Desventajas:

La PCR en tiempo real es, básicamente, una

➢ Requerimiento de equipamiento.
PCR convencional en la que los equipos de
➢ Reactivos muy costosos.
amplificación (termocicladores) llevan
incorporados un sistema de detección de
fluorescencia (fluorimetro), basándose la
tecnología en la utilización de unas moléculas
especificas denominadas fluoróforos (tiene la
capacidad de unirse al ADN que se está
amplificando) y quenchers (depende de la
variante de PCR).
Mientras mayor ADN se produce, mayor es la
intensidad de fluorescencia.
Por lo tanto, la incorporación de un fluoróforo
asociado a un computador en cada tubo de
PCR, permiten monitorear, en tiempo real, lo
que está ocurriendo dentro de cada tubo en
cada ciclo de amplificación.
La primera compañía que desarrolló la
instrumentación necesaria para llevar a cabo Los sistemas del RT-PCR consisten en 3
el qPCR fue Applied Biosystems en el año 1996, componentes principales:
y desde entonces otras compañías como 1. Termociclador.
BioGene, Bioneer, Bio-Rad, entre otras han 2. Módulo óptico: Esta incorporado en el
desarrollado nuevos equipos. termociclador, sirve para detectar la
Ventajas: fluoresceína en cada tubo durante la
corrida
➢ Mayor sensibilidad (se la da el 3. Computador: Para traducir la intensidad de
fluoróforo). fluoresceína en resultados interpretables.
➢ Permite cuantificar.
Ejemplo: Equipo MiniOpticon real-time t.
➢ Mayor especificidad (uso de sondas
especificas).
➢ Monitoreo durante todo el
procedimiento.
➢ Disminución del riesgo de
contaminación (uso de sondas
especificas + buenas prácticas de
laboratorio).
➢ Uso de amplicones pequeños (menores
a 100pb).
➢ Transcripción reversa (RT-qPCR) para
determinar expresión de genes.
En la imagen vemos el módulo de
termociclador en donde tiene la placa

1 KAROL SANHUEZA S/JAIME VILLEGAS | PCR en tiempo real

calefactora que permite varias las ¿En qué momento?
temperaturas. Arriba se encuentra el módulo
óptico que tiene una placa incorporada en ➢ Depende de cómo se diseñen los
donde se colocan los tubos (96) y el sistema va partidores, ya que un partidor puede
leyendo cada tubo con un detector que generar “dímeros de partidores” que tienen
permite determinar la fluorescencia que se va doble hebra. Por lo tanto, de igual manera
produciendo en ellos. el fluoróforo se va a unir sin saber si el
producto es amplificado o es un dímero de
partidor o un auto dímero, por ende, donde
haya doble hebra el fluoróforo se va a unir y
va a generar fluorescencia.
El computador transforma las señales de
fluorescencia de cada tubo en data
interpretable.
Workflow:
1. Set up su protocolo de PCR (desnaturación,
apareamiento, elongación).
2. Set up la placa con las muestras.
3. Recolectar la data.
4. Analizar la data. Fluoroforos no específicos: SYBR Green
(excitación: 498 nm/Emisión: 520 nm).

El fluoróforo SYBR Green es un elemento muy

importante en la reacción de PCR en
tiempo real.

Uno de los elementos importantes en el PCR en
tiempo real es el Fluoróforo y el más utilizado es
el SYBR Green. Esta es una molécula con anillos
que tienen la particularidad de que se unen
exclusivamente a ADN de doble hebra
produciendo fluorescencia, la cual se
incrementa hasta 1000 veces cuando está
unido al ADN doble hebra.
Ventajas:
➢ Simple, rápida optimización, bajo costo.
Desventajas:
➢ Inespecificidad (puede generar falsos
positivos), no se pueden utilizar para PCR
múltiple en un tubo de reacción(porque
no va a diferenciar), necesita curva de
disociación.

