Resumen Técnicas BM

Primer Parcial - Biología Molecular
ESTUDIO Y DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

Técnicas indicadoras de mecanismos asociados a la regulación de la expresión
génica:
1) Unión del factor de transcripción al promotor (u otra región del ADN): ChIP, EMSA.
2) Actividad del promotor: genes reporteros.
Métodos para la evaluación de la expresión génica

(1) Individuales: para analizar la expresión génica de un número acotado de genes.
Northern Blot, RT-PCR, RT-qPCR (cuantitativa).
(2) Globales: analizar la variación en la expresión génica de grandes poblaciones de
genes o de todos los genes presentes en el sistema biológico en el que se trabaja.
Microarray, RNA-seq.
- Sondas: son secuencias cortas de DNAsc que se unen a su secuencia

complementaria y son detectables. Molécula radiactiva, fluorescente o reconocible
en forma específica.
Métodos de marcación
(1) Incorporación de nucleótidos marcados durante la síntesis: (el fosfato marcado tiene
que ser el alfa ya que el beta y gamma se pierden en la síntesis, necesito una
polimerasa)
-Sondas de fragmentos de DNA: Random primers (Klenow/DNApol) son cortos y se pegan
inesp.
Marcación por PCR (Taq/DNApol)
-Marcación para microarrays: Marcación de los cDNAs de la muestra con fluoróforos
(2) Incorporación de marca sobre ADN sintetizado:
-Sondas de oligonucleótidos: Marcación de extremos 5’ o 3’.
TdT transfiere bases del dNTP que puse al 3’, debe estar marcado el fosfato alfa, agrega
cola de A.
RT-PCR
Estudio de la expresión génica (mRNA) porque el producto de PCR que obtenemos es
proporcional al templado utilizado (cDNA).
-RT: mRNA extraído => (retrotranscripción) cDNAsc
-PCR: amplificación exponencial
Las estrategias para la amplificación mediante RT-PCR varían según los primers que se
usan para la síntesis de la primera cadena de cDNA (R etroT
r anscripción).
(1) Oligo dT: para retrotranscrir todos los mRNAs presentes en la muestra. No es
práctico para genes largos (alejados del 3’), en esos casos conviene random primer.
(2) Específico: se retrotranscribe el gen de interés y otros que tengan la misma
secuencia.
(3) Random: se retrotranscribe todo el RNA unido de mi muestra. Se obtienen
fragmentos de mRNAs, independientemente de la longitud de los genes.
=> Una vez obtenido el cDNA por alguno de estos protocolos, se utiliza como templado para
una reacción de PCR estándar.
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Los productos de PCR son separados por electroforesis y teñidos con BrEt (Bromuro de
Etidio)
Diseño y controles: primers, intrones, RNA DNAsa, no input, housekeeping.
Real Time PCR o quantitative PCR (qPCR)

-Retrotranscripción seguida de qPCR: RT-qPCR. PCR en tiempo real.
-Sistemas de detección:
(1) Agentes fluorescentes intercalantes: SYBR Green I.
(2) Sondas específicas marcadas con fluorocromos: Método *Taqman es un
oligonucleótido marcado (sonda) que se une a la región a amplificar.
-Análisis de qPCR: los primers deben amplificar en forma eficiente (2n)
-Determinación del valor umbral (Threshold). Punto de inflexión del log de las curvas.
=> RT-PCR clásica (de punto final) es más común y la usamos cuando queremos saber si
un gen está o no, si expresa o no mutaciones, y para ver diferencias en electroforesis.
qPCR es más costoso, se usa para medir expresión en tiempo real y medir la intensidad en
cada ciclo.
Análisis de qPCR
El threshold o umbral (punto de inflexión del log de las curvas) surge de pasar los datos de
la corrida desde escala logarítmica (donde hay un punto de inflexión) a auto scale (le quito
la escala logarítmica), el punto de inflexión se vuelve la línea umbral. El ciclo de threshold
es en el cual se alcanza el umbral.
Análisis Global de la expresión génica

Microarray
Se depositan los productos de PCR en forma ordenada en una plataforma de vidrio de
manera de poder asociar la composición con el nombre del gen depositado. Sirve para
estudiar muchos genes evitando usar muchos primers).
Se pueden depositar genes pertenecientes a otras librerías para poder tener en el array la
mayor cantidad de genes representados posibles y que este sea útil para cualquier estudio.
PCRs de la colección de cDNAs se depositan sobre vidrio (printing) armando un microarray
o chip de cDNA.
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Tipos principales de microarrays para estudiar expresión génica (formas de armar

microarrays)
(1) DNA microarrays: DNA o cDNA proveniente de una library y depositado sobre un
soporte sólido (vidrio tratado).
(2) Microarray Oligonucleótidos (AFFYMETRIX): oligonucleótidos directamente
sintetizados in situ sobre el soporte sólido.
Al leer la fluorescencia puede haber genes que no se expresan en las muestras, genes que
se expresan en ambas muestras en forma similar, genes que se expresan más en la
muestra control y genes que se expresan más en la muestra tratada. Cuando emite
fluorescencia verde y roja por igual, se ve amarilla.
RNA-Seq
Basado en la secuenciación (método de Sanger).
-Secuenciación en capilares
-Desarrollo de métodos que no necesitan separación por electroforesis:
(1) terminadores reversibles o sequencing by synthesis: permiten volver a secuenciar
sobre la misma molécula.
(2) Pirosecuenciación: detección de incorporación de bases por liberación de PPi.
-Plataformas de secuenciación de la próxima generación
-Secuenciación masiva (“Illumina”)
-Aumento en la cantidad de datos obtenidos por corrida
Uso de RNA-seq para determinación de la expresión génica (vs microarray)

Ventaja Desventajas
No se requiere una plataforma específica del Costos

organismo a estudiar
Más sensibilidad Análisis de datos y herramientas bioinformáticas en

desarrollo
Resolución a nivel de pares de bases Gran complejidad en el manejo de los datos

generados
Menos background (más reproducible)
Entrega de datos más detallados:

-Secuencias
-Splicing alternativo
-Fusiones génicas
-Expresión específica de alelos
-Detección de nuevos sitios de iniciación de
transcripción (nuevos promotores)
-RNA editing
-RNAs no codificantes
-sense and antisense transcripts
=> Si tengo una muestra de un organismo poco conocido conviene usar RNAseq porque no
necesito una plataforma previa como en el caso de microarrays.
Técnicas asociadas a secuenciación masiva

Material a secuenciar Método
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DNA genómico total DNA-seq
DNA genómico asociado a una proteína específica ChIP-seq
mRNA (RT a cDNA) RNA-seq
mRNA de Run on (RT a cDNA) GRO-seq
TÉCNICAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA INTERACCIÓN DNA-PROTEÍNA

(1) Interacción in silico: programas de análisis de promotores: indica puntos de unión de
promotores.
(2) Interacción in vitro: -EMSA/Band shift/ Gel shift
-DNAse footprinting: protección de DNA frente a DNAsa por pegado de una proteína
(permite saber cuán cerca está el sitio de unión de 5’ o 3’).
(3) Interacción in vivo: -Screening en levaduras (Y-1-H: Yeast one hybrid), identifica una
proteína capaz de unirse a una secuencia dada.
-ChIP (PCR, Chip, Seq)
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Aislo los clones que sobreviven al antibiótico, obtengo los plásmidos que pertenecen a la
library e identifico el inserto por secuenciación.
ChIP: Chromatin ImmunoPrecipitation

Se utiliza para estudiar interacciones DNA-proteína. Se basa en purificar una proteína
conocida asociada a la cromatina para luego cuantificar el DNA asociado a ella o identificar
el fragmento de DNA desconocido asociado a ella.
1) Se fijan las células con formaldehído 1% para
causar el crosslink entre DNA y proteínas.
2) Se recogen y sonican las células para crear
fragmentos de DNA genómico de 0,5-1kb.
3) Se incuban con un Ac específico contra la
proteína de interés y se purifica el complejo
DNA/proteína mediante inmunoprecipitación.
4) Se revierte el crosslink entre el DNA y la
proteína y se purifica el DNA.
5) Si se conoce el fragmento de DNA se analiza
por qPCR o PCR. Se amplifica con primers
diseñados a los lados de los sitios de
interacción. Como control de especificidad se
usan primers de una región lejana a la que estoy estudiando.
6) Si no se conoce se puede identificar sobre un chip de microarray: ChIP on chip, o
por secuenciación: ChIP-seq. ChIP on chip: Sobre el chip están depositadas
secuencias de DNA genómico conocidas en posiciones determinadas. Esto hace
que se puedan identificar los fragmentos de DNA que fueron purificadas junto con la
proteína.
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Se realizan múltiples controles con distintos anticuerpos luego de purificar. Input es control
de la PCR, es antes de purificar, y donde no este es porque no hay DNA, no porque la PCR
no funcione.
SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN BACTERIAS Y LEVADURAS
BACTERIAS
E. coli
1) Tamaño de la proteína: <100 aminoácidos: más estables como proteínas de fusión.
>100 aminoácidos: inestables, van a cuerpos de
inclusión.
-Cuerpos de inclusión: son agregados insolubles intracelulares. Ruptura células
(sonicación)--- solubilización y refolding (Urea 8 M)---Diálisis
2) Cantidad de proteína:
-Poca cantidad para screening de mutantes con vectores de expresión standard.
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-Grandes cantidades: Explorar varios sistemas-huésped y esquemas de purificación.

