real es la realización de pruebas
Otro modelo para cuantificación relativa ha sido publicado por Pfaffl diagnósticas moleculares en el mismo lugar en donde se toma la muestra a ser estudiada y no en laboratorios
lejanos. conjuntamente con el desarrollo de plataformas de hardware portátil, darán paso al inicio de la era de
pruebas genéticas individualizadas.

12. CONCLUSIÓN

Las pruebas como la PCR en tiempo real son una prometedora ayuda para el desarrollo de aplicaciones que
La eficiencia de PCR de cada gen estudiado permitan realizar investigación en biología molecular obteniendo un gran flujo de datos fiables y precisos sobre
los organismos estudiados.