Este sistema es más sensible que un PCR

convencional. Cinética de amplificación de la PCR
Consideraciones
Si hay ADN de simple hebra, el fluoróforo no se
une, pero si se forma ADN de doble hebra por
el proceso de amplificación el SYBR Green se
une y forma la fluorescencia.

¿Qué problemas hay?

➢ Puede generar falsos positivos.

2 KAROL SANHUEZA S/JAIME VILLEGAS | PCR en tiempo real

La detección del producto de la PCR se realiza diferencia en la emisión de fluorescencia
con el análisis de las curvas de qPCR. normalizada (Rn) de la muestra y de un
control sin templado (NTC).
Se va a graficar el número de ciclos (hasta 40)
en un PCR en tiempo real vs la fluorescencia u • Fase logarítmica: Incremento exponencial
otro parámetro que queramos presentar en el del producto de PCR.
resultado. • Fase estacionaria: Tope o máximo de
amplificación, resulta de cantidades
Se realizo la mezcla y empezó en PCR, en los limitantes de enzima y/o reducción de la
primeros 10-15 ciclos (dependiendo del gen), la actividad enzimática.
intensidad de fluorescencia es tan baja que el
equipo no es capaz de detectar la
amplificación. En un momento sube la
fluorescencia y esto se llama Ct, va a seguir
aumentando el número de ciclos y, por lo
tanto, obtendremos una fase exponencial
hasta que finalmente llegue a un plató
(máximo) porque se están acabando los
sustratos.
Siempre debemos agregar un control sin ADN
molde, porque este es el control de
especificidad en el sentido en que si los
partidores hacen cosas “raras”, van a haber
amplificaciones pequeñas. Por lo tanto,
siempre debemos tener este control.
Esta imagen es de un resultado experimental,
cada color representa una reacción
Conceptos independiente y vemos que en el ciclo 19
comienza a subir (rojo).
• Línea base (background): Corresponde a los
Entonces, vemos que hay muestras en donde el
niveles de señal de fluorescencia durante
Ct es bajo y otras en donde el Ct es alto. Aquí
los primeros ciclos (3-15), lo que se conoce
es donde se establece la relación entre el Ct y
como ruido, no sobrepasa el umbral.
cuanto es lo que hay de material inicial porque
• Umbral (Threshold): Umbral en el que se es inversamente proporcional al n° de copias
produce un cambio significativo en la que tiene la muestra (templado). Es decir,
fluorescencia. mientras mayor sea el número de copias o
• Ct (Threshold cycle): El parámetro cantidad de ADN, el Ct va a ser más pequeño.
fundamental en una PCR en tiempo real y
en función del cual se van a realizar todos
los cálculos analíticos y obtención de
resultados, es el denominado Ciclo Umbral
(Ct), que se define como el ciclo a partir del
cual la fluorescencia es estadísticamente
significativa por encima del ruido de fondo
(background).
• Rn: Intensidad de la señal emitida por el
reportero normalizada por la emisión del
fluoróforo utilizado como referencia pasiva
(ROX) medido en el NTC (control sin
templado). En este gráfico, en color verde vemos que si hay
• ∆Rn: Magnitud de fluorescencia generada un Ct de 15 y en otra muestra en paralelo se
durante la PCR y se calcula como la

3 KAROL SANHUEZA S/JAIME VILLEGAS | PCR en tiempo real

amplifica el mismo gen que está a un Ct de 20,
vemos que el que tiene más Ct es el 15.
Mientras más a la izquierda este la curva,
mayor cantidad de material de inicio hay
en la muestra.
hay solo 1 producto de amplificación, es decir,
el diseño de primer estuvo bueno y de esta
manera se chequea que el producto de PCR
que está generando las muestras que se están
evaluando, corresponde al amplicón que se
está investigando.

