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Análisis de Proteínas- Electroforesis

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Análisis de Proteínas

Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección

advansta

Análisis de Proteínas

Análisis de Proteínas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés. Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras. Esta guía de laboratorio describe los pasos involucrados en la realización de un Western blot, incluyendo la preparación de muestras, la separación de proteínas, la transferencia y la detección.

Índice de Contenidos
1. Western Blot: Visión General 2. Preparación de las muestras 3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida 4. Transferencia Electroforética 5. Hibridación Anticuerpos 6. Detección 7. Solución de Problemas 8. Herramientas y Referencias Técnicas

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1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4. Página 1

Un cartucho aplica presión y mantiene un estrecho contacto entre el gel y la membrana. Figura 2. o bacterias. Así.Western Blot: Visión General 1. La disrupción mecánica con un homogenizador disgrega los tejidos. dónde quedan inmovilizadas. que conducirá la corriente. levadura. Preparación de muestras b. La proteínas con carga negativa migran desde el ánodo. Se utiliza una pipeta para cargar las muestras en los pocillos del gel Una fuente de alimentación proporciona el voltaje El gel se coloca dentro de un tanque de electroforesis lleno de tampón. Preparación de la muestra Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química. una carga negativa a cada una de ellas. El gel y la membrana se coloca entre papel de filtro y almohadillas de esponja. Electroforesis en gel de Acrilamida Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. Western Blot: Visión General Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso. Los materiales de partida incluyen planta. Se aplica voltaje en el tanque de transferencia y las proteínas migran desde el gel a la membrana. Transferencia de Proteínas a la Membrana Página 2 . Electroforesis en Acrilamida c. la migración de la muestra se puede monitorizar. Procesos adicionales logran el fraccionamiento subcelular Se usan tampones conteniendo detergentes para la lisis celular Figura 1. a. de forma proporcional a la masa de cada proteína. células cultivadas. Se prepara un gel de acrilamida. Transferencia electroforética a una membrana Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana. tejidos animales. bisacrilamida. Figura 3. El dodecilsulfato de sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere. Se añade un colorante de carga..

se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP). La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz emitid por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario. se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma específica al anticuerpo primario. o bacterias. tejidos animales. células en cultivo.Análisis de Proteínas a. e. Detección quimioluminiscente de las bandas de proteínas Página 3 . Detección de las Bandas Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido. Hibridación del Anticuerpo La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos. Dicha luz puede ser detectada en una película de rayos X. A continuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana. Hibridación de Anticuerpo Figura 5. o de forma digital. levadura. se procede a detectar la localización de la banda en la membrana. mediante un sistema de captación de imágenes. proporcionando una forma de detección. Figura 4. Para la detección de quimioluminiscencia. Tras varios lavados de la membrana. Los materiales de partida incluyen tejidos vegetales. la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción enzimática que da como resultado final la emisión de luz.

. La elección de la substancia detergente. La estructura química de los detergentes permite romper las membranas celulares y solubilizar las proteínas. las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o mecánicos. En la mayoría de ensayos. de la proteína de interés. citoplasmática. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar según las características del grupo polar: iónicos si el grupo polar tiene carga positiva o negativa. que va dirigida a enriquecer la proteína de interés dentro del extracto final. Tabla 1.. Las células en cultivo. tales como el homogenizador Dounce Los detergentes Triton son suaves y no iónicos Para antígenos con niveles bajos de expresión pueden ser necesarios procesos de enriquecimiento Citoplasmático (unida a citoesqueleto) Tris-Triton Membrana mitocon. tejidos. Soluciones Tampón y detergentes. dentro de orgánulos celulares como el núcleo y las mitocondrias. Triton X-100 Página 4 . según el tipo de proteína de interés y la localización subcelular Tipo/Localización Proteína de interés Nativa (no desnaturalizada) Citoplasmáticos (soluble) Detergente o Solución Tampón Detergente suave no iónico Tris-HCl TComentarios Evitar detergentes desnaturalizantes (SDS. Preparación de la muestra Una adecuada preparación de la muestra es esencial para tener éxito en un ensayo de Western Blot.Las proteínas citoplasmáticas se pueden unir a las proteínas del citoesqueleto. frecuentemente.Preparación de la muestra 2. mediante el uso de solución tampón que contiene detergentes. no iónicos si no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga negativa y positiva y la carga neta es 0. Deoxicolatos) Puede combinarse con métodos mecánicos. bacemitidas por una terias. dentro de la célula. se suelen lisar utilizando una solución tampón con detergente y sin la aplicación de métodos mecánicos. etc. útil para protocolos de enriquecimiento de proteínas mitocondriales o nucleares Homogenizador Dounce Homogenizador de ultrasonidos Ondas de sonido Células.NP-40. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida. se requiere el uso de un proceso mecánico para la disrupción de la compleja matriz celular. depende en parte de la localización. en muestras tisulares de plantas y animales. de la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico. En la tabla 1 se resumen los métodos mecánicos que habitualmente se utilizan en la extracción de proteínas para inmunotransferencia. Tipo de muestra Gran cantidad de tejido Células tisulares. unida a la membrana. Métodos físicos para la dirupción de muestras Método Licuadora Descripción La muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias Tubo de vidrio con pistón ajustado maja las células por acción de corte. afectando así a los procesos de fraccionamiento subcelular. Disrupción mecánica que suele preceder a un proceso químico de lisis celular.Tejido animal o o riza utilizando un vegetal mortero y una almirez refrigerados La ruptura celular se Levaduras produce por agitación de las perlas de vidrio Pulverización en Nitrógeno líquido Perlas de vidrio Tabla 2. Triton X-100 Lisado total de células NP-40. más utilizados habitualmente. RIPA. sonda para romper las membranas celulares La muestra se pulve. RIPA drial o nuclear (multiples detergentes). En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampón y detergentes. según el tipo de proteína y localización subcelular. A menudo.