3) Proteínas activas: considerar la formación de cuerpos de inclusión y modificaciones
post-traduccionales.
Proteínas expresadas en E. coli

1) Proteínas de fusión: Región que codifica una proteína “tag” fusionada en marco de
lectura a la región que codifica para la proteína target.
a) Amp: cassette de resistencia a antibiótico, permitirá seleccionar las bacterias que

reciban el vector.
b) Ori: origen de replicación, permite la replicación del vector y la segregación durante
la división celular para que todos tengan el vector (clones).
c) Promotor: hay varios tipos.
d) RBS: región del DNA que permite el ensamblado del ribosoma para traducir lo que
esté 10 nucleótidos río abajo de ese sitio.
e) ATG: +1 de traducción respecto del RBS.
f) A: región que codifica para el epítope de traducción o TAG. Es una región de la
secuencia de proteína que codifica para un dominio con una función enzimática o
dominios que permitan expresar esa proteína y que trasloque a espacio
periplásmico, extracelular, etc.
g) B: secuencias consenso para corte con una proteasa. Permite separar el epitope de
la proteína de interés.
h) MCS: sitio de clonado múltiple, permite elegir enzimas adecuadas para el clonado
direccionado.
Entre GST (proteína de fusión) y la proteína hay un sitio para corte con proteasa. Se puede
pasar por una matriz sólida (resina) que tenga unido glutatión, permitiendo unir por afinidad
la GST transferasa y por ende la proteína de interés. A través de un lavado se elimina lo
que no se quiere. Esta purificación puede resolverse de dos maneras: un exceso de
glutatión compite liberando la proteína libre, o puede cortar con la proteasa.
Optimización de expresión de proteínas en Coli

(1) Iniciación de la traducción: RBS Ribosome Binding Site
La secuencia está a -10 nucleótidos del AUG (que codifica para metionina +1). Sólo
funciona en bacterias.
(2) Uso de codones: El código genético es redundante (61 codones para 20 aa).
Algunos codones usados infrecuentemente=↓[RNAt ]
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(3) Estructura del mRNA: Región del codón de iniciación AUG en extremo 5’ del mRNA
(permite que se pueda anclar el ribosoma).
(4) Cepas deficientes en proteasas endógenas: Lon y OmpT. Minimiza la degradación y
mejora el objetivo que es obtener la proteína pura.
Elección del promotor

(1) La organización génica en bacterias es en operones. Un promotor está coordinando la
expresión de varias proteínas que tienen que ver con determinada actividad biológica. En el
operón lac tenemos un promotor y río abajo la expresión de tres proteínas: la primera es la
beta galactosidasa que permite la degradación de la lactosa a glucosa y galactosa. Este
operón permite la metabolización de la lactosa, entonces el agregado de lactosa a bacterias
permite la activación de sus enzimas degradativas. Se expresa la beta-gal, una permeasa y
una isomerasa cuya función no se conoce.
El promotor está fuertemente regulado por dos elementos, en la bacteria uno es el operador
(secuencia nucleotídica q contiene el +1 de la transcripción) a donde se une el represor lac,
y la unión de estos inhibe la transcripción.
La proteína CAP unida a cAMP estabiliza a la polimerasa para que sea eficiente la
transcripción. Entonces debe haber dos eventos: q el represor se vaya y que se una CAP.
IPTG es una molécula parecida a un inductor de operón pero que no requiere lactosa, y no
puede ser degradado, entonces va a permitir la expresión siempre. Actualmente el promotor
tiene una modificación en el promotor a nivel de nucleótidos para ahora hacer que la
polimerasa pueda unirse eficientemente sin la necesidad de CAP.
Lac Iu (represor LAC) es una versión mutante de Lac I que se sobreexpresa, es para tener
un exceso de represor para que todas las copias de vector están saturadas por represor,
para evitar la expresión en cualquier momento del crecimiento de la bacteria.
T7 promoter: si al templado lo tratamos con RNApol viral puede usar eso para iniciar
transcripción en un sentido y en otro.
- Alfa complementación: el lacz que está en el vector no es el completo, es la porción
amino terminal o carboxilo terminal (la parte faltante esta aportada por el genoma
bacteriano o por otro plasmido). Está separado en dos que al reconstituirse dan dos
dominios con actividad. El beneficio de no tenerlo completo es que te da más
espacio para meter fragmentos.
(2) Promotores tac y trc: 3x más fuertes que trp y 10x más fuertes que lac
- Híbrido de promotores lac (lacUV5) y trp (triptofano)
- Regulado por el represor lac
- Independiente de la regulación por cAMP
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-Mal E: secuencia señal epitope de la proteína Maltosa Binding Protein (MBP).

=>Proteína de fusión: MBP+proteína de interés. En el medio se puede cortar con proteasa.
El plásmido expresa una proteína de fusión que nos permite decidir si la proteína va a
espacio periplásmico o citoplasma. Para que vaya a espacio periplásmico se usa la
señalización aminoacídica que tiene el epitope de MBP, y permite que de la versión P se
exprese y vaya a espacio periplásmico.
PTAC es regulado por IPTG. El vector sobreexpresa el represor, reprimiendo al promotor
tac. El promotor tiene un terminador de la transcripción bacteriana que permite generar un
mRNA hasta un punto en que se interrumpe por una secuencia terminador de la expresión
bacteriana sacado del operón que codifica para RNAr bacterianos.
(3) Promotores basados en el gen 10 del bacteriofago T7:

Todos los promotores del fago T7 (incluído el gen 10) requieren la T7 RNA Polimerasa para
expresarse.
Se usa el sistema pET cuando se quiere evitar la expresión de la proteína de interés, tiene
varios cerrojos para evitar la expresión hasta que agreguemos el IPTG. Suele usarse
cuando la proteína de interés es tóxica para la proteína que se está produciendo.
Doble híbrido en bacterias

Expresión de un sistema que permita analizar la interacción proteína-proteína. Hay dos
vectores coexpresados en la misma bacteria y cada uno de ellos codifica para dos proteínas
de fusión. La primera es una que tiene en una porción amino terminal un dominio de una
proteína viral que se puede unir a un operador, es el dominio de binding a DNA. La otra
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proteína de fusión que va a expresar la bacteria tiene en su región amino terminal una
proteína target o la que nos interesa, fusionada a RNApol. Si existe interacción entre
ambas, esa permite formar el complejo en el que la pol puede posicionarse para estimular la
transcripción de dos genes reporteros. Uno es el cassette de expresión a Amp y el otro es el
lacZ. Sólo creceran las colonias en las que hay interacción.
Problemas cuando se expresan proteínas eucarióticas en cél procariotas:

