Ingeniería Genética

Profesor: Dra. Candy Yuriria Ramírez Zavaleta

candyyuriria.ramirez@uptlax.edu.mx
Bibliografía

Published by Wiley-Blackwell 2
Published by Garland Science
Molecular Biology of the Cell. 4th edition.
Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.
New York: Garland Science; 2002.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21054/?term=molecular%20biology%20of%20the%20cell
Published by Jones & Bartlett Learning
 Bibliografía

• Cabrera José L., Sánchez Angel H. 2010. Texto ilustrado de biología molecular e ingeniería genética. Elsevier.
Madrid. ISBN 978-84-8174505-4.

• De Robertis Eduardo D.P., Hib José. 2009. Fundamentos de biología celular y molecular de De Robertis, 15ª
edición. El Ateneo. Argentina. ISBN 950-02-0414-2.

• Karp G. y Van Der Geer P. 2005. Biología molecular y celular, 4ª edición. McGraw Hill. México. ISBN
9701053761.

• Primrose S.B., Twiman R.M. 2006. Principles of gene manipulation and genomics, 7ª edición. Wiley Blackwell.
USA. ISBN 978-1-405-13544-3.

• Soberón F. J. 2002. Ingeniería genética, la nueva biotecnología y la era genómica, 3ª edición. Económica.
México. ISBN 9789681664336.

6
 Contenido temático

Unidad I. Herramientas de la Ingeniería Genética

1. Enzimas de restricción

2. ADN polimerasas, PCR, retro transcriptasa y RT-PCR

3. Vectores de clonación

Unidad II. Manipulación de ácidos nucleicos

1. Vectores de expresión

2. Sistemas de expresión de proteínas recombinantes

7
Unidad III. Tecnología del ADN recombinante

1. Mutaciones, mutagénesis y técnicas de mutagénesis

2. Organismos modificados genéticamente

8
Composición del Ácido DesoxirriboNucleico (ADN)
 La doble hélice del ADN

T
A

C G

T A

C
G
 Composición del Ácido RiboNucleico (ARN)

 El RNA es de una sola cadena

 La Timina (T) se reemplaza por Uracilo (U)
 El azúcar es Ribosa (no Desoxiribosa)
Unidad transcripcional

12
1. Enzimas para la manipulación de ácidos nucleicos

13
Nucleasas
Hidrolizan ácidos nucleicos mediante la rotura de una unión éster del enlace
fosfodiéster entre nucleótidos adyacentes en la cadena de polinucleótidos. Ej.
endonucleasas y exonucleasas.

ADN Polimerasas
fosfatasa
Sintetizan/polimerizan ácidos nucleicos mediante la formación de un enlace
endonucleasa
fosfodiéster entre nucleótidos adyacentes. Ej. DNA polimerasas y RNA
polimerasas.
nucleasa

Fosfatasas
Monoesterasas que hidrolizan un enlace éster unido a un fosfato de un nucleótido
terminal. Se requieren en algunos casos de clonación p/desfosforilar plásmidos
cuando se clona un inserto en un vector con 1 solo sitio de restricción.

ADN ligasas
exonucleasa
Enzimas que catalizan la unión de un enlace fosfodiéster entre 2 moléculas de
ADN.
14
 Descubrimiento de las enzimas de restricción (ER)

A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid

J. D. Watson and F. H. C. Crick
April 25, 1953, Nature, 171, 737-738.

70’s
Arber W. Las bacterias contienen enzimas que cortan el ADN de los fagos, evitando su replicación viral.
Smith H. Aislamiento de HindIII, la primera ER usada en la clonación del ADN.
Nathans D. Construcción del primer mapa genético del ADN del SV40 que produce tumores.
15
Enzimas de restricción = Endonucleasas de restricción Exonucleasas
(ER ) endo <dentro de> Cortan a partir de los extremos de las
nucleasa <enzima cortadora de ácido nucleico>. secuencias de ADN.

Cortan enlaces fosfodiéster

Las ER cortan en secuencias

específicas de bases =
secuencias de restricción.

16
 Tipos de enzimas de restricción

Tipo Características Ejemplos

I El sitio de reconocimiento y corte son diferentes y EcoKI
generalmente no son palíndromos. El sitio de corte puede EcoAI
estar a 1000 pb del sitio de reconocimiento. Deja extremos CfrAI
cohesivos.