Ejemplo de curva representativa de un amplicón

Es necesario para discriminar si las muestras con y dímeros de primers
curva de amplificación positivas corresponden
a productos específicos o a dímeros de primers
o productos inespecíficos, se suele realizar una
curva de desnaturalización (“melting curve”) al
comienzo de la reacción.
La reacción se calienta lentamente desde 50°C
hasta 95°C monitoreando continuamente la
fluorescencia.
La temperatura a la cual el ADN se
desnaturaliza se observa como una drástica
caída de la fluorescencia debido a la
disociación del SYBR Green I. En este ejemplo vemos que en el eje X va la
temperatura que va en aumento y en el eje Y
Los productos de PCR de diferente longitud y está la fluorescencia. Vemos que hay 2 curvas
diferentes secuencias se desnaturalizan a y debajo del umbral hay líneas (muestras
diferentes temperaturas, observándose negativas), por lo tanto, si se está amplificando
diferentes picos cuando se representa la con solo 1 par de primers se debería obtener
derivada de la fluorescencia con respecto a la como resultado solo 1 producto de
temperatura (-dF/dT). amplificación, pero hay 2. En esta situación lo
que se recomienda es diseñar otro par de
Representa la medición de la/s temperatura/s
primers.
de fusión de el/los producto/s amplificado/s.
En una curva vemos los productos amplificados
Depende del contenido de GC y tamaño del
amplicón. porque en ese lugar está el control positivo y la
curva que dice dímero de primers porque en
Ejemplo de curva representativa de un amplicón ese lugar están los controles negativos.
único y especifico Conclusión: Puede que los primers entre ellos
estén haciendo dímeros de primers.

Ejemplo de la visualización de un producto de

amplificación que produjo dos amplicones

En este ejemplo vemos que en el eje X va la

temperatura que va en aumento y en el eje Y
está la fluorescencia. Cada una de las líneas de
colores representa 1 tubo en donde hay
muestras distintas y solo vemos una curva. Esto
se traduce en que si se observa solo 1 curva,