- Inestables.
- Sin actividad biológica.
- Contaminantes procarióticos.
LEVADURAS
Saccharomyces cerevisiae
- Económico, bioseguro para aplicaciones humanos.
- Posee características bioquímicas, genéticas, similar a eucariotas superiores.
- Es adaptable a fermentación gran escala.
- Herramienta para estudios de complementación.
- Rápido crecimiento, bajo costo similar a E. coli.
- Modificaciones postraduccionales esenciales para la función proteica.
- Problema (difieren de eucariotas superiores): forma de N-glicosilación y
O-glicosilación: uso de levaduras con N-glicosilación humanizada.
Vectores de levaduras
- Yip: Se llaman integrativos porque no tienen origen de replicación, es decir que no

se van a mantener como un episoma dentro de la levadura. Suelen tener cassette de
ampicilina y origen de replicación bacteriano, que permiten pasarlos a bacterias
(vectores shuttle). Hay cassette de selección por auxotrofia y por resistencia a
drogas. Los cassette de selección por auxotrofia complementan la deficiencia que
tiene la levadura por auxotrofia, como URA3. Si plaqueo la levadura en un medio sin
uracilo no crece, pero si lleva el gen URA3 wt se vuelve de autotrófica para uracilo
prototrofica para el mismo (puede sintetizar ella misma el nucleótido y sobrevivir en
un medio que no le aporte exógenamente el uracilo).
Para sobreexpresar se usan promotores fuertes como GAL, requiere galactosa, la glucosa
es represiva. Para la integración en el genoma se usa el cassette URA3 que tiene una
marca para enzima de restricción. Se integra luego de cortar por doble recombinación en el
cromosoma. Las que integraron el vector se vuelven URA-. Puedo seleccionar las que
integraron usando un medio que mate URA3 wt.
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- Yep: tiene un origen de replicación de plásmidos originales de las levaduras (2μ) que
permiten un alto nro. de copias del vector dentro de la levadura. Se mantiene como
episoma.
- YCp: vector centromérico que permite darle estabilidad. El origen de replicación
autónomo ARS permite tener 1 o 2 copias por célula.
pYES TOPO es un vector T episomal, tiene un promotor GAL, hay epítopes para proteínas
de fusión, tiene un terminador de la transcripción proveniente de la levadura con señal de
terminación y poliadenilación.
SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN EUCARIOTAS SUPERIORES

Expresión de proteínas
- Sistemas de expresión in vitro
- Sistemas de expresión en bacterias
- Sistemas en céls. eucariotas inferiores
- Células de mamífero, insecto
- Organismos complejos in vivo (ratones, bovinos, ovinos, peces, plantas, etc)
Expresión en céls. de mamíferos

Ventajas Desventajas
Adecuado procesamiento de preRNA Tipo de duplicación 18-24hs y varios meses en

animales
Mejores niveles de procesamiento proteico Mayor dificultad para cultivar

-Formación de S-S (ER)
-Glicosilación (ER + Golgi)
-Control de calidad (ER)
Correcto plegamiento de la proteína Bajo rendimiento relativo
Condiciones de cultivo más costosas
Introducción de DNA en las células

- La introducción de DNA en células procariotas y levaduras se llama
TRANSFORMACIÓN
- La transformación de células eucariotas superiores se refiere a cambios en las
características del cultivo celular
- Se llama TRANSFECCIÓN a la entrada de DNA foráneo a las células de mamíferos
Métodos para introducir DNA a las células

- Transfección por métodos bioquímicos: formación de complejos que depositen
(a) mediada por fosfato de calcio
(b) mediada por DEAE dextrán
(c) mediada por liposomas
- Métodos físicos: más eficientes pero más complicados
(a) electroporación
(b) microinyección
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(c) biobalística
(d) ultrasonido
(e) hidroporación
- Transducción mediada por virus: 3 barreras
Tipos de transfección
(1) Transfección transitoria o transiente (24 a 72hs)
- Plásmido que no replica
- Permanencia momentánea con pérdida en los sucesivos ciclos de división celular o
por muerte celular
- Gen a proteína en días
- No requiere selección
- Bajo rendimiento
(2) Transfección estable insercional
- Se seleccionan con drogas tóxicas cuya resistencia está codificada en mismo vector
u otro vector
- El ADN se inserta en algún cromosoma
- Gen a proteína en más de 2 meses
- Complejo
- Alto rendimiento (de 1 a 5mg/L o más)
- Stock de células que expresan proteína recombinante
Transfección estable: agentes de selección

- G418: bloquea la síntesis de proteínas.
- Higromicina B: inhibe la síntesis de proteínas en procariontes y eucariontes.
- Puromicina: inhibe la síntesis de proteínas; puromicina-N-acetiltransferasa (gen
bacteriano PAC) inactiva a la puromicina por acetilación.
- Aminopterina: impide la síntesis de dTTP a partir de dCTP; gen de la timidina kinasa
en células TK.
tas
Vectores de expresión en células eucario
- Elementos para clonado en bacterias
(a) ori de replicación
(b) marcador de selección bacteriano
(c) sitios múltiple de clonado
- Elementos específico de vectores eucariontes
Elementos específicos de vectores eucariotas

- Elementos necesarios:
(a) Promotor eucarionte
(b) codón ATG (secuencias Kozak)
(c) Señal de poliadenilación
- Otros elementos:
(a) Intrón
(b) Tags-proteína de fusión
(c) Marcador de selección para células eucariontes (para transfecciones estables)
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(d) Segmentos de DNA para recombinación homóloga, etc.
Promotores eucariotas
La mayoría de los vectores poseen promotores de origen viral
Constitutivos: son reconocidos por la RNA polimerasa celular.
- Específicos de tejido: operan selectivamente en tipos particulares de células
- Inducibles: utilizados para controlar el encendido y el apagado de la expresión
- Mínimos: se utilizan para el estudio de elementos regulatorios de genes, como
enhancers
Secuencia de Kozak
La secuencia donde se une el ribosoma en eucariotas se denomina consenso de Kozak y
se localiza en el UTR 5’.
GCCGCC(A/G)CCAUGG
Las purinas A o G en posición -3 y G inmediatamente después del codón AUG son las que
permiten la óptima iniciación de la traducción.
Intrones
- Suelen incrementar de 10-20 veces los niveles de expresión de la proteína.
- No son imprescindibles
- Algunas secuencias (cDNA de beta globina) tienen el requerimiento de la presencia
de un intrón.
- El más utilizado es un intrón del virus SV40.
Vectores dicistrónicos
- Posee un sólo promotor
- 2 genes para una misma unidad transcripcional
- Se sintetiza un sólo mRNA
- Necesita un sitio interno de unión al ribosoma
- A ambos lados de MCS hay IRES (Internal Ribosome Entry Site) que proviene del
genoma del virus de mamíferos encephalomyocarditis virus (ECMV)
Sistemas Inducibles
- Vitales para la expresión de proteínas tóxicas
- Bajos niveles de expresión basal
- Alto nivel de inducción de la proteína de interés que es reversible
- Rápido sistema de switch on/off
- No muestran efectos pleiotrópicos sobre células huésped
=> Promotores inducibles
- Tet inducible por tetraciclina
- OLac inducible por IPTG
- Metalotioneína inducibles por metales pesados
- GAL4-E1b inducible por mifepristona
Sistema regulado por tetraciclina
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- La transcripción es bloqueada por homodímeros del represor TetR unidos a las

secuencias del operador (TetO2)
- La transcripción se produce cuando la tetraciclina se une a los dímeros de TetR
provocando un cambio conformacional y se liberan de las secuencias del operador
TetO2.
Sistemas Regulables por Tetraciclina
tTA: tc Trans-Activator
rtTA: reverse tc Trans-Activator
Estrategia de Genes Reporteros

Los genes reporteros son genes que codifican para proteínas de simple detección. Se usan
para reemplazar productos génicos difíciles de medir y determinar actividad promotor.
Coloco el gen de interés río arriba del reportero.
=> Características de un buen reportero:
- Ausente en el huésped
- Simple, rápido, sensible y económico
- No alterar la fisiología de las células
Genes reporteros
- CAT (cloramfenicol acetiltransferasa): enzima bacteriana, transfiere grupos acetilos
marcados 14C o 3H al cloramfenicol. La detección se da por cromatografía en capa
delgada. Lento. Vida media aproximadamente 50hs.
- LacZ (beta galactosidasa): Bacteriana. Hidroliza sustrato incoloro (ONPG) para dar
producto amarillo que se cuantifica. Mayor vida media que luciferasa
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- SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase): Ensayo de fosfatasa

alcalina bioluminescente. Muy sensible.
- LUC (luciferasa): Oxida a la luciferina emitiendo fotones. Los fotones se cuentan en
un luminómetro o una cámara de recuento de fotones (in vivo). Hay diferentes
luciferasas disponibles. Vida media aproximadamente 3hs.
- GFP (green fluorescent protein): fluorece por irradiación con UV - se observa con
microscopio de fluorescencia.
Vectores para analizar secuencias promotoras