Cisteinas Proteasas de Aspartico Proteasas de Serina Inhibidores Fosfatasas  . se pueden separar en el gel según su tamaño (SDSPAGE). Por tanto.1—1 mM Proteasas de Serina Mg++/Mn++ Metaloproteasas Ca++ Metaloproteasas Proteasas de Serinas. es importante evitar.Análisis de Proteínas Con la rotura celular. Medición de proteína total Previamente a la electroforesis. mediante la acción del detergente Dodecilsulfato Sódico (SDS). así Las proteínas. Además de inhibir la actividad de la proteasa. en particular en estudios de fosforilación. Electroforesis en Acrilamida Las proteínas del extracto se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradación de proteínas:  Evitar excesivos ciclos de congelación/ descongelación. se revisten con carga negativa. puede ser interesante reducir la actividad de la fosfatasa alcalina. Leupeptin Pepstatina A PMSF Nota: con el kit Afyon ™ SDS-PAGE de preparación de muestra. para determinar la carga de proteína apropiada. Inhibidores Proteasas Aprotinina EDTA EGTA Leupeptin Pepstatina A PMSF Concentración en Enzimas diana el Tampón de lisis 1-2 µg/ml 1-10 mM 1-10 mM 1-2 µg/ml 1µg/ml (17-170 µg/ml) O. las proteínas. En la tabla 3 se muestran los inhibidores deproteasa y fosfatasa de uso más habitual. Cisteinas Proteasas de Aspartico Proteasas de Serina 3. Por ejemplo. se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés. Tabla 3. cualquier actividad proteásica. Asegurar la carga de la cantidad correcta de proteínas en el gel. En primer lugar. Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un mayor ruido de fondo y unión no específica de los anticuerpos. para 5 µg de proteína se utilizan 20 µl de resina Afyon. durate la preparación de la muestra. Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la extracción de proteínas.Glicerofosfato EDTA EGTA Enzimas diana Fosfatasas Serina/ Treonina Mg++/Mn++ Metaloproteasas Ca++ Metaloproteasas Proteasas de Serinas. evitando la necesidad de determinar la concentración de proteína.  Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis. Información para pedidos K-02101-025 Afyon ™ SDS-PAGE ssmple preparation kit Página 5 . es importante determinar la concentración de proteínas por las siguientes razones: 1.  Trabajar rápido y mantener las muestras en frío durante todo el proceso. La cantidad de proteína óptima a cargar dependerá de la prevalencia de la proteína de interés y de la sensibilidad del anticuerpo primario.1—1 mM Concentración en el Tampón de lisis 1 mM 1-10 mM 1-10 mM 1-2 µg/ml 1µg/ml (17-170 µg/ml) O. se requiere hacer experimentos preliminares con cantidades seriadas de proteínas. se puede controlar la cantidad de carga de la proteína mediante la cantidad de resina utilizada. A menudo.

En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva estándar.  Rango lineal pequeño. La elección depende de muchos factores:  El equipo de lectura disponible en el laboratorio (espectrofotómetro. se pueden comparar los niveles relativos de la proteína de interés.Electroforesis en Acrilamida 2. metricamente  Menos varia(reacción de ción proteíBiuret) na-proteína que en el método Bradford. Descripción del método Existen diversos métodos para medir la proteína total de una muestra. etc…). Similar al BCA (reacción de Biuret) Lowry Muy bien cita. Se representa la absorvancia de las soluciones estándar que contienen la proteína conocida (línea roja). Los más habituales son los métodos Lowry.  La cantidad de muestra disponible. Un experimento de Western Blot cuantitativo es útil para estudio de cambios de expresión de proteínas o de modificaciones proteicas como la fosforilación. Bradford y Ácido Bincocinico (BCA) (Tabla 4). El tiempo de da en literatura ensayo puede ser mayor que en otros métodos  No es práctico para grupos grandes de muestras  Se pueden formar precipitados Hay muchos kits de determinación de proteínas disponibles comercialmente. Esto se logra con la realización de un ensayo de concentración crecientes. La concentración de la proteína de interés se puede determinar extrapolando la absorvancia obtenida en la curva patrón o estándar (línea verde de puntos). se debe realizar una curva estándar en cada ensayo. El estándar utilizado con mayor frecuencia es la albúmina de suero bovino (BSA). de proteína pura. Realización de Western Blots cuantitativos o semi-cuantitativos. Página 6 . Ejemplo de la curva estándar de un ensayo de proteínas. Elección de un ensayo de proteínas Absorvancia Tabla 4. aunque se puede utilizar cualquier proteína producida en el laboratorio o disponible comercialmente. Si la cantidad de proteína cargada por carril es la misma. el gentes  ComercialBCA se une a los iones de mente dispoCu1+ y forman nible en forun producto mato comcoloreado que patible con se puede meagentes dir espectroforeductores. Estos ensayos colorimétricos se basan en las reacciones que se producen entre las proteínas de la muestra y los reactivos de detección.revisar el protocolo del fabricante para identificar sustancias interferentes. El contenido de la proteína de interés en la muestra (línea verde) se puede determinar mediante la extrapolación de la absorvancia obtenida a la cantidad o concentración de proteína correspondiente. Los valores de absorvancia se trazan en función del contenido conocido de la proteína estándar utilizada.  La facilidad/rapidez del ensayo. Métodos físicos para la dirupción de muestras Ensayo Bradford Descripción El colorante azul de Coomasie se une a las proteínas y sufre un cambio de absorvancia Ventajas La realización de los ensayos son generalmente rápidos y sencillos Inconvenientes  Interferencia de SDS o de otros detergentes a altas concentraciones .  Los reactivos del tampón de lisis . Interferencia con agentes quelantes o reductores del Cobre BCA Reducción de  Compatible iones de Cu2+ con la mayo mediante interación con las ría de deterproteínas. Proteína (mg) Figura 6. Con el fin de determinar la concentración de proteínas totales en una muestra. lector de placas.

