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MICROBIOLOGIA CLINICA
Profesor:
Boris Barrera V.
Estudiantes:
Natalia Jara F.
Esteban Díaz C.
Agentes
Intercalantes
• SYBR Green I
PCR EN TIEMPO REAL
Sondas de Hibridación Específicas Agentes Intercalantes
PCR EN TIEMPO REAL
SONDAS TAQMAN
• Poseen un fluoróforo en su
extremo 3' y una molécula en
el 5' que bloquea su emisión
de fluorescencia «quencher»
esta sonda marcada híbrida
específicamente en la parte
central del producto de PCR a
obtener.
PCR EN TIEMPO REAL
Moléculas Beacons
• Consta de una única sonda que tiene
secuencias complementarias entre sí para
formar una estructura de horquilla están
conectados dos moléculas. Uno de ellos es un
fluorocromo. La estructura de horquilla se
acerca, las dos moléculas entre sí. En
presencia de luz de longitud de onda
apropiada fluorocromo en un extremo que se
activa, pero no emite luz, como la pantalla de
capturar su energía.
PCR EN TIEMPO REAL
Sondas FRET
• RT-PCR
1. Amplicor HIV-1
-400-750.000 copias/ml
2. RT-PCR real time (Roche)
- COBAS TaqMan,
FRET, Beacons
3. Light cycler /TaqMan probe HIV-2
5-500.000 copias/ml
160; 89 bp fragment of gag gene
Amplicor HIV-1
• RT PCR
• Consta de 5 pasos:
1. Preparación del especimen
2. PCR de transcriptasa reversa: Se genera un DNA complementario (cDNA) desde la
molécula de DNA viral del HIV-1
3. Amplificación por PCR: Amplificación por PCR normal con primers específicos
para el cDNA producido.
4. Hibridación de los productos amplificados a sondas de oligonucleótidos
específicos
5. Determinación colorimétrica de los complejos (Sonda-DNA amplificado)
mediante una reacción enzimatica (se agrega una enzima – peroxidasa- que se
une a esta secuencia, tras un lavado y remoción de aquella que no haya sido
conjugada, se agrega un sustrato –peroxido de hidrogeno- para generar la
reacción)
Métodos de determinación
• Genotipificación VIH
• Resistencias a fármacos retrovirales (RAMs)
• VIH-1: 9 subgrupos A-J
• Chile: Predominancia VIH-1 tipo B
• RT-PCR
-ViroSeq™ HIV-1 genotyping system
-TRUGENE® HIV-1 genotyping system (transc. Reversa)
• Otros:
1. Antigenemia viral
2. Determinación de p24
Métodos de determinación
• Otros:
1. Antigenemia viral
2. Determinación de p24