El primer vector tiene dos señales de corte y poliadenilación, el que está a la derecha de
Amp’ bloquea cualquier transcripción que pueda venir de ese lado. El segundo vector es un
control interno del experimento.
Para estudiar la actividad de un promotor hacemos transfección transiente porque el
experimento es corto.
Vectores Virales
Infecciones virales para introducir ADN en células
- Ventajas: alta eficiencia de incorporación de ADN asociada a la alta eficiencia de
infección. Se utilizan cuando: (1) Se necesita una alta eficiencia de expresión del
transgen. (2) Los cultivos son difíciles de transfectar por técnicas no virales.
- Desventajas: Laborioso (lleva más tiempo realizarlo), riesgo biológico (controlado en
las técnicas más frecuentes).
Utilización infecciones virales para introducir ADN en células

(1) En células de mamíferos:
- Retrovirus (MMLV y lentivirus)
- Adenovirus
- Virus adeno-asociados
(2) En células de insectos:

- Baculovirus
Vectores basados en Retrovirus

- Virus con envoltura
- Genoma: RNA cadena simple (10kb aproximadamente)
- Se integra al genoma de la célula (previa transcripción reversa)
=> Los más utilizados:
- Mammalian Type C: Moloney Murine leukaemia virus (MMLV). Para la integración en
el genoma es necesario que la célula infectada pase por mitosis (ruptura de la
membrana nuclear).
- Lentivirus: Human Immunodeficiency virus (HIV1). La llegada del ADN al núcleo es a
través de poro nuclear. No requiere ruptura. Integración en células quiescentes y en
proliferación
MMLV
Tiene sólo 3 genes: gag, pol y env
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- gag: codifica para proteínas de la cápside

- pol: transcriptasa reversa
- env: proteínas de la envoltura
Long terminal repeats (LTRs): promotor/seq involucradas en la integración/sitio de
poliadenilación.
Construcción del vector viral MMLV

Se reemplazan los tres genes del genoma del virus por nuestro cDNA
Células empaquetadoras:
- Pueden ser células previamente obtenidas o compradas que expresen en forma
estable gag-pol-env
- Pueden ser células que se convierten en empaquetadoras por la co-transfección de
gag-pol-env a la vez que el vector retroviral
- env: es responsable del tropismo y muchas veces viene en vector separado para
que se pueda elegir la env necesaria para cada experimento (hacen que infecten
distintos tipos celulares depende el tipo, por eso suelen venir en vectores separados
de gag y pol)
- gag y pol: se usan siempre las misma
El virión debe traer su transcriptasa reversa.
Vectores lentivirales virales evolucionados

Vector lenti-X: delta gag-pol-env
- 5’LTR y 3’LTR del HIV1
- Señal de empaquetamiento
Otros elementos que contribuyen a aumentar la eficiencia:
- RRE (HIV1): Rev response element. Se une la proteína. Rev: exportación del RNA
del núcleo al cit para empaquetamiento.
- cPPT/CTS (HIV1): tracto de Polypurina/Central Termination Seq - importación del
cDNA de HIV al núcleo: integración y transcripción.
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- WPRE: (woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element):

promueve el procesamiento y maduración del RNA (terminación y polyA), aumenta la
exportación nuclear del RNA viral: aumenta la expresión del gen de interés.
- P CMV- MCS: (P PGK puromicina: seleccionar células que expresan GOI).
Adenovirus
- Virus sin envoltura
- Genoma: DNAdc lineal de 35kb
=> Vectores basados en Adenovirus:
- Se pueden expresar genes en células de mamíferos (mitóticas y no mitóticas)
- Expresión transitoria, se replica como episoma (no se integra al genoma)
Hay genes importantes para la replicación que no pueden estar en la partícula viral con la
que yo infecte (los tres listados).
Vectores virales basados en adenovirus

Genoma Ad: grande => gen se clona en vector shuttle (MCS-pCMV) y se transfiere al
pADEasy (genoma Ad delta E1-E3) por recombinación homóloga con E. coli.
Otros: Cre-LoxP, Gateway.
pShuttle:
- ITRs: Inverted terminal repeats
- ES: Encapsidation Signal
- pCMV: promotor constitutivo fuerte
- MCS
- Tag (FLAG o HA)
- IRES: Internal Ribosome Entry Site => mRNA bicistrónico: expresar la proteína de
interés y GFP (Verificar la expresión)
- SV40 polyA: sitio de poliadenilación del virus SV40 (terminador)
- Seq para recombinación homóloga (Pmel)
- Ori y Kan: clonado en coli.
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Virus adeno-asociados
- Son parvovirus humanos no patogénicos
- Sin envoltura
- Genoma: DNA de cadena simple (4,7kb)
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- Ausencia de virus helper (adenovirus): integra al genoma (no produce viriones:

latencia)
- Dependen de un virus helper para hacer ciclo lítico y replicar
Vectores basados en virus adeno-asociados

- Expresar proteínas en células de mamíferos (quiescentes y en división)
- Expresión transitoria o estable
Rep: proteínas para la replicación e integración

Cap: proteínas de la cápside
ITRs: inverted terminal repeats: origen de replicación, señal de empaquetamiento,
integración
Construcción del vector viral

Para la producción de AAV recombinantes la célula empaquetadora tiene que aportar:
-rep y cap
-genes del adenovirus helper (E1a, E1b, E2a, E4 y VA RNA)
Vectores virales basados en AAV

-pAAV: ITRs del virus
Gen de interés bajo pCMV/intrón beta globina: +eficiente (mayor estabilidad del mRNA);
sitio de poliA, IRES-GFP, Ampi r, ori de replicación en coli.
-pAAV-RC: rep-cap (genes deletados en AAVrec)
-pHelper: genes adenovirus E2A y E4 (AAVrec en cel emp) y VA RNAs (non coding RNAs
que promueven la traducción de proteínas virales evitando la respuesta celular de eIF2)
19
Expresión de proteínas en células de insectos

Baculovirus => obtener grandes cantidades de una proteína pura
Ventajas del sistema baculovirus
- Modificaciones postraduccionales:
(a) puentes disulfuro
(b) fosforilación
(c) glicosilación
(d) oligomerización
(e) folding correcto
(f) clivaje proteolítico
- Alto nivel de expresión (25-50% del total de prot)
- Sistema escalable de mL a L
- No patogénico para mamíferos y plantas
Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV)

- con envoltura
- Virus que infecta insectos
- Genoma: 135kb - DNAdc - circular CCC (muy grande p/clonar directamente)
Baculovirus (AcMNPV) => 2 formas
Sistemas de expresión de proteínas basado en Baculovirus

- AcNPV => vector para expresar el gen de interés
- Líneas celulares: Sf9-Sf21
Sistemas de Baculovirus:
- BaculoGold (BD Biosciences)
- BacPak (Stratagene): similar al BaculoGold
- BaculoDirect (Invitrogen): Gateway
INTERACCIÓN PROTEÍNA-PROTEÍNA
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Se pueden evaluar in vitro que implica ensayos de interaccion entre dos proteínas
purificadas. Existen tambien ensayos in vivo que están basadas en poder purificar a una de
las dos y ver si la otra viene asociada en forma indirecta. Y la de transferencia de energia
que es una forma de evaluar que dos proteínas están suficientemente cerca como para que
haya transferencia de energía (FRET y BRET). Luego hay interacciones que tambien
pueden hacerse más a nivel de screenning o utilizando modelos como levaduras y
mamiferos.
Purificación de proteínas
La proteína GST (glutation S transferasa) junto con sefarosa comercial q tiene unido
glutation. Entonces lo que reconozca glutation (GST) unido a la proteína de interés queda
pegado. Existen otros TAG faciles de purificar que se usan tambien para purificar.
21
Debo usar el vector justo con GST que me genere la proteína de fusión con la de interés.
Debe generarse una proteína fácil de pescar. Del otro lado debe estar la otra proteína que
queremos saber si se pega o no, y lo mejor es que no compartan el mismo TAG entonces
hago el control en el Western donde hago detección con Ac anti X o incube con una
proteína X radioactiva y revelo. Siempre corro también una muestra antes de la purificación
para corroborar que habia proteina.
Inmunoprecipitación y purificación por afinidad (in vivo)