4 KAROL SANHUEZA S/JAIME VILLEGAS | PCR en tiempo real

En esta imagen vemos la curva de disociación
del producto esperado, pero vemos un peak
que se pasa al gen de agarosa y se obtienen 2
fragmentos, por lo tanto, debemos hacer todo
de nuevo.
Esto es necesario de hacer para validar las
interpretaciones de los resultados.
Con el PCR en tiempo real se puede cuantificar
de manera absoluta o relativa.
➢ Absoluta: Se determina de manera
precisa la cantidad de ng/ml, ng/ug,
etc., o el número de copias de un gen
viral en una muestra de sangre
(ejemplo). Para poder realizar esta
cuantificación se necesita del uso de
patrones, que deben ser incluidos en
cada PCR realizada. Se utiliza para la
detección de COVID-19 y VIH (se realiza
esta cuantificación cuando se quiere
hacer diagnóstico, ausencia, presencia,
positivo o negativo).
➢ Relativa: Da idea de los cambios
generados en el nivel de un gen de
interés, en comparación con un gen
control que no varía con el tratamiento
realizado (se realiza esta cuantificación
cuando se quiere evaluar la expresión
génica).
Cuantificación absoluta
Se utiliza estándares de ADN conocidas.
Ejemplo: plásmidos con secuencia diana o
target (patrones de referencia).
➢ Plásmidos: Fragmento de ADN circular
que no está en el cromosoma, es de
doble hebra y en el caso de las bacterias
contiene los genes de resistencia
antiviral.
Los plásmidos por ingeniería genética, si
queremos saber el número de copias del
genoma de VIH (ejemplo), debemos amplificar
una nucleoproteína o alguna parte del virus y
en el plásmido colocamos la secuencia que
contiene el gen que de interés. El plásmido al
estar hecho de manera sintética y purificado,
va a llegar al laboratorio y nos dirán que
tenemos ug/ml que en el gen por interés
5 KAROL SANHUEZA S/JAIME VILLEGAS | PCR en tiempo real
equivale a X copias. Por lo tanto, para poder
realizar una cuantificación absoluta lo que
debemos hacer es una curva de calibración.
Según los matemáticos del PCR nos indican
que si estamos haciendo diluciones seriadas, y
en la imagen vemos de 100 ng hasta 1 pg, entre
las distintas diluciones deben 3.3 ciclos de
diferencias.
En la imagen vemos en el eje X el número de
ciclos y en el eje Y está la fluorescencia; se
observa el ciclo de umbral (línea punteada) y
se ven los estándares. En rojo vemos la curva de
100 ng que es 10 veces menos que la verde, la
verde es 10 veces menos que la morada y así
sucesivamente. Son 10 veces menos porque
está diluida 1:10 (dilución seriada). Esto se
realiza para poder obtener el Ct, porque este
se utiliza para poder cuantificar.
Una vez obtenida la curva, tomamos la muestra
problema y se realiza el PCR en presencia de
un control positivo (plásmido), tendremos un Ct
que se interpone en la curva de calibración
para poder determinar con precisión cuantos
números de copias tengo.
¿Qué es importante?
➢ La cuantificación o amplificación debe ser
hecho por triplicado o replicas técnicas, es
decir, en la misma reacción deben haber 3
tubos.
Se puede determinar el número exacto de
moléculas de ADN o ARN presentes en una
muestra a través de una curva de calibración y
para poder realizar esta curva se necesita
utilizar los estándar de ADN conocidas.
El resultado estará expresado en las mismas
unidades que los estándares de la curva de
calibración (número de copias, ng/ml).
Este tipo de cuantificaciones se emplean para
la detección y cuantificación de cargas virales,
agentes patógenos o en la terapia génica.
En el PCR si estamos en el ciclo 2 y pasaremos
al ciclo 3, el material genético se duplica 2
veces.
Cuantificación relativa
Mide cambios en el nivel de un gen de interés,
en relación al nivel de un gen control o
referencia que no varía con las condiciones
ensayadas. Es decir, siempre se contrasta con
un gen control, endógeno o de referencia o
housekeeping, el cual no se ve alterado frente
a un tratamiento y esto es porque son genes
esenciales y vitales para la célula.
➢ Gen control, endógeno o de referencia
(al menos 6): Genes que se expresan
continuamente o housekeeping.
Ejemplo: beta actina, rARN 18S, GAPDH.
La aplicación más utilizada de este método es
la comparación de los niveles de expresión
génica (mARN) entre diferentes tejidos o en el
tiempo, o la respuesta de un tejido a diferentes
tratamientos.
Se puede llevar a cabo a través de 2 métodos:
1. Método de la comparación de Ct.