se pueden utilizar inmediatamente. En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanismo de desnaturalización del SDS. combinándolas con un tampón de carga y cargar la muestra en un gel de electroforesis. No se utilizarán ni SDS. Previamente a la carga del gel. beta mercaptoetanol o ditiotreitol.  Migra por delante de las proteínas.  Evita las interacciones hidrofóbicas y rompe los enlaces de hidrógeno.Análisis de Proteínas Tampón de carga de muestras Una vez se tienen las muestras de proteína. las muestras se someten a una incubación a 95ºC durante 5-10 minutos. Propósito Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar la muestra la fondo del pocillo y evitar que se extienda a los pocillos adyacentes.  Destruye la estructura secundaria/ terciaria y lineariza la proteína. En condiciones no desnaturalizantes/no reductoras. Mecanismo de desnaturalización por SDS de las proteínas. Los ingredientes típicos de un tampón de carga para detectar proteínas bajo condiciones desnaturalizantes/reductoras se describen en la Tabla 5. Mantiene el pH adecuado Azul de Bromofenol SDS Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y garantizan que las muestras se separan de forma reproducible. de modo que se puede hacer el seguimiento del movimiento de las muestras en el gel.  Completan la linearización de la proteína al romper los puentes disulfuro. Agentes reductores  Evita la oxidación de cisteínas. dependiendo de las condiciones deseadas. Los componentes del tampón de carga varían. Reactivo Glicero. si se necesitan condiciones no desnaturalizantes /no reductoras. para asegurar que la desnaturalización/ reducción es total. Figura 7. aportando carga negativa de forma proporcional al tamaño de la proteína. La proteína se encuentra en su estado conformacional. manteniendo su carga intrínseca SDS El SDS se une a la proteína y da lugar a una linearización y a una uniformidad de la carga negativa de ésta. Tabla 5. esta incubación no es necesaria. se pueden conservar congeladas. Molécula colorante pequeña:  Da color a la muestra para ayudar a la carga. Advansta dispone de tampones de carga reductores y no reductores.  Unión a la proteína de forma regular. Información para pedidos R– 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x) R-03019-B10 Reducing protein sample loading buffer (2x) Tampón Tris Pepstatina A Beta Mercaptoetanol o DTT Página 7 . Alternativamente. Componentes del tampón de carga. Detergente desnaturalizante  Cola hidrofóbica que rodea la esqueleto peptídico. teniendo cuidado en evitar ciclos repetitivos de congelación/ descongelación. carril a carril y gel a gel.

También se procesarán más lentamente y requieren tiempos de transferencia mas largos que los geles más delgados El porcentaje del gel. En la tabla 6. Rango de separación de proteínas según el porcentaje de acrilamida. Están disponibles en diversos tamaños. Elección del grosor del gel y del tamaño de poro El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína de interés dictan el espesor y tamaño de poro del gel. (tabla 7). Tabla 7. Los geles con mayor espesor. la mayoría de ensayos Western Blot. se describen los componentes químicos de un gel de SDS-PAGE. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis de proteínas Reactivos Acrilamida Bisacrilamida SDS Propósito Moléculas que polimerizan para formar cadenas. Sin embargo. El tamaño de poro determina la ratio de separación de las proteínas. Los geles pre-fabricados son muy prácticos pero debido al coste. Tampón Tris Persulfato de Amonio TEMED Los espaciadores de gel (ver Figura 8) controlan el espesor del gel. también conocida como PAGE nativo. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reducción. Generación de radicales libres que catalizan la reacción de polimerización. En esta situación. según la cantidad de acrilamida y bisacrilamida. migran al electrodo positivo. Mantiene el pH adecuado. A más porcentaje menos tamaño de poro. determina el tamaño del poro. Las moléculas más pequeñas migran más rápidamente que aquellas con pesos moleculares mayores. cuando se someten a un campo eléctrico. Porcentaje 7. pueden aceptar mayor volumen de carga. las proteínas mantienen su estructura tridimensional y la migración en el gel depende de su masa: relación de carga de la proteína por encima de su tamaño.Electroforesis en Acrilamida Gel de Electroforesis Si se requieren condiciones naturales para que el anticuerpo pueda detectar el epítopo. se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes. no son tan rentables como los elaborados por el usuario. Los geles de SDS-PAGE están disponibles comercialmente o se pueden elaborar en el propio laboratorio.  Tabla 6. Mantiene la linearidad y la uniformidad de carga de las proteínas según la electroforesis. Aumenta la generación de radicales libres por el persulfato de amonio. Forman uniones con las cadenas de acrilamida para formar un entramado. en la electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en el tampón de electroforesis. la tasa de migración viene determinada por su peso molecular. Debido a que el SDS iguala la carga en todas las proteínas. las proteínas cargadas negativamente.5 10 12 15 20 Rango Peso Molecular (kDa) 25-500 15-300 10-200 10-45 5-40    Página 8 .

es importante diseñar el experimento incorporando los controles y estándares necesarios para la validación de los resultados. Marcadores de Peso Molecular. verter el gel resolutivo y esperar que el gel se polimerice. Tras fijación de los lados. Se utiliza para verificar que la carga de proteína por carril es más o menos igual. formado por el conjunto de dos cristales.      2.Análisis de Proteínas Elaboración del gel Si el gel de acrilamida esta elaborado en el laboratorio. Disponible en diversos intervalos de pesos moleculares. así los niveles de proteínas se pueden comparar de forma cuantitativa. Se pueden utilizar otras especies como tejido de control si el anticuerpo tiene reactividad cruzada apropiada. Similar a los ―housekeeping genes‖ en Biología Molecular. Péptidos de bloqueo   Algunos proveedores ofrecen péptidos de bloqueo para sus anticuerpos. Estos estudios demuestran que el anticuerpo utilizado se une de forma específica a la proteína de interés. Para mejorar la nitidez de la banda el gel resolutivo se corona con una acrilamida de menor porcentaje (stacking gel). Por tanto no se detectará ninguna banda.     Página 9 . 4. Algunos tratamientos pueden alterar la expresión de estas proteínas ―housekeeping‖. Los tipos de estándares y controles utilizados incluyen: 1. Se utilizan para verificar si la proteína de interés está dentro del rango de tamaño apropiado. espaciadores lateral. El gel está listo para cargar las muestras y la electroforesis. Colocar el peine en la parte superior del gel. los distintos reactivos se mezclan y se vierte en el molde. Pueden estar marcadas por la detección por fluorescencia o quimioluminiscencia. Controles y Estándares Antes de la carga del gel. El péptido de bloqueo se mezcla con el anticuerpo primario antes de la incubación con la membrana y evita la uníón del anticuerpo a la proteína diana. si está disponible. Generalmente.  1. Son una mezcla de proteínas purificadas de peso molecular conocido. 3. así como teñidos o incoloros. Puede ser una línea celular que sobreexprese la proteína de interés. 2. Verter el ―stacking gel‖ y quitar el peine una vez el gel haya polimerizado. La expresión cuantitativa de la proteína de interés puede normalizarse con la del control de carga para cada muestra. Controles de carga   Como norma general se utilizan proteínas con niveles de expresión constante para todas las muestras. peines y un sistema de sujeción (Figura 8). Las versiones preteñidas se utilizan para controlar el progreso de la electroforesis y comprobar la eficacia de la posterior transferencia. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre los cristales. dónde la acrilamida se polimeriza en aproximadamente 30 minutos. Figura 8. son una muestra de la proteína de interés purificada. Puede ser una muestra de tejido del que se conozca que expresa altos niveles de la proteína de interés. Diseño Experimental. Controles Positivos. Lavar los pocillos con ddH20. espaciador inferior.  Para verificar si el anticuerpo primario se une a la proteína correcta. Preparación del gel de electroforesis para la separación de proteínas.