La diferencia es que en IP necesito un Ac para revelar, en purif. por afinidad no. Se usa
sefarosa unida a proteína A que pega anticuerpos. Queremos saber si la prot. de interés
interactúa con x in vivo. X proviene del organismo. Hago un western para ver si esta x en el
material precipitado de PdI. Hago un control con un Ac no inmune que no reconoce PdI para
ver que X no deviene (control de especificidad). Se pueden usar Ac anti TAG para modificar
(ahora seria purif. x afinidad).
22
23
24
El complejo que más se utiliza es tomar el inmunoprecipitado y correrlo en un gel, luego

teñir proteínas inespecificamente, se cortan las bandas que veo y las separo en tubos. Se
hace MS para identificarlas. Hay muchas tecnologias, entre ellas MALDI TOF.
Las purificaciones en tándem se hacen cada una con criterios diferentes para sacarme de
encima cosas que no quiera traer, debo usar dos TAGs, uno lo purifico por una
caracteristica y el otro por otra. Tiene un sitio de corte para una proteasa especifica entre un
TAG y el otro.
FRET
Es tener la idea de que dos proteínas se unen porque están muy cerca. Se hace por una
transferencia de energía de resonancia. Para que se pueda medir esa transferencia se hace
entre fluoróforos. Ej: marco una proteína verde (con GST por ejemplo) y otra roja, si excito a
la verde veo rojo porque se transfirio la energia. Sólo se puede ver esa transferencia a
distancias muy cortas (alrededor de los 10 angstroms). Debe estudiarse de que lado debe
ponerse la proteína de fusión para que hagan efecto FRET. Es complicado ya desde la
preparacion de las construcciones.
Sirve para ver condiciones capaces de anular el efecto FRET (anulo la interacción).
BRET
25
Doble Híbrido
Ejemplo: quiero expresar en un vector dominio de unión al DNA y en otro de activación de
una misma proteína. Veo cuándo hay transcripción.
26
Utilización de Y-2-H para buscar proteínas capaces de unirse a PdI
Pico todos los azules y me hago el stock de todas las potenciales interacciones (porque
probe contra library). Tener en cuenta que algunos de los libraries quizas no entran en el
marco de lectura, pero siempre se escaparan algunas cosas, los screenings no son muy
cuidados, son globales. Debo identificar las azules entonces debo pescar el plasmido que
esta en la levadura y que codifica para la proteína de la library, entonces ambos plásmidos
27
de origen poseen resistencias diferentes por lo que sacaremos los plásmidos haciendo algo
parecido a una miniprep. Luego transformamos bacterias.
Conociendo al fago se sabe que proteínas son presentadas hacia afuera por estos.
Tenemos nuestra proteína de interés sobre una matriz, ejemplo en una columna, entonces
cuando pasa el fago, alguno expone una de la library que interactua y queda retenida.
Luego se lo eluye o corta y tendre la columna con mi proteína y la que interactua. Puedo
luego hacer que el fago infecte una bacteria e identificarlo.
Aprovecho un sistema entre dos proteínas que formen puente disulfuro. Aprovecho el vector
para que la levadura exprese esa proteína y que quede expuesta.
28
Bibliotecas y Secuenciación
BIBLIOTECAS DE cDNAs Y GENOMICAS
BIBLIOTECA DE cDNA
Es una combinación de fragmentos de cDNA clonados en vectores insertados en una
colección de células huésped que constituyen una porción del transcriptoma de un
organismo. (Sin intrones).
Pasos principales para producir una biblioteca de

cDNA
(1) Obtener mRNA: elección del tipo de células o
tejidos y las condiciones (tratamiento, etapa del
desarrollo)
(2) Retrotranscribirlo: mRNA a DNA (cDNA). La

retrotranscripción genera un cDNA simple cadena (no
es clonable).
(3) Sintetizar la segunda cadena: para producir un

cDNA clonable
(4) Modificar sus extremos con sitios para ERs: para

generar fragmentos clonables en vectores adecuados
(5) Ligar y transformar célula huésped
(1) OBTENCIÓN DEL mRNA

1°: extracción de RNA total (RNA ribosomal, de tranferencia y mRNA)
2°: Se aisla específicamente mRNA desde su poliA mediante:
- columna oligo-dT celulosa
- bolitas (beads) magnéticas-oligo-dT
(2) Síntesis de la primera cadena de cDNA a

partir de mRNA:
DNA polimerasas RNA dependiente:

- ALV (Avian Leukosis Virus)
- MoMLV (Moloney strain of Murine
Leukemia Virus)
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Para hacer la segunda cadena, se reemplaza la cadena de RNA por DNA, se hace por
reemplazo: se usa unA RNAsa H de coli que va cortando el RNA en distintas partes
generando nicks, la pol se une y los usa como primers. Copia hacia adelante y va comiendo
(exonucleasa). En la mezcla también hay una ligasa que va ligando los nicks. Cuando
termina la reacción se van completando los extremos tratando el cDNA con una T4
polimerasa que va llenando los 5’ protruyentes y digiere 3’ protuyentes, dejando extremos
romos.
Hay una manera de enriquecer la muestra de cDNA en cDNAs que son completos. Esto es
porque cuando uno hace la retrotranscripción con el método anterior, como se arranca
desde el poliA (nosotros usamos un poliT), a veces la retrotranscriptasa no llega hasta el
extremo 5’ y el mensajero queda incompleto. En muchos casos esto no es un problema
pero hay muchas aplicaciones para las cuales quizás uno quiere obtener cDNAs completos
que lleguen hasta el 5’. Se pueden usar métodos como CAPture que aprovechan el CAP
que tienen los mensajeros en el 5’.
Entonces se extraen los mensajeros, se sintetiza la 1era hebra. Puede pasar que se
sintetice por completo o no si la transcriptasa se cae. Una vez que hago la RT se trata esta
muestra con RNAsa A, esta digiera RNAs que están en simple cadena pero no a los que
están doble cadena.
Los que tienen CAP son los que estarán completos, y lo aprovecho para purificar estas
hebras a través de una columna que tenga proteínas que unan el CAP o un Ac anti-CAP, y
pego los mensajeros que se retrotranscribieron por completo a la columna, luego los eluyo.
30
Una vez que tengo el cDNA doble cadena debo agregarle adaptadores para poder ligarlos a
los vectores. Los adaptadores que se ligan tienen extremos como si estuvieran predigeridos
por ER (extremos cohesivos). Ambos extremos deben ser para la misma ER para un
clonado no direccionado.
31
Modificación de los extremos del cDNA para el clonado -II

CLONADO DIRECCIONADO:
Se usan ER para digerir el cDNA. Cuando se hace una digestión con ERs se debe proteger
los cDNAs, ya que seguramente la ER elegida cortará varios de ellos en su interior.
Para hacer clonado direccionado la síntesis de cDNA sera distinta. Si usara una ER para
digerir una library, habra sitios de corte y puede cortarse en lugares no deseados, la library
ya no serviria, entonces debo protegerla con metilacion. Cuando se hace la primera hebra,
uso un nucleotido metilado (con uno es suficiente). Usamos 5 metil dCTP y el resto
normales, pongo en el primer un sitio de corte de XhoI. Luego hago un reemplazo para la
segunda hebra con RNAsa H, polimerasa, ligasa, etc (como antes). Luego de digerir
agrego adaptadores pre digeridos como primers que agregan sitios de ER como EcoRI.
Esto permite hacer clonado direccionado.
32
Para clonar el cDNA se usan vectores derivados del fago lambda, porque son fagos que
justamente infectan coli, y la infección es un método mucho más eficiente que
electroporacion o metodos quimicos para llevar el vector adentro de la bacteria. Son
complicados de manejar comparados con un vector común. Son el genoma del fago
modificado, se le quita una region que no es necesaria para la replicacion del fago y se
pone alli el fragmento de cDNA a clonar. Una vez que tenemos todo el cDNA de la library
ligados en los vectores, se hace una version de empaquetamiento in vitro en donde uno
compra la capside y las colas de los fagos y sus enzimas, y esto hace que cada uno de los
vectores del fago recombinante se empaqueten en esas capsides, y generamos una
biblioteca de fagos lambda que son recombinantes (cada uno lleva un pedacito de cDNA de
la library), listos para infectar coli.
Estos vectores están modificados para que siempre hagan un ciclo litico en vez de
lisogenico. Entonces mata la bacteria y se obtienen playas de lisis en vez de colonias en el
medio, donde hay playas de lisis es porque un virus infecto a la bacteria y la mato, y eso es
un clon de la library.
En los extremos del DNA del fago están los sitios cos que son cohesivos uno con otro, y
cuando el fago infecta la bacteria inyecta el DNA que con los sitios cos forma una especie
de plasmido que se replica (forma replicativa del virus).
Cuando clonamos en estos