2. Método de la curva estándar para
cuantificación relativa.
Los resultados de la PCR en el tiempo real son
normalizados frente a genes controles, que
pueden servir a la vez como controles positivos.
Se asume que la expresión de un gen
endógeno es:
1. Similar en todas las muestras, en un estudio
dado.
2. Resistente a variaciones experimentales.
3. Conducida en todos los pasos de qPCR con
la misma cinética que el gen de interés.
El método delta delta Ct parte de una
suposición importante respecto a la PCR: El
método delta delta Ct asume que cada ciclo
de la PCR dobla exactamente la cantidad de
6 KAROL SANHUEZA S/JAIME VILLEGAS | PCR en tiempo real
material que hay dentro de la muestra
(eficiencia de amplificación = 100 % o 2).
Siempre que uses este método, tendrás que
crear una curva estándar para asegurarte de
que los cebadores (partidores) del gen de
referencia y el gen de interés tengan
eficiencias similares. Si las eficiencias son
distintas, deberás diseñar nuevos cebadores.
La curva estándar está formada por varias
reacciones de PCR cuantitativa realizadas
sobre una serie de diluciones sucesivas en base
10. Para la curva estándar, se representan los
valores de Ct obtenidos de cada disolución y
cruzarlos con el logaritmo de los factores de
dilución (FD) empleados para crear la curva
estándar.
¿Cómo se determina intuitivamente la eficiencia
de amplificación del gen A y el gen B con una
concentración inicial?
➢ Si tienen la misma eficiencia de
amplificación y se realiza un PCR, el Ct
debería ser igual.
Si la pendiente es -3.3, la eficiencia es del 100%
de amplificación.
Los genes de referencia, también llamados
genes constitutivo, son normalmente genes
esenciales para la célula, ya que son
necesarios para las funciones celulares
básicas. Se espera que estos genes se expresen
a niveles relativamente constantes en la
mayoría de las células del organismo, tanto en
condiciones normales como en caso de
enfermedad.
Los genes de referencia se usan para la
normalización de los datos de la PCR
cuantitativa.
Los genes de referencia típicos son el GAPDH
(gliceraldehido 3- fosfato deshidrogenasa) y el
ACTB (el gen que codifica la beta – actina).
(2-∆∆Ct).
Es el método más comúnmente utilizado.
Se basa en un modelo matemático que
calcula cambios en la expresión génica como
diferencias relativas entre las muestras
experimental y un calibrador (controles en los
que hay expresión segura de los genes).
¿Cómo se determina este valor y que
información nos entrega?
Gen
Muestra Gen blanco housekeeping
(HK)
Ct P53 Ct GAPDH
Normal 15,0 16,5
Tumoral 12,0 15,9
¿Cómo se calcula el ∆Ct?
1. ∆Ct = Ct (muestra) – Ct (normalizador)
2. Luego se calcula el ∆∆Ct con un calibrador
que corresponde al mismo gen analizado
que se expresa en un tejido (ejemplo) de
referencia: ∆∆Ct = ∆Ct (muestra) - ∆Ct
(calibrador).
3. Finalmente se calcula la expresión relativa:
Expresión relativa = 2-∆∆Ct
• Paso 1: Normalizar Ct del gen blanco al Ct
del HK.
∆Ct normal: 15-16,5 = -1,5.
∆Ct tumor: 12-15,9 = -3,9.
• Paso 2: Normalizar ∆Ct de la muestra al ∆Ct
del HK.
∆∆Ct = -3,9 – (-1,5) = -2,4.
7 KAROL SANHUEZA S/JAIME VILLEGAS | PCR en tiempo real
• Paso 3: Ahora calcular las veces de cambio
de la expresión del gen de interés.
2-∆∆Ct= veces de cambio normalizada.
2 – (-2,4) = 5,3.
Por lo tanto, el 5,3 son las veces de cambio en
la cual P53 se expresa.
Considerando que el SYBER Green se puede
unir a dímeros de partidor o a fragmentos
inespecíficos, por lo tanto, debemos
asegurarnos que las sondas no hibriden entre
ellas y esto se logra haciendo curvas de
disociación mediante las sondas Taqman.
Sondas Taqman
Este sistema es específica para la secuencia
blanco.
Posee un reportero (R) fluorescente en el
extremo 5’ y un quencher (apagador) (Q) en el
extremo 3’.
Cuando el reportero se libera exhibe
fluorescencia (señal) proporcional a la
cantidad de producto amplificado.
Para liberar el reportero es necesario la hidrolisis
de la sonda, por lo cual es el tipo irreversible.
El reportero emite fluorescencia y lo lee el
equipo, pero en el otro extremo se encuentra el
quencher el cual emite fluorescencia que el
equipo no lee. Por lo tanto, cuando la sonda
Taqman este intacta, ambas moléculas (R-Q) al
estar tan cercanas que la fluorescencia de la
molécula reportera es absorbida por el
quencher apagándola, por lo tanto, el equipo
no va a captar la fluorescencia.