II Tipo más común. Su sitio de reconocimiento y corte es el EcoRI

mismo y es un palíndromo inverso. La longitud de sus sitios BamHI
es de 4 a 8 pb. Deja extremos cohesivos o romos. HindIII

III El sitio de reconocimiento y corte son diferentes y EcoPI

generalmente no son palíndromos. El sitio de corte está de HinfIII
20 a 30 pb del sitio de reconocimiento. Deja extremos EcoP15I
cohesivos.

17
 Nomenclatura de las enzimas de restricción

1. Se nombran con 1 letra el género y 2 letras la especie bacteriana de la que se aislaron.

2. En caso de haber varias cepas, se nombra la cepa con una letra que identifica el serotipo/variante antigénica.

3. Se incluye un no. romano si en una misma especie se han encontrado varias ER.

18
 Algunas enzimas de restricción comunes

Comúnmente cortan 4,6 y 8 pb.

Generan extremos cohesivos (sticky

ends ) o romos (blunt ends).

Sus secuencias de reconocimiento

tienen simetría palindrómica (se leen
igual en ambas cadenas de 5’ – 3’).

El descubrimiento de ER proporcionó las “tijeras moleculares” para la clonación de genes.

19
https://international.neb.com/tools-and-resources/video-library/type-ii-restriction-enzymes

20
Clonación: Unión de un inserto de ADN a un vector (plásmido) de ADN

A. El inserto debe contener los mismos sitios de restricción

del sitio múltiple de clonación (MCS) del vector, en este ej.
para HindIII y KpnI (naranja). Pares de bases (4-6) adicionales
fuera del sitio de restricción (Buffer) se incluyen para
proporcionar una unión eficiente de la ER.

B. La digestión del vector y e inserto con HindIII y KpnI genera

extremos cohesivos complementarios que permiten que el
inserto se aparé con el plásmido lineal (los puentes de H
estabilizan esta unión).

C. La acción de una ADN ligase unirá covalentemente el

inserto al vector.

21
https://international.neb.com/products/b7204-cutsmart-buffer

22
New England BioLabs (NEB)

23
Detalles de la enzima

24
 Isoesquizómeros
Son pares de ER que reconocen la misma secuencia, pero pueden cortar o no en el mismo sitio.

Neoesquizómeros

25
 Isocaudómeros

Son pares de ER con secuencias de reconocimiento ligeramente diferentes cuyo corte produce los mismos extremos.

Ej.
BamHI/BclI/BglII/BstYI/DpnII
NcoI/BspHI/FatI/PciI
NdeI/AseI/BfaI/Csp6I/MseI
XbaI/AvrII/NheI/SpeI/StyI
XhoI/PspXI/SalI

- Los extremos generados por una enzima se pueden unir a los generados por la otra.

- La secuencia que resulta de la unión en la mayoría de los casos ya no se reconoce por las enzimas isocaudómeros.

- Útiles para eliminar sitios de restricción.

26
 Enzimas con extremos cohesivos compatibles

Reconocen secuencias distintas y dejan extremos cohesivos iguales (y por tanto, complementarios entre ellos). Por ej.
SalI y XhoI.

- El sitio resultante puede o no ser reconocido por una de las enzimas que le dio origen (en este caso el sitio resultante no
puede cortarse con SalI y XhoI ).

-Útil para generar nuevos sitios de restricción. 27

Ej. Generación de extremos cohesivos compatibles

28
NEB muestra ER con extremos cohesivos compatibles y la generación de nuevos sitios de restricción

29
 Estrategias para generar nuevos sitios de restricción

1. Cortar con la ER, rellenar los extremos 5’ cohesivos para generar extremos romos y ligar.

2. Cortar con 2 ER que generen extremos romos y ligar.

3. Cortar con 2 ER que generen extremos sobresalientes compatibles y ligar.

30
Buffers para la digestión de ADN con enzimas de restricción de NEB

31
https://international.neb.com/products/restriction-endonucleases/hf-nicking-master-mix-time-saver-o
ther/restriction-endonucleases/cutsmart

32
Reacción de digestión doble

33
Componentes de la reacción de digestión

34
Protocolo de digestión

35