vectores tenemos el vector que
es genoma de fago lambda
modificado, que tendra un MCS
en el medio. Se corta y se liga el
DNA, y en la reaccion de ligacion
se puede ligar, ademas del DNA,
un sitio cos de un fago con el otro
formando concatemeros. Durante
la reaccion de empaquetamiento
el fago reconoce el sitio cos, lo
corta y empaqueta en la capside
toda esa porcion hasta el
siguiente sitio cos. Alli corta y
continua el siguiente fago.
En la figura se observa que los
dos primeros incorporaron DNA,
y el tercero no, es como si se
hubiera religado. De un cos a otro
hay poca distancia en DNA y el
fago no lo puede empaquetar por
ser muy poco.
33
Cuando uno tiene todos los fagos se tratara de amplificar la library para volver a utilizarla
porque es muy caro. Entonces se infectan colis en varias placas, se espera que aparezcan
las playas de lisis y se colectan todos los fagos y se guarda la library original.
Luego tomo una alicuota de la library y puedo utilizarla infectando coli, vuelvo a formar
playas de lisis y estara lista para usar.
34
Hoy por hoy habiendo tantas especies secuenciadas ya casi no tiene utilidad de biblioteca.
Si quiero aislar o clonar un gen de una especie que no ha sido secuenciada, puedo primero
jugarme a diseñar primers de una especie emparentada que ya haya sido secuenciada, y
levantarlo por RT-PCR. Si no puedo hacerlo no me queda otra que hacer biblioteca.
Ejemplo: quiero aislar un gen de una especie no secuenciada como la berenjena, entonces
puedo buscar (screening) cuales de esos clones tienen esa secuencia utilizando una sonda
radioactiva o marcada con un fluoróforo que la sintetizo a partir de ese gen en un organismo
cercano como la papa. Entonces con esa sonda marcada escaneo mi library de berenjena.
Hago replicas de las playas de lisis en membranas de nylon a donde se pega el cDNA de la
library. Esas membranas se hibridan con la sonda, se hace autoradiograma y busco cuál
era la playa de lisis que tiene el clon positivo.
Otra forma de hacer screening de la library es mediante la expresion de todas las proteínas
que están en esos fagos. Eso se hace cuando uno utiliza fagos en los que se clona el cDNA
bajo un promotor inducible por IPTG (Lac) => el clonado debe ser direccionado. Se embebe
la membrana que apoyare sobre la placa para levantar los fagos en IPTG. Induzco la
expresion de las proteínas del clon. La membrana que ahora tiene proteínas puede ser
screeniada por un anticuerpo contra la proteína de interés, y lo detecto con un segundo
anticuerpo marcado.
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El Triplex es un vector que se compra, con sitio cos, MCS, el cDNA se clona bajo un
promotor inducible por IPTG, etc. Se hace ligación y empaquetamiento in vitro, se infecta
coli y obtengo las playas de lisis y hago screening: por inmunodetección o por una sonda de
DNA marcada. Una vez que identifique el clon positivo, lo que se puede hacer para
recuperar es escindir un vector del fago que se llama PTriplex. Esto se hace porque el fago
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tiene sitios de recombinación que se llaman loxP. Estos sitios se puede recombinar con la
recombinasa cre, o entre sitios loxP y lo hacen circular, entonces puede incorporarse en
bacterias que corten en ese sitio.
El plasmido puede replicar en bacterias formando colonias y se pueden seleccionar con
ampicilina. Una vez que tengo el fago positivo, infecto una cepa de coli que expresa una
recombinasa del fago P1cre para poder escindir este vector. Las colonias que crezcan
tendran el fago adentro.
Una de las curiosidades del Triplex es que puede expresar las proteínas en sus tres marcos
de lectura posibles. El mRNA tendrá dos sitios distintos de unión al ribosoma, la traducción
del mensajero que contiene mi cDNA puede empezar en dos sitios distintos, leyendo en dos
marcos de lectura distintos. Pero además tiene pedazos de la secuencia con muchas T que
hacen que el ribosoma cometa errores y patine una a tres bases, o ninguna. Cada uno de
los marcos de lectura se puede correr entonces uno o dos codones y generar cada uno
aparte 3 marcos de lectura. Con esto se aseguran que todas las proteínas posibles se
expresen en ese clon.
Hacer una library es muy laborioso y costoso, así que hoy practicamente no se usa.
BIBLIOTECAS GENÓMICAS
Colección de fragmentos de DNA que representan todas las secuencias de un genoma los
cuales son clonados en un vector que puede ser usado y mantenido establemente.
Aplicaciones:
* Secuenciación de genomas: hoy por hoy se suelen usar secuenciadores para sec. cortas.
* Clonar promotores/genes en especies no secuenciadas
Requerimientos de una buena biblio genómica:

* Fácil de analizar, almacenar, amplificar y estable.
* Representación completa.
* Representación superpuesta del genoma (clones superpuestos).
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=>digestión con ER en posiciones al azar: digestión parcial: fragmentos al azar del DNA
completo.
Representación completa del genoma

- Pocos clones: muy poca probabilidad de encontrar el fragmento de interés. (primera fila)
- Más clones: más sitios del genoma representados. Clones son al azar y superpuestos:
algunas partes del genoma están sobrerrepresentadas mientras que otras no aparecen.
(Segunda fila)
- Número suficientemente grande de clones: certeza de que todo el genoma está
representado (todas las partes del genoma están representadas al menos en 1 clon).
Tercera fila.
=> Para genomas pequeños puedo usar fosmidos pero para genoma humano o de otro
mamífero debo usar un PAC o BAC que tienen más capacidad porque sino el número de
clones es inmanejable.
Preparación de DNA genómico de alto peso molecular

Objetivo: Purificar DNA genómico (eliminar proteínas y contaminantes) empleando métodos
que eviten su fragmentación mecánica.
En promedio se utiliza 3-4 veces fragmentos más largos que el que voy a clonar porque
despues lo tengo que digerir, se rompera en la purificacion.
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Debo hacer digestión parcial para no obtener fragmentos cortos con los que no pueda
reconstruir la secuencia. => obtengo fragmentos largos superpuestos. Las enzimas que se
usan mucho para este tipo de digestión son Sau3AI y MboI, estas reconocen un sitio de 4
bases y aumenta la frecuencia de corte dentro del genoma (1/4n) siendo n el nro de bases
que reconocen. Entonces 1/256 bases habrá un sitio de corte => más frecuentemente.
Además los sitios cohesivos que generan son compatibles con BamHI.
Una vez que hice la digestion con ER debo hacer un fraccionamiento por tamaño para
quedarme con los tamaños que corresponden al tamaño que yo tengo que clonar en el
39
vector que elija. Luego de la digestion con ER obtengo un chorreado y selecciono la zona
de tamaños adecuados para el vector.
Entonces debo separar el DNA uso electroforesis de campo pulsatil, la electroforesis
convencional no separa fragmentos de más de 50kb, entonces uso este tipo que hace que
la direccion del campo electrico cambie continuamente => Cuando el DNA cambia la
direccion se puede separar porque las moléculas más chicas se moveran más rapido que
las grandes. Si repito esto todo el tiempo aprovecho los milisegundos iniciales de cambios
de direccion para ir separando. Siempre se hace un pulso forward y uno reverse para darle
una direccion neta. Entonces hago el forward un poco más largo que el reverse. Esto tarda
mucho pero se separan.
Luego selecciono de la electroforesis las bandas que me sirven para el vector. Luego por
electroelución disuelvo el gel y precipito el DNA.
VECTORES PARA BIBLIOTECAS GENÓMICAS