En este método. Normalmente se cargan de 20 a 40 µg de proteína total por carril. El aumento de la resistencia. Glicina (conductor electricidad) y SDS (mantiene las proteínas cargadas negativamente). La técnica de electroforesis más habitualmente utilizada es la de Laemmli. El progreso en el gel se monitoriza observando el frente coloreado por el colorante presente en el tampón de carga y la posición de los marcadores de tamaño siempre que estos estén teñidos. La figura 9 ilustra el flujo de iones durante la electroforesis. para así evitar sobrecargas que pueden dar lugar a la pérdida de muestra o derrames en pocillos adyacentes.8 Tampón de Electroforesis (pH 8. contiene Tris (mantiene el pH). aumenta su carga negativa y se mueve por delante de las proteínas.3.8 Gly Proteinas Resolving Gel pH 8.8 y ralentiza su movimiento. los valores de pH de la capa de gel de apilamiento o concentración (Stacking Gel) y el gel de resolución (Resolving Gel) son diferentes. el gel se somete a un campo eléctrico generado por una fuente de alimentación. obliga a las proteínas a alejarse. Los iones de cloruro avanzan por delante de la Gly. Una vez finalizada la carga.Electroforesis en Acrilamida Inicio de Electroforesis Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta. del electrodo negativo. Página 10 . Muestra (pH 6. el volumen que se puede cargar por pocillo. la glicina. de forma apilada. se aleja del electrodo negativo. en el Stacking Gel. La glicina empieza a perder su carga a pH 6. Concentración de bandas de proteínas por el flujo iónico en el sistema discontinuo de Laemmli. El tampón utilizado durante la electroforesis. La glicina.8) Gly Proteinas CL- Stacking Gel pH 6. Con la aplicación de un campo eléctrico.3)    La glicina tiene carga negativa en el tampón de electroforesis a pH 8. Las proteínas se separan según su peso molecular por el   Figura 9. debido a un mayor pH del ―Resolving Gel‖. Es importante conocer de antemano.

ofrece una mayor resistencai mecánica. sin embargo no son apropiados para transferencia de proteínas de gran tamaño (>70 kDa) y pueden causar. La figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la membrana en un transferencia semiseca o húmeda.22 µm 8x10 cm Página 11 . Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre -cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamaño de minigel. La mayoría de los sistemas de transferencia utilizan la generación de un campo eléctrico para conducir a las proteínas desde el electrodo negativo al positivo. Ambos métodos requieren. las diferencias en sus características puden influir a la hora de la elección. las proteínas se transfieren a una membrana. Figura 8.Análisis de Proteínas 4.45 µm 8x10 cm Membrana Nitrocelulosa 0. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas. Información para pedidos L-08001-010 L-08002-010 L-08003-010 Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm Membrana Nitrocelulosa 0. SDS (opcional) y metanos (para membranas de nitrocelulosa). un mayor ruido de fondo. resistencia la SDS y una mayor unión que la nitrocelulosa. Los sistemas semisecos son más rápidos y requeiren menor cantidad de volumen de Tampón que los sistemas húmedos. tanto el gel como la membrana se equilibran en una solución tampón pre-enfriada. el tampón de transferencia contiene Tris. Aunque ambas funcionan bien en experimentos de inmunotransferencia. Típicamente. Los sistemas de transferencia están disponibles en formato semiseco o húmedo. Recientemente se han desarrollado. permitiendo así que la hibridación de un anticuerpo las pueda detectar. para una transferencia efectiva de las proteínas. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiempo y elimina la contaminación accidental de las membranas con guantes o tijeras contamindas. con el objetivo de reducir el ruido de fondo al utilizar métodos de detección de fluorescencia. un estrecho contacto entre el gel y la membrana. según el sistema de detección. Transferencia a una Membrana Una vez la electroforesis del gel ha terminado. Glicina. La membrana de PVDF. La membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol. membranas PVDF de baja autofluorescencia. Previamente a la transferencia. Transferencia de proteínas a una membrana.

sin embargo y debido a la presencia de biotina en las fosfoproteínas. cuando se inicia un nuevo protocolo. . son soluciones a base de proteínas. Reducir o eliminar el SDS o utilizar una membrana con un tamaño de poro menor puede ayudar a una mayor retención de la proteína. como la leche descremada en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA). Se pueden eliminar haciendo rodar suavemente una pipeta Pasteur por encima del ―sándwich‖ formado por el gel/ membrana/papel de filtro. La membrana debe ser desteñida antes del proceso de transferencia. se puede añadir también detergente Tween 20. 200 ml AvantTM Buffer Pouches . 500 ml AdvanBlockTM-PF. así como soluciones tampón en polvo de PCS. Las proteínas más pequeñas se transferirán más rápidamente y pueden atravesar la membrana. A menudo. un sistema de refrigeración o hacer la transferencia en una cámara fría. La aparición de marcadores de tamaño preteñidos en la membrana es indicación que se ha completado la transferencia. Incrementar la cantidad de SDS y disminuir la concentración de Metanol pueden facilitar la transferencia de proteínas de gran tamaño. Una incubación durante una hora (temperatura ambiente o a 4ºC) suele ser suficiente para un bloqueo de los lugares de unión no específicos del anticuerpo. puede que no sea la mejor elección cuando se van a utilizar anticuerpos fosfoespecíficos o en métodos de detección de biotina.  Evitar la manipulación de las membranas con las manos desnudas. La tinción con Coomassie puede usarse para la tinción del gel una vez realziada la transferencia y comprobar los residuos de proteína en el gel. WesternBright.Electroforesis en Acrilamida A continuación se describen algunas sugerencias para la consecución exitosa de una transferencia:  Bloqueo El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incubando con una solución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo. El colorante Ponceau S puede utilizarse para teñir la membrana y asegurarse de la eficacia de la transferencia.TBS Página 12 . ya que es más rentable que el BSA. La primera elección. TBS. Ajustar las condiciones de transferencia al tamaño de la proteína.PBS AvantTM Buffer Pouches .. se pueden seleccionar otras soluciones de bloqueo alternativas. No permitir un sobrecalentamiento durante la transferencia. el uso de agentes bloqueantes no proteicos..   Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo y de lavado para su línea de reactivos de detección. Si los niveles del ruido de fondo son demasiados altos.    El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampón Tris salino) o en PBS (Tampón Fosfato salino). Las burbujas de aire entre el gel y la membrana pueden causar transferencia defectuosa y desigual. Es aconsejable utilizar tampón frio. es la utilización de la leche descremada en polvo. Las proteínas y aceites de la piel pueden adherirse a la membrana y pueden dar lugar a manchas no deseadas en la membrana. Es preferible.que facilitan una rápida y fácil preparación Información para pedidos R-03024-D50 R-03023-D20 R-01038-020 R-01039-020 AdvanWashTM. Disminuir el voltaje o el tiempo si fuera necesario. para estas y otras situaciones.

