5.

OTRAS TÉCNICAS DE PCR

• Existen unas técnicas de PCR que permiten mayor especificidad en determinadas
aplicaciones que la estándar.
• Entre ellas están:
1. PCR ANIDADA
2. PCR MÚLTIPLE
3. PCR CON TRANSCRIPCIÓN INVERSA (RT-PCR) .

5.1. PCR ANIDADA

• Consiste en la realización de dos PCR acopladas, de forma que la segunda PCR utiliza como
ADN molde los productos de amplificación de la primera.
• Se usa para:
ₒ Aumentar la sensibilidad cuando el rendimiento de la PCR estándar es bajo
ₒ O para aumentar la especificidad cuando no es posible evitar el acúmulo de
productos no deseados con una PCR estándar.

• Los cebadores usados en ambas PCR son distintos.

a) En la 1ª PCR :
ₒ Los cebadores se llaman cebadores externos.
ₒ Se diseñan para amplificar un fragmento de mayor longitud que incluye la zona de
interés.
b) En la 2ª PCR :
ₒ Los cebadores se llaman cebadores internos.
ₒ Se diseñan para amplificar la región de interés.

• La muestra que se tiene que amplificar en la 2ª PCR, es el producto obtenido en la 1ª PCR.

Los amplicones de la 1ª PCR se utilizan como molde en la 2ª PCR, de esta manera se amplifica la
región de interés que está contenida en la secuencia de esos amplicones de la 1ª PCR.

1
Libro de texto fig. 6.9.

2
5.2. PCR MÚLTIPLE ( Multiplex PCR)
• Consiste en la amplificación de varias secuencias diana simultáneamente, en el mismo tubo,
en una sola reacción de PCR.
• Se consigue utilizando varios juegos de cebadores, cada uno específico para amplificar una
región diferente.
• Estas parejas de cebadores tienen que cumplir varios requisitos:
ₒ La temperatura óptima de todos los cebadores para hibridar debe ser semejante ya
que usan un único programa de termociclador.
ₒ Los amplicones formados por cada pareja de cebadores deben tener un tamaño
diferente para poder separarse en la electroforesis y visualizarse como bandas
individuales.
ₒ Deben diseñarse de tal manera que no puedan hibridar unos con otros formando
dímeros o oligómeros.

5.3. PCR CON TRANSCRIPCIÓN INVERSA (RT-PCR)

• Es aquella que permite amplicar y analizar moléculas de ARNm
• Pasos a realizar:
1. Un paso previo de síntesis de ADNc (ADN copia), mediante una retrotranscriptasa
(transcriptasa inversa)
2. Un segundo paso ,en el cual una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc como
molde y lo amplifica.

Retrotranscriptasa ADN polimerasa termoestable

ARNm -------------------------------- > ADNc ----------------------------------------------- > Amplicones

Estos pasos se pueden realizar en dos tubos independientes o en un mismo tubo.

3
Libro de texto . Fig 6.11

4
6 . PCR A TIEMPO REAL
 INTRODUCCIÓN Y CONCEPTO
Es una PCR convencional que se le añade un agente fluorescente y de esta forma
se puede hacer un seguimiento paso a paso y cuantificar el proceso de amplificación de un
segmento específico de ADN.
• EL termociclador incorpora un lector de fluorescencia y va a leer en el tubo de reacción la
fluorescencia a un tiempo determinado : mientras más cadenas de ADN haya ,más agentes
fluorescentes se intercalan,por tanto más fluorescencia va a dar.

=== > DEFINICIÓN DEL LIBRO

• La PCR a tiempo real es aquella que se monitoriza el proceso de amplificación
mediante el empleo de productos fluorescentes, de forma que la detección de los
amplicones se realiza ciclo a ciclo.

• RESUMEN: La PCR a tiempo real se realiza en un termociclador a tiempo real que incorpora
un lector de fluorescencia ,de manera que se puede medir la intensidad de fluorescencia en
cada tubo de reacción en cualquier momento.
(*) La cantidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN que se está
amplificando.

 VENTAJAS DE LA PCR A TIEMPO REAL RESPECTO A LA PCR A PUNTO FINAL (CONVENCIONAL)

a) Mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en una muestra,porque
el resultado se puede obtener incluso antes de que termine la PCR.
(vemos si está o no está la secuencia )
b) Resultados más fidedignos,porque la detección instrumental de fluorescencia es más
objetiva que la tinción con bromuro de etidio* en un gel de electroforesis.
Puede haber una banda que no sea muy visible.
(*) Bromuro de etidio es un agente fluorescente (cancerígeno)
c) Minimiza los problemas de contaminación,ya que la amplificación y detección se
realizan en un tubo cerrado (no hay que sacar la muestra ni para cuantificar ni para ver
si está el fragmento).
d) Puesto que la intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN
sintetizado, permite la cuantificación tanto de los amplicones producidos ,como del
ADN diana inicial presente en la muestra.