Vectores que más se utilizan para bibliotecas de DNA genómico. Esto no suele utilizarse, se
manda a hacer. El vector que más suele utilizarse es el cosmido, que es un hibrido entre
40
fago lambda y un plasmido. Se empaquetan en capsides para despues infectar coli y hacer
la library. Es muy eficiente la transferencia del DNA.
Lo unico que tiene del fago lamda son los sitios cos. Entonces para la bacteria sólo es un
plasmido, y hace que esta crezca en forma de colonia, no playa de lisis.
Si hay muchas copias hay muchas probabilidades de eventos de recombinación => se

pierde la estabilidad de la library. Mejores que cosmidos por elemento F que en la
naturaleza es el que va de una bacteria a otra y transfiere propiedades, manteniendose en
una sola copia por celula.
El cosmido no tiene los elementos del plasmido F sino un ori de alto nro de copias.
El oriV se puede inducir cuando se quiere generar mayor nro de copias del gen. Se usan
bacterias que expresen gen trfA que induce alto nro de copias.
41
Otros vectores que se usan mucho son los PACS que son los cromosomas artificiales
derivados del fago P1. Toman replicones del fago P1. Su ventaja respecto a los fosmidos es
que tienen una capacidad mayor y tienen mayor estabilidad para el DNA clonado porque
tambien permiten mantener una copia por celula y tambien se puede aumentar el nro de
copias cuando se requiera. Se clona el vector digiriendo con BamHI que esta flanqueando
Puc19-link que tiene un sitio de transcripción de alto nro de copias. Cuando digiero con
BamHI saco ese sitio.
El vector por default funciona con el replicon plasmidico del fago P1, que cuando infecta
bacterias y hace un sitio lisogenico no se integra al DNA sino que se mantiene como
plasmido circular. Usando naturalmente su replicon plasmidico logra tener una copia por
bacteria en PACs. A su vez tiene el replicon litico del fago P1 que se usa cuando se quiere
infectar y matar la bacteria. Ese replicon es inducible por IPTG. Si quiero que las bacterias
tengan mayor nro de copias induzco por IPTG.
El Puc19-link esta interrumpiendo un gen que se llama sacB, que es un gen suicida. Si una
bacteria recibe el plasmido religado (sin cDNA) se muere, el medio debe tener 5% de
sacarosa, para que sacB genere un compuesto toxico y mate a la bacteria.
Cuando uno hace el clonado, llega este vector, se amplifica, se corta con BamHI y se
defosforila el vector y despues el DNA genómico se digiere con BamHI, se selecciona por
tamaño y se hace la ligacion y la electroporacion en coli. Se seleccionan las recombinantes
en medio conteniendo kanamicina y 5% de sacarosa.
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Los cromosomas artificiales bacterianos (BACs) tambien mantienen una copia por celula
porque tiene los mismos elementos que el fosmido, eso hace que tenga estabilidad. El MCS
tiene Hind y BamHI que están interrumpiendo un gen lacZ para el screening. Se corta el
vector con HindIII y se defosforila, se corta el DNA de alto peso molecular, se digiere con
HindIII, se selecciona por tamaño en electroforesis de campo pulsatil, se liga y se
transforma coli. Se hace la seleccion en cloranfenicol y se agrega IPTG para ver colonias
blancas y azules. Las azules se descartan y las blancas se ordenan en placas de 96 wells.
El anterior es un BAC más moderno al que se agrega el CopyControl. El oriB al cuál se

pega la proteína Trfa mutante para marcar el nro de copias. Estas son las mismas bacterias
que copyconytrol pero se usa este BAC. Una vez que se obtienen las colonias se agrega el
copy control y se induce mayor nro de copias.
43
Luego se hace un screening de biblioteca genomica cuando la especie de interés no esta

secuenciada y no hay ninguna parecida, etc.
Se obtienen los clones positivos y se debe secuenciar, pero los insertos que están dentro
pueden tener hasta 300pb.
Los screenings se pueden hacer de la misma manera. Las placas de 96 wells en donde
tengo las colonias de la library son usadas por un robot para picar las colonias. Cada clon
de la library es identificado con un nro de placa, nro de fila y nro de columna. Uno puede
screeniar esas bibliotecas por dos metodos, uno es la hibridación clásica con una sonda
marcada que puede estar diseñada contra un exon conocida o un gen relacionado
evolutivamente. Se piden las membranas de nylon donde están pegados los clones listos
para hibridar. Se tira la sonda, y se buscan los spots positivos. Se sabe que clon se spotea
en cada lugar.
En el caso dos de hacer un screening por PCR, se tienen que mandar al facility los primers
para que hagan la PCR, se manda a screeniar. Se combinan clones para ir haciendo PCRs
de a grupos de placas. Luego se hacen PCR por filas/columnas, etc. hasta identificar el clon
positivo.
44
Las bibliotecas genomicas representan el genoma de un sólo organismo, las

metagenomicas son bibliotecas en donde se clona el DNA genómico de un conjunto de
microorganismos. En vez de cDNA se llama eDNA por “environmental” DNA. Uno toma un
ecosistema dado y aisla el DNA de una comunidad de microorganismos. Son comunidades
que viven en consorcios y no pueden aislarse, no pueden vivir aisladas.
Se extrae DNA genómico, y se clona para armar la biblioteca usando por lo general
fosmidos (cosmidos), pero tambien se pueden encontrar en BACs. Este tipo de biblioteca
permite la busqueda de compuestos de interés farmacologico como por ejemplo
antimicrobianos. Tambien se buscan actividades enzimaticas, etc.
Una vez que tenemos esta biblioteca se pueden secuenciar directamente todos los clones y
subir la información del metagenoma x. Lo más interesante es que con estas bibliotecas se
45
pueden hacer screening funcionales buscando productos. Por ejemplo, haciendo ensayos
en placas de agar buscando antimicrobianos, etc.
Una vez que se encuentra el clon positivo se debe secuenciar el inserto de ese clon que
seguramente sea largo, porque para un compuesto se necesitan varios genomas. En
microorganismos suelen estar ordenados en clusters que codifican una via metabolica que
sintetiza el compuesto.
El screening en top agar permite poner el biblioteca en el agar de abajo y en el de arriba el
antimicrobiano, en donde haya un halo habra un cluster de genes que inhiba el crecimiento
de ese microorganismo.
Luego de un screening hay que secuenciar.
SECUENCIADORES
Debe decidirse como secuenciar en función de que interés se tenga. Se parte de insertos
muy grandes producto de screening. El secuenciador clasico al que todos tenemos acceso
es la secuenciacion de sanger que es el metodo de los dideoxinucleotidos que son los
terminadores de la elongación. Es un metodo en el cuál se utilizan estos terminadores que
no tienen oxidrilo en 3’ y entonces se corta la síntesis. Lo que se hace es extender el primer
en una reaccion que tiene los dNTPs normales y los ddTps que son los terminadores
marcados con un color. Cuando empieza la reaccion de elongacion de la polimerasa se
empieza a extender, puede elegir un nucleotido normal y seguir o poner un ddTP y terminar.
Al terminar la reacción con todas las mezclas, se separan en capilares por tamaño todos los
productos. Al final del capilar hay un lector de fluorescencia que va leyendo los colores.
Cuando tengo por ejemplo un BAC de 300.000pb y quiero saber la secuencia de un

promotor que son 2000 o 3000 pb puede usarse el secuenciador de sanger, pero lo que se
hace es cortar ese BAC en pedacitos más chicos mecanicamente. Todos esos pedacitos se
ligan a cualquier vector que pueda replicar en bacterias. A todas esas bacterias se les hace
otro screening más para identificar el fragmento que a mi me interesa. Luego esos clones se
secuencian por sanger, corriendo de a poco la secuencia hasta obtener la de interés. Debe
46
usarse sanger para este tipo de cosas. Para BACs mucho más grandes se usan
secuenciadores de proxima generación pero son muy caros.
Si se quiere secuenciar un BAC completo o un clon de metagenomica (todo un cluster de
genes que genera un compuesto), o un genoma chico sin usar bibliotecas, se usan los de
next generation. Estos secuenciadores pueden hacer muchas más pares de bases que
sanger, como el de Roche, el Ilumina, el Nanopore, etc.
El genoma o BAC que quiero secuenciar se corta en pequeños fragmentos y se secuencian
todos simultaneamente.
Para el pirosecuenciador, se fragmenta en pedazos pequeños y se agrega a cada uno un

adaptador A a un extremo y uno B al otro, que son secuencias conocidas, pero no se ligan.
El agregado es un proceso muy complejo que implica transposones, no es simplemente
pegar. Una vez que se tiene esto se genera una biblioteca de DNAsc con A de un lado y B
del otro. Cada uno de estos pedacitos se pega a una bolita que tiene adaptadores
complementarios a alguno de los que agregué, por hibridacion habra un clon por bolita.
Luego se hace en cada bolita una PCR que se hace en una emulsion de agua y aceite. En
la parte acuosa queda una bolita con todos los reactivos para PCR. En cada bolita se
amplifica el fragmento muchas veces. Luego se cargan las bolitas en microplacas que
tienen capacidad para una bolita por well y alli se hace la pirosecuenciación.
47
48
49
50
MANIPULACIÓN DE LA EXPRESION GENICA EN MODELOS ANIMALES DE