Los lotes de un mismo hibridoma son muy estables. Reactividad cruzada potencial  Reactividad cruzada menos probable. o por modificaciones químicas (glicosilación fosforilación) o por diferencias en la secuencia peptídica debido a la presencia de polimorfismos. la membrana se incuba con el anticuerpo primario. comúnmente conejo. En general. el cual se analiza y determina la afinidad al antígeno. Página 13 . Los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir del suero del animal.reMenor coste quiere personal capacitado y equipamiento especializado. Los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epítopos del antígeno y en cambio los monoclonales reconocen un único epítopo de la proteína. Propenso a cierta variabilidad entre lotes.  Bueno para proteínas poco abundantes. las células que sintetizan anticuerpos se aíslan del bazo del animal y se fusionan con células del mieloma. El primer paso en la producción de ambos anticuerpos. reconocer al antígeno en condiciones de desnaturalización/reducción de la proteína. los anticuerpos reconocen una secuencia de aminoácidos pequeña (epítopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de la proteína en condiciones desnaturalizantes y reductoras. Más corto Anticuerpos Primarios: Monoclonal vs Policlonal. En la transferencia Western se pueden utilizar. Algunas características de los anticuerpos monoclonales y policlonales se describen en la Tabla 8. burro u oveja y son finalmente purificados y probados.  Mayor ruido de fondo potencial debido al reconocimiento de multiples epítopos.  Potencial para reconocer otras proteínas que contengan el epítopo. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales. Los geles nativos se pueden utilizar cuando los anticuerpos requieren de la proteína plegada para el reconocimiento del antígeno. para provocar una respuesta inmune. Tabla 8. cabra. Después del proceso de bloqueo. Hibridación del Anticuerpo. Lo hibridomas resultantes secretan anticuerpos al medio de cultivo. Tiempo requerido para su producción Coste de Preparación Largo Mayor coste .  Reactividad cruzada más probable. tanto anticuerpos primarios monoclonales como policlonales.Análisis de Proteínas 5. Los hibridomas con secreción más estable se seleccionan y pueden ser cultivados indefinidamente. Para la síntesis de un anticuerpo monoclonal. Anticuerpos Monoclonales Reconocimiento epitopo y sensibilidad  Reconocimiento de un único epítopo  Menos sensibilidad debido a que sólo un anticuerpo se une a cada proteína Anticuerpos Policlonales  Reconocimiento múltiples epítopos en una proteína  Más sensible debido a los multiples lugares de unión de anticuerpo en cada proteína. es la inyección de un antígeno en un animal.  Reactividad cruzada con otras especies más probable. Los dos tipos tienen distintas ventajas y desventajas y se diferencian según la forma en la que se sintetizan. Variabilidad Tolerancia a condiciones variables Poca tolerancia Más tolerante a conpuede dejar de diciones variables.

IgE) y posiblemente la subclase (IgG1.  Nota: Advansta ofrece una línea completa de anticuerpos secundarios marcados para detección mediante quimioluminscencia o fluorecencia. Un menor volumen puede utilizarse si la membrana se sella dentro de una bolsa e incuba en un agitador orbital.  Generalmente.…). 250 µl IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón. PBS. la membrana debe someterse a agitación suave y sumergida en la disolución. 500 µl Después de la incubación con el anticuerpo primario. IgA. la abundancia de la proteína en la muestra y la sensibilidad del sistema de detección afectarán a la cantidad de anticuerpo a utilizar. En algunos casos. También es posible una incubación a 4ºC durante toda la noche. En métodos de detección indirectos (sección 6). IgM. la disolución con el anticuerpo. debe ser totalmente lavada de la membrana. 250 µl Anticuerpo Secundario conjugado HRP cabra-anti-ratón. deber ser producido en otra especie distinta a conejo. Si se utiliza acida sódica como conservante. el segundo Ac debe ser anti-conejo. Para anticuerpos monoclonales se debe considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG. Un anticuerpo con amplia especificidad inmunoglobulínica debería ser suficiente. se procede a la eliminación del excedente mediante tampones de lavado (TBS.  Página 14 . IgG2a. un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente suele ser suficiente. es necesario un anticuerpo secundario apropiado. e incubar en un agitador de vaivén. ya que puede eliminar la actividad de la peroxidasa e interferir en los métodos de detección. 50 µl IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo. IgD. 500 µl Anticuerpo Secundario conjugado APC cabra-anti-conejo. El fabricante puede recomendar una cantidad inicial. ya que los anticuerpos específicos para sub-clases se utilian mayoritariamente. 50 µl IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón. TBST o en un tampón de disolución de anticuerpo comercial. pero a menudo la concentración óptima de anticuerpo debe determinarse empíricamente. Durante la incubación. La afinidad del anticuerpo.Hibridación Anticuerpos Incubación de los anticuerpos El anticuerpo primario se diluye en tampón de bloqueo.  Información para pedidos R-05051-050 R-05051-250 R-05052-050 R-05051-250 R-05071-500 R-05072-500 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo. TBST o PBST). o sea. Si el primer Ac es de conejo. A continuación se describen las consideraciones a tener en cuenta a la hora de la elección de un anticuerpo secundario:  Las especie del primer Ac dicta la elección del Ac secundario. puede reutilizarse. en experimentos de doble etiquetado u otras aplicaciones.