En la imagen vemos el ADN de doble hebra,
ocurrió la etapa de desnaturación en donde
están separadas las hebras, vemos que un
primer se unió a una hebra y otro primer a otra
hebra, en esta misma etapa se une la sonda
Taqman por complementariedad de bases solo
a una de las 2 hebras.
Luego en la etapa de extensión la ADN
polimerasa va incorporando nucleótidos y va
avanzando. Cuando llega a la sonda
comienza a romper, es decir, presenta una
enzima que se llama exonucleasa la cual
rompe los nucleótidos mientras avanza la ADN
polimerasa.
Como vimos en la imagen ambas moléculas (R-
Q) estaban juntas, pero lo que ocurre ahora es
que la molécula reportera queda distante del
quencher y su fluorescencia no será apagada
por él, sino que será detectada por el equipo y
la leerá como positiva. Es decir, efectivamente
la ADN polimerasa está elongando, por lo
tanto, se está sintetizando ADN.
Finalmente la ADN polimerasa sigue
avanzando, destruyendo por completo la
sonda Taqman, por lo tanto, esta sonda es de
tipo irreversible.
Por lo tanto, se produce fluorescencia solo si se
está amplificando el fragmento del quencher,
8 KAROL SANHUEZA S/JAIME VILLEGAS | PCR en tiempo real
porque en este lugar se encuentra el azúcar
(alta especificidad).
Ventajas:
➢ Alta especificad, se puede realizar PCR
múltiple.
Desventajas:
➢ Costo y optimización.
Ejemplo de uso de 2 sondas taqman para
detectar polimorfismos de 1 nucleótido (SNP)
Podemos ver el ADN de doble hebra, primer
forward y el primer reverse. Lo que se quiere
investigar es que si en esta posición la hebra
que se va a unir tiene una citosina (se une a la
guanina) o si en la misma posición tiene una
timina (se une a la adenina).
¿Cómo discrimina entre una y otra?
La sonda Taqman tiene una molécula reportera
que va a reportar en verde y la otra va a
reportar en azul. Entonces si tiene una guanina
se va a leer en verde y si tiene una timina se va
a leer en azul. Por lo tanto, el equipo debe ser
capaz de leer tanto en verde como en azul.
Luego va ocurriendo la reacción de la PCR que
es la desnaturación en donde se unen los
partidores con sus respectivas hebras, la ADN
polimerasa va a ir incorporando nucleótidos y
en la misma etapa en que se unen los
partidores se va a unir la sonda de taqman y
esto va a depender de si en la hebra hay una
citosina se va a unir la sonda de guanina, o si
hay una timina se unirá la sonda de la adenina.
La nueva hebra se comienza a sintetizar, la ADN
polimerasa avanza y la lectura de la
fluorescencia es en verde. Por lo tanto, esta
hebra (citosina) se unió con la sonda del Ejemplo: Perfil de expresión de BRCA1.
nucleótido guanina.
• BRCA1 es un gen involucrado en supresión
de tumores, controlando la expresión de
otros genes.
Aplicaciones en diversos campos como
industria, investigación, clínica.
Ejemplos de uso de qPCR: Evaluación de la
expresión génica, cuantificación carga
microbiana en alimentos, detección de OGM,
diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Tipo de fluoróforo Aplicaciones

Cuantificación
Taqman
general
Detección de SNP,
Taqman MGB discriminación Ejemplo: Tratamiento de VIH.
alélica
Detección SNP, • El tratamiento de
screening genético, la infección por
Molecular Beacon VIH depende del
aplicación
farmacogenética monitoreo de la
Detección SNP, carga viral.
haplotyping, • RT-PCR permite la
Scorpion cuantificación
discriminación
alélica directa de la
cantidad de virus en un paciente.
Cuantificación
SYBR Green • Se realiza PCR absoluto (monitorea la carga
general
viral).

Ejemplo: Determinación del porcentaje de

Análisis de expresión génica GMO en un alimento en particular.
➢ Investigación en cáncer. • Determinación del porcentaje de alimentos
➢ Investigación en drogas. GMO es importante para las
Diagnóstico y manejo de enfermedades importaciones/exportaciones.

➢ Cuantificación de carga viral.

Testeo de alimentos
➢ Porcentaje de alimentos GMO
(organismos genéticamente
modificados).
➢ Crianza de animales y plantas.

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