EXPERIMENTACION
51
Todas tienen en comun que si queremos hacer un animal modificado, debe modificarse una
celula primordial para que durante el desarrollo vaya formando parte de todo el animal.
52
53
54
El RNAi esta asociado con la degradacion de RNA tándem. Hay dos formas de generar
interferencia: con siRNA o shRNA.
55
El shRNA se compra o se produce mediante un plasmido.
Si queremos generar un siRNA en un vector, no lo clonamos y amplificamos por PCR

porque:
1) No existe el templado
2) El amplificado es casi grande como el primer.
=> Directamente se manda a comprar los dos oligos que imagino para el producto que
quiero obtener, y se los aparea in vitro aplicando calor y enfriando lentamente, debemos
fosforilarlos in vitro.
Normalmente se tienen promotores para RNA pol III que codifican para RNA pequeños: U6
small nuclear RNA, 7SK RNA y H1 RNA.
Cuando se habla de RNA de interferencia no se dice knock out sino knock down (tanto in
vivo como in vitro no se puede asegurar que la salvedad hecha deje el RNA en cero. Los
triangulos verdes se llaman secuencias ploxP y se usan porque existe una recombinasa
especifica que elimina todo lo que esta en el medio de esa secuencia, y es la forma que
usaron para que el promotor funcione o no porque tiene el inhibidor en el medio.
En nuestras construcciones de transgen podemos posteriormente eliminar partes. Existen
construcciones condicionales que en un momento el RNAi no se expresa, luego de usar la
recombinasa CRE desaparece el inhibidor y vuelve a funcionar.
PloxP son dos secuencias palindromicas separadas por un spacer de 8pb.
56
Antes lo complicado era lograr la modificacion y el reemplazo. Se inventaron secuencias y

recombinasas para eliminar los fragmentos no deseados.
Lo que se llaman modificaciones constitutivas quiere decir que el raton tiene

constitutivamente perdida o ganada esa region. El grupo condicional quiere decir que la
perdida o ganancia la quiera manejar en el momento que necesite. Existen los que son
inducibles por alimento por ejemplo, o los tejido especifico: afecta sólo un tejido pero no
mata al raton.
En eucariotas superiores debe forzarse la recombinación homologa poniendo secciones de

alta homologia.
tk = transcribe timidina kinasa.

Si entra random entra todo el fragmento, si entra como recombinación homologa, entra de
azul a azul. Se pone en un extremo tk, entonces si entra random se incluye tk, y por
recombinación se pierde. Se pone como agente de seleccion. Cuando ponemos G418
toxico que se degrada por neo r. Se pone calciclovir antiviral que es un analogo de base que
57
la tk cuando lo fosforila lo hace tri fosfato y puede ser tomado por una DNA pol y se traba la
síntesis, la celula muere. Si hay tk la celula muere.
gas1 es un ORF sin intrones, raro en eucariotas superiores, es facil de eliminar entero por
ende. Se metio neoR y lacz en gas1. En el screening se usan dos sondas, que reconocen la
zona del transgen y wt, dando dos fragmentos de distinta longitud en función de donde cae
el sitio de ecoRI donde se pega la sonda. Cuando uso una sonda contra Neo sólo reconoce
al fragmento más largo. Esto se puede hacer por PCR con un primer fuera de la zona de
recombinación y otro dentro.
58
Las células KO derivan del raton KO. Se obtienen de fibroblastos embrionales.
59
Son similares las dos tecnicas, ZFN se basa en hacer mutaciones en los dominios de unión
al DNA, si a esto le uno una nucleasa, se puede hacer un corte en el lugar deseado. TALEN
es similar sólo que los dominios de unión al DNA son más naturales y tienen activadores
60
transcripcionales con zonas hipervariables que reconocen determinadas bases segun los aa
que tienen.
Los aa 12 y 13 son los hipervariables, si los modifico logro que me reconozca un par de
bases. Cuando se hace un corte llega la maquinaria de reparacion, si esta cortado y no
tiene de quien copiar, pone cualquier DNA (in/del), entonces se corren los marcos de
lectura, se introducen stops, etc. Si ofrezco un DNA que repare, se da la recombinación
homologa.
61
DNA sintetico que codifica para modulos que reconocen la secuencia a knockear, asociado
a nucleasa. En CRISPR en lugar de modulos hay RNA corto. Lo que lleva a la nucleasa a
efectuar el corte es el RNA corto. La nucleasa es CAS9 que lleva el RNA azul, que
reconoce la secuencia. Quien guia la nucleasa al sitio es el RNA. La parte de RNA rojo
sujeta a CAS9.
62
Se tiene un vector que transcriba el RNA azul porque el rojo ya esta en el vector, se le pone
un promotor U6. El promotor de cas9 es CMV (viral fuerte). Tambien lleva un marcador de
seleccion y un Ori.
63

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Primer Parcial - Biología Molecular

ESTUDIO Y DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA

Métodos para la evaluación de la expresión génica

- Sondas: son secuencias cortas de DNAsc que se unen a su secuencia

Real Time PCR o quantitative PCR (qPCR)

Análisis Global de la expresión génica

Tipos principales de microarrays para estudiar expresión génica (formas de armar

Uso de RNA-seq para determinación de la expresión génica (vs microarray)

No se requiere una plataforma específica del Costos

Más sensibilidad Análisis de datos y herramientas bioinformáticas en

Resolución a nivel de pares de bases Gran complejidad en el manejo de los datos

Menos background (más reproducible)

Entrega de datos más detallados:

Técnicas asociadas a secuenciación masiva

DNA genómico total DNA-seq

DNA genómico asociado a una proteína específica ChIP-seq

mRNA (RT a cDNA) RNA-seq

mRNA de Run on (RT a cDNA) GRO-seq

TÉCNICAS PARA LA EVALUACIÓN DE LA INTERACCIÓN DNA-PROTEÍNA

ChIP: Chromatin ImmunoPrecipitation

SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN BACTERIAS Y LEVADURAS

-Grandes cantidades: Explorar varios sistemas-huésped y esquemas de purificación.

Proteínas expresadas en E. coli

a) Amp: cassette de resistencia a antibiótico, permitirá seleccionar las bacterias que

Optimización de expresión de proteínas en Coli

Elección del promotor

-Mal E: secuencia señal epitope de la proteína Maltosa Binding Protein (MBP).

(3) Promotores basados en el gen 10 del bacteriofago T7:

Doble híbrido en bacterias

Problemas cuando se expresan proteínas eucarióticas en cél procariotas:

- Yip: Se llaman integrativos porque no tienen origen de replicación, es decir que no

SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN EUCARIOTAS SUPERIORES

Expresión en céls. de mamíferos

Adecuado procesamiento de preRNA Tipo de duplicación 18-24hs y varios meses en

Mejores niveles de procesamiento proteico Mayor dificultad para cultivar

Correcto plegamiento de la proteína Bajo rendimiento relativo

Condiciones de cultivo más costosas

Introducción de DNA en las células

Métodos para introducir DNA a las célul​as

Transfección estable: agentes de selección

Elementos específicos de vectores eucariotas

(d) Segmentos de DNA para recombinación homóloga, etc.

Sistema regulado por tetraciclin​a

- La transcripción es bloqueada por homodímeros del represor TetR unidos a las

Sistemas Regulables por Tetraciclina

Estrategia de Genes Reporteros

- SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase): Ensayo de fosfatasa

Vectores para analizar secuencias promotoras

Utilización infecciones virales para introducir ADN en células

(2) En células de insectos:

Vectores basados en Retrovirus

- gag: codifica para proteínas de la cápside

Construcción del vector viral MMLV

El virión debe traer su transcriptasa reversa.

Vectores lentivirales virales evolucionados

- WPRE: (woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element):

Vectores virales basados en adenovirus

- Ausencia de virus helper (adenovirus): integra al genoma (no produce viriones:

Vectores basados en virus adeno-asociados

Rep: proteínas para la replicación e integración

Construcción del vector viral

Vectores virales basados en AAV

Expresión de proteínas en células de insectos

Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV)

Métodos para introducir DNA a las células

Sistema regulado por tetraciclina