100 uds la detección de señales de quimioluminiscencia en experimentos realizados con los substratos WesternBright HRP. 1. 13x18 cm. sólo un color de reacción) Figura 11 . rios a cada Ac primario.  Mayor posibilidad de unión no inespecífica. no son posibles detecciones multiplex (detección de mas de una proteína. se pueden hacer multiples exposiciones en películas de rayos X. La reacción entre el encima y el substrato produce luz. En la detección indirecta. Westernbright Quantum y WesternBright Sirius. semicuantitativa . Quimioluminiscencia. Fluorescencia y 3. fácil de documentar.Análisis de Proteínas 6. 2. es el anticuerpo secundario el que está conjugado con un marcaje detectable.ilustra los métodos de detección directos e indirectos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e inconvenientes de los dos métodos.porque se basa en una reacción enzimática.  Versátil . Ventajas e Inconvenientes de los métodos de detección Indirecto Ventajas Directo  Amplificación de  Menos pasos. Inconvenientes Nota: LucentBlueTM es una película que ha sido optimizada para Información para pedidos L07014-100 L07013-100 Película Rayos X LucentBlueTM . Detección. señal debido a la  Menos posibilidaunión de múltides de unión no ples Ac secundaespecífica. 20x25 cm. Métodos de detección. la intensidad de la señal puede variar con la incubación o el tiempo de exposición. como un enzima. la membrana puede tratarse para re-utilizarse. 100 uds Película Rayos X LucentBlueTM . biotina o molécula fluorescente. Detección directa e indirecta de proteínas Tabla 9. incluyedo WesternBrightTM ECL. Quimioluminiscencia. Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan comúnmente anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP).  Puede ser más costoso. que puede ser detectada mediante la exposición de la membrana a una película de rayos X o captada de forma digital utilizando una cámara CCD. Los métodos más comúnmente utilizados para detectar proteínas son: 1. Página 15 . La figura 11.  La inmunorreactividad del Anticuerpo puede estar afectada por el marcaje. La detección de la proteína se puede hacer mediante métodos directos o indirectos. Colorimetría. Los anticuerpos se pueden marcar mediante kits disponibles en le mercado u obtenerlos ya marcados. la película tiene un rango dinámico limitado. un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer anticuerpo. Los métodos directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable.  Más pasos. cada uno con sus ventajas e inconvenientes. Inconvenientes: requiere una habitación oscura (película rayos X) o sistemas de imagen caros. Lo métodos indirectos utilizan dos anticuerpos. Ventajas: muy sensible.el mismo Ac secundario puede utilizarse para diversos anticuerpos de la misma especie.

Inconvenientes: no es tan sensible como los otros dos métodos. Ventajas: sencilla de realizar. Información para pedidos K-12042-D10 K-12042-D10 K-12045-D20 K-12042-D10 WesternBrightTM Quantum Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) WesternBrightTM Sirius Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) WesternBrightTM ECL Western Blotting HRP Substrate (para 2000 cm2 de membrana) WesternBrightTM ECL Spray Página 16 . El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo. la membrana puede ser tratada para volver a ser utilizada para la detección de otra proteína. concentración de muestra y tipos experimentales.Detección 2. Las membranas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en protocolos de lavados para reutilización. Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado previamente a un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). La imagen se digitaliza para su análisis. Con la detección multiplex de fluorescencia. de dos proteínas en una sola membrana. La intensidad de la tinción puede ser medida por espectrofotometría o por un densitómetro. La luz emitida. Colorimetría. o diferentes isoformas de la proteína. se detecta mediante un dispositivo capaz de medir la fluorescencia o mediante una cámara CCD provista con los filtros de longitud de onda apropiada. 3. Este procedimiento puede conservar las muestras. mediante la detección fluorescente multicolor. pueden usarse Ac primarios marcados (para proteínas abundantes) y eliminar pasos. La cantidad de colorante convertido es proporcional al cantidad en la muestra. no requiere cámara oscura. Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento pueden ser costosos. aporta datas cuantificables. Re-utilización de la membrana Después de captar la imagen. se pueden detectar múltiples proteínas de forma simultanea. fácil documentación de resultados. que cuando es ―excitado‖ emite luz. el color se desvanece con el tiempo. Fluorescencia. Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incrementarse utilizando el sistema streptavidina/ biotina). no se requiere el uso de una cámara oscura. El enzima convierte el colorante en un producto insoluble que es visible en la membrana. las membranas se pueden documentar fácilmente mediante fotografía. apto para ensayos multiplex con múltiples colorantes. amplio rango dinámico. Nota: WesternBright TM MCF permite la detección. Información para pedidos K-12021-010 WesternBrightTM fluorescent Western blotting kit Nota: Advansta suministra una línea completa de reactivos de detección de quimioluminiscencia optimizados para los diferenentes métodos. es ideal para comparar la proteína de interés con un control de carga. no es tan sensible como la quimioluminiscencia (puede no ser apropiado para proteínas poco abundantes). pero consume mucho tiempo. Perfecto para aquellos experimentos en los que se necesite comparar la proteína de interés con un control de carga.

No se puede ver la proteína de interés B. 9) Bandas Difusas (ver 13) El gel corre demasiado rápido o demasiado lento (ver 20. 4) Rayas Verticales (ver 14) Bandas Múltiples (ver 10) Distorsión Lateral (ver 15) Las bandas aparecen muy altas o muy bajas en el gel (ver 11) Contaminación Reactivos (ver 26) Problemas con los reactivos (ver 5.18. 6) Frente corre curvado ―smiling‖ (ver 22) Elección de Membrana (ver 27) Bandas distorsionadas (ver 16) Frente corre inclinado (ver 23) Unión no específica del Anticuerpo (ver 28) Revelado de la película (ver 29) Página 17 .19) Bloqueo Insuficiente (ver 24) Transferencia Inadecuada (ver 2) La proteína es mayor a lo esperado (ver 8. Ruido de fondo excesivo Preparación Muestra (ver 1) La proteína es menor de lo esperado (ver 7) Bandas Incompletas (ver 12) El gel polimeriza demasiado rápido o demasiado lento (ver 17. Tamaño incorrecto de la banda C.21) Lavado inapropiado (ver 25) Unión ineficiente del Anticuerpo (ver 3. Solución de Problemas Solución de problemas con Western Blot A. Bandas artefactuales D. Problemas en la electroforesis E.Análisis de Proteínas 7.

Incrementar la concentración del Antina o el anticuerpo es antiguo/débil cuerpo. Proteína más pequeña de lo esperado Mezclar conjugado + substrato en un tubo. Unión ineficiente del Anticuerpo secundario Elección de especies errónea Utilizar un agente de bloqueo alternativo (ej. Preparación Muestra Causa(s) Extracción ineficiente Baja expresión de la proteína en el tejido o las células La proteína se ha degradado durante la extracción 2. acetilación.conseguir un nuevo reactivo si no hay señal Evitar utilizar disoluciones conteniendo este agente conservante La disolución es antigua o está almacena.…) 4. incluir control positivo en el gel Cargar más cantidad de proteína total en el gel. pulso intactos de centrífuga previo a la carga de la muestra Página 18 . Transferencia indadecuada Solución Intentar métodos alternativos.Usar menor numero de lavados. concentrar utilizando Afyon. etc…) Cambio de la expresión de la proteína en la línea celular Utilizar cultivos anteriores.Reactivos viejos o inestables tivo Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sódica 6.Revisar el protocolo/disminuir metanol rrectamente/demasiado metanol en el tampón Proteínas de mayor tamaño necesitan mas tiempo/voltaje Contacto insuficiente entre el gel y la membrana Repetir con un tiempo mayor/mayor voltaje Revisar la almohadilla de fibra. o luminiscencia en oscuridad .Solución de Problemas A. Problema 1. incluir un control positivo 9. disminuir do la concentración de sales el tampón de lavado Antígeno enmascarado por el agente bloqueante (ej.Comprar reactivo nuevo da de forma inapropiada Causa (s) Proteólisis. Conjugado/Substrato Inac. Proteína más larga de lo esperado y/o bandas múltiples Proteínas modificadas de forma natural (glicosilación. sustituir si es muy delgada 3. fosforilación. comprar un anticuerpo nuevo y almacenarlo de forma apropiada El Anticuerpo tiene reactividad cruzada débil con las especies de interés Probar con un Anticuerpo primario de diferente origen El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava. Problema 7. Unión ineficiente del Anticuerpo primario Baja afinidad del anticuerpo por la proteí. Proteína más larga de lo esperado Agregado de proteínas .…) Usar Anticuerpos dirigidos contra la especie del Anticuerpo primario Concentración insuficiente del Anticuerpo Aumentar concentración o comprar uno o Anticuerpo antiguo Anticuerpo nuevo 5.: BSA. juntar múltiples muestras Usar inhibidores de proteasa en le tampón de lisis Tampón de transferencia preparado inco. Congelación/descongelación de la muestra Proteína variante (Splicing) Solución Uso de inhibidores de proteasa/muestras frescas Consultar literatura/utilizar controles apropiados Consultar literatura para encontrar aditivos que puedan eliminar grupos químicos 8.: Leche.puentes disulfuro Uso de DTT en tampón de muestra. Reactivo de detección (ECL) B.

Rayas en los carriles Alta concentración de sales en la muestra Disminuir la concentración de sal en el tampón de muestra Muestra muy concentrada o insuficiente SDS Incrementar concentración/usar más SDS Minimizar el tiempo de carga 15. Distorsión lateral de las bandas 16. disminuir para proteínas de gran tamaño Solución Usando una pipeta. hacer rodar por encima del paquete gel/membrana para forzar la salida de las burbujas Incrementar voltaje. Problema (continuación) 10. El gel polimeriza muy lento TEMED/AP Insuficiente La disolución de AP ha perdido su actividad Página 19 . El gel no polimeriza Causa (s) Fallo al añadir el TEMED y AP La disolución AP es estable durante dos o tres días a 4ºC El oxígeno inhibe la polimerización 18. intentar un rio o secundario experimento de bloqueo de péptido (eliminará la proteína de interés) Incrementar el porcentaje para proteínas de pequeño tamaño. Distorsión de las bandas Difusión de la muestra en los pocillos durante la carga Fallo en la completa polimerización de los Incrementar TEMED/AP pocillos Presión aplicada excesiva a la hora de montar el gel Burbujas en el gel debido al uso de cristales sucios No apretar en exceso los tornillos del sistema.Análisis de Proteínas B. La proteína aparece muy Porcentaje erróneo/no óptimo del gel alta o muy baja en la membrana C. Bandas Extras Causa(s) Solución Unión no específica del Anticuerpo prima. Problema 12. apretar hasta encontrar primera resistencia Usar guantes en la preparación de los geles Uso de Etanol y H2O desionizada en la limpieza de los cristales Burbujas introducidas en el gel por el dispositivo de llenado (jeringa o pipeta) Burbujas de aire atrapadas por el peine No expulsar totalmente el volumen de la mezcla del gel Insertar el peine en ángulo y antes que se polimerice el gel Solución Repetir con TEMED y AP Preparar AP fresco Aplicar isopropanol antes de verter el gel de apilamiento (stacking gel) Incrementar la cantidad de TEMED/AP Preparar disolución fresca de AP D. Bandas Incompletas Causa(s) Burbujas entre el gel y la membrana 13. Problema 17.Disminuir concentraciones. asegurarse de la correcta preparación del tampón Asegurarse que las muestras se han incubado durante 2 min a 90ºC antes de cargarlas en el gel Preparar SDS nuevo para le tampón de muestra 11. Bandas difusas Migración lenta Las muestras no se han calentado correctamente El SDS del tampón es antiguo 14.

Elección de tipo de mem. Problema 24. intentar con Anticuerpo monoclonal o purificado por afinidad Disminuir la cantidad de proteína 27. lentamente volver a posición vertical Solución Usar BSA E.Las membranas PVDF pueden tener más brana ruido de fondo que las de Nitrocelulosa Algunas membranas tienen alta autofluorescencia Membrana seca 28. Problema (continuación) 19. Contaminación de los reactivos Crecimiento bacteriano o fúngico en los tampones Revisar la turbidez de los tampones.Reducir los tiempos de exposición. reemplazar tampón en caso necesario Disminuir voltaje Disminuir voltaje. Unión no específica del Anticuerpo primario o secundario Concentración muy alta del Anticuerpo o no purificado por afinidad Mucha cantidad de proteína en el gel 29.Solución de Problemas D. o la leche contiene el antígeno de interés Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright MCF. si no es cula o al CCD posible incrementar la dilución de los Anticuerpos o cargar menor cantidad de muestra Página 20 . Frente curvado (smiling) Tampón demasiado diluido Migración demasiado rápida Generación de calor 23. Tiempo de carrera inusualmente corto 22. refrigerar Aguantar el gel en ángulo. Sobreexposición de la imagen El tiempo excesivo de exposición a la pelí. Bloqueo insuficiente Causa(s) La presencia de Biotina en la leche es incompatible con el uso de Estreptavidina. Condiciones de lavado inapropiadas Número insuficiente de lavados Concentración insuficiente de detergente Incrementar la concentración de detergente o usar detergentes más fuertes (SDS. preparar nuevos Elegir membranas de Nitrocelulosa Utilizar únicamente membranas PVDF con baja autofluorescencia con Western Blots fluorescentes Estar seguro que la membrana esta húmeda durante todo el proceso Disminuir la concentración de Anticuerpo. Tiempo de carrera inusualmente largo Causa(s) Cantidad excesiva de TEMED/AP Buffer de electroforesis demasiado concentrado Voltaje insuficiente 21. manteniendo la relación entre ambos Revisar protocolo. colocar una esquina en el tanque inferior del sistema de electroforesis. El polimeriza demasiado rápido 20. Frente inclinado Burbuja atrapada entre los cristales en la parte inferior del gel Solución Reducir la cantidad de TEMED/AP. algún Anticuerpo primario puede requerir un bloqueante proteico La disolución está demasiado diluida Tiempo de bloqueo muy corto Algunos detergentes no son efectivos a bajas temperaturas Incluir BSA o leche en la disolución AdvanBlock-PF utilizada en la dilución del Anticuerpo primario Incrementar con un 5% la disolución Incrementar el tiempo de incubación Incubar a temperatura ambiente en vez de toda la noche a 4ºC Incrementar el número de lavados o la duración de cada uno de ellos 25. NP-40) 26. diluir el tampón en caso necesario Incrementar voltaje Revisar el protocolo.

17 1.000 1 µg 100 pmol o 6x1013 moléculas 20 pmol o 1.35 1. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale Proteina IgG IgM IgA Proteina A Avidina Estreptavidina Albumina suero bovino A280 Uds por 1 mg&ml 1. S) UAU UAC UAA UAG A Tirosina (Tyr. N) Lisina (Lys. G) Tabla 11. T) STOP UGU UGC UGA UGG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG CAU CAC CAA CAG Treonina (Thr. H) Glutamina (Gln.3 0. P) Isoleucina (Ile.Análisis de Proteínas 8. T) AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG Histidina (His. D) A. L) Prolina (Pro. Aspártico (Asp. A) Glicina (Gly. Q) Asparagina (Asn. I) Metionina (Met. L) UCU UCC UCA UCG C Serina (Ser. R) A G GCU GCC GCA GCG Alanina (Ala. K) A. R) Primera posición C Leucina (Leu. Herramientas y Referencias Técnicas g de Soluto Molaridad de una disolución = [Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolución) Tabla 10. Código genético y abreviaciones de los aminoácidos Segunda Posición U UUU UUC U UUA UUG Fenilalanina (Phe. E) CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG G Cisteina (Cys.000 150. C) STOP Triptófano (Trp.7 10 pmol o 6x1012 moléculas 6.000 20.000 100.2 1.5 3.4 0. F) Leucina (Leu. Conversión entre masa y moles de proteína Peso molecular (Da) 10. S) Arginina (Arg. M) Valina (Val.2x1013 moléculas 1 nmol 10 µg 50 µg 100 µg 150 µg Tabla 12. Glutámico (Glu.7 pmol o 4x1012 moléculas Página 21 . W) Arginina (Arg. V) Serina (Ser.

Masa molecular media de los aminoácidos Códigos Aminoácidos A C D E Tabla 14.1 99. LucentBlue™ and WesternBright™ are trademarks of the Company. moles de soluto por litro de disolución F G H I K L M N P Q Tabla 15. All other trademarks.1 129. Adva nWash™.08 101.1 91.05 137.1 115.2 163. Vida media de los Radioisótopos más habituales Radioisótopo Carbono-14 (14C) Iodo-125 (125I) Fósforo-32 (32P) Azufre-35 (35S) Tritio (3H) Vida media 5.2 113.1 156.4 años R S T V W Y Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Peo Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Masa molecular media 71.Herramientas y Referencias Tabla 13. Afyon™.730 años 60 días 14.2 128.1 113.08 103.4 días 12.12 128. unidad de masa molecular mol molaridad.000 bases o pares de base Dalton.. The Advansta logo is a registered trademark of the Company.2 87.2 114. service marks and tradenames appearing in this brochure a re the property of their respective owners.07 186. 1.2 Copyright © 2011 Advansta.2 57.2 131.3 días 87. AdvanBlock™. Prefijos métricos M K m µ mega Kilo mili micro 106 103 10-3 10-6 n K f a nano pico femto atto 10-9 10-12 10-15 10-18 Tabla 16. Avant™.1 147. All rights reserved. Página 22 . Abreviaciones ds ss bp kb Da mol M doble cadena ( como en dsDNA) cadena sencilla (como en ssDNA) pares de base kilobase.

Ste./Fax: 94 450 26 01 08041 BARCELONA ecogen@ecogen. 9-11 Tel. Dos de Maig.325.com Ptge.: 91 444 06 62.Importador www.1980 | Fax: 650.1904 | Email: sales@advansta. CA 94025 Tel: 650.325.com .com www. 1160 | Menlo Park.advansta.com DISTRIBUIDOR LOCAL Sevilla · Granada · Oviedo · Vigo · Zaragoza · Pamplona · Murcia · Valencia · Islas Canarias Advansta Corporation 1455 Adams Drive.com C/ S. 16 Tel.ecogen. Fax: 91 594 02 28015 MADRID ecogenm@ecogen. Hermenegildo.

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