Análisis de Proteínas

Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección

advansta

Análisis de Proteínas

Análisis de Proteínas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés. Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras. Esta guía de laboratorio describe los pasos involucrados en la realización de un Western blot, incluyendo la preparación de muestras, la separación de proteínas, la transferencia y la detección.

Índice de Contenidos
1. Western Blot: Visión General 2. Preparación de las muestras 3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida 4. Transferencia Electroforética 5. Hibridación Anticuerpos 6. Detección 7. Solución de Problemas 8. Herramientas y Referencias Técnicas

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1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4. Página 1

bisacrilamida. dónde quedan inmovilizadas. El gel y la membrana se coloca entre papel de filtro y almohadillas de esponja. El dodecilsulfato de sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere. células cultivadas. que conducirá la corriente. Un cartucho aplica presión y mantiene un estrecho contacto entre el gel y la membrana. Se aplica voltaje en el tanque de transferencia y las proteínas migran desde el gel a la membrana. Así. Electroforesis en Acrilamida c. Transferencia electroforética a una membrana Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana. Western Blot: Visión General Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso. Procesos adicionales logran el fraccionamiento subcelular Se usan tampones conteniendo detergentes para la lisis celular Figura 1. Transferencia de Proteínas a la Membrana Página 2 . levadura. Se añade un colorante de carga. una carga negativa a cada una de ellas. Figura 2. Preparación de la muestra Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química. Se prepara un gel de acrilamida. tejidos animales. La proteínas con carga negativa migran desde el ánodo. de forma proporcional a la masa de cada proteína. Preparación de muestras b.. La disrupción mecánica con un homogenizador disgrega los tejidos.Western Blot: Visión General 1. a. Se utiliza una pipeta para cargar las muestras en los pocillos del gel Una fuente de alimentación proporciona el voltaje El gel se coloca dentro de un tanque de electroforesis lleno de tampón. Los materiales de partida incluyen planta. Electroforesis en gel de Acrilamida Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. Figura 3. la migración de la muestra se puede monitorizar. o bacterias.

levadura. proporcionando una forma de detección. la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción enzimática que da como resultado final la emisión de luz. Hibridación de Anticuerpo Figura 5. A continuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana. mediante un sistema de captación de imágenes. e. células en cultivo. Tras varios lavados de la membrana. Los materiales de partida incluyen tejidos vegetales. se procede a detectar la localización de la banda en la membrana. Detección quimioluminiscente de las bandas de proteínas Página 3 . Para la detección de quimioluminiscencia. o de forma digital. se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP). La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz emitid por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario. tejidos animales. Dicha luz puede ser detectada en una película de rayos X. Hibridación del Anticuerpo La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos. Figura 4. Detección de las Bandas Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido.Análisis de Proteínas a. o bacterias. se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma específica al anticuerpo primario.

Tipo de muestra Gran cantidad de tejido Células tisulares.NP-40. RIPA. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar según las características del grupo polar: iónicos si el grupo polar tiene carga positiva o negativa. Métodos físicos para la dirupción de muestras Método Licuadora Descripción La muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias Tubo de vidrio con pistón ajustado maja las células por acción de corte. frecuentemente. bacemitidas por una terias. útil para protocolos de enriquecimiento de proteínas mitocondriales o nucleares Homogenizador Dounce Homogenizador de ultrasonidos Ondas de sonido Células.. depende en parte de la localización.Tejido animal o o riza utilizando un vegetal mortero y una almirez refrigerados La ruptura celular se Levaduras produce por agitación de las perlas de vidrio Pulverización en Nitrógeno líquido Perlas de vidrio Tabla 2. tales como el homogenizador Dounce Los detergentes Triton son suaves y no iónicos Para antígenos con niveles bajos de expresión pueden ser necesarios procesos de enriquecimiento Citoplasmático (unida a citoesqueleto) Tris-Triton Membrana mitocon. Tabla 1. en muestras tisulares de plantas y animales. Soluciones Tampón y detergentes. se suelen lisar utilizando una solución tampón con detergente y sin la aplicación de métodos mecánicos. Deoxicolatos) Puede combinarse con métodos mecánicos. según el tipo de proteína de interés y la localización subcelular Tipo/Localización Proteína de interés Nativa (no desnaturalizada) Citoplasmáticos (soluble) Detergente o Solución Tampón Detergente suave no iónico Tris-HCl TComentarios Evitar detergentes desnaturalizantes (SDS. Las células en cultivo. según el tipo de proteína y localización subcelular.Las proteínas citoplasmáticas se pueden unir a las proteínas del citoesqueleto.Preparación de la muestra 2. dentro de la célula. Triton X-100 Página 4 . La estructura química de los detergentes permite romper las membranas celulares y solubilizar las proteínas. En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampón y detergentes. La elección de la substancia detergente. afectando así a los procesos de fraccionamiento subcelular. unida a la membrana. etc. En la mayoría de ensayos. Disrupción mecánica que suele preceder a un proceso químico de lisis celular.. que va dirigida a enriquecer la proteína de interés dentro del extracto final. RIPA drial o nuclear (multiples detergentes). dentro de orgánulos celulares como el núcleo y las mitocondrias. citoplasmática. tejidos. En la tabla 1 se resumen los métodos mecánicos que habitualmente se utilizan en la extracción de proteínas para inmunotransferencia. Preparación de la muestra Una adecuada preparación de la muestra es esencial para tener éxito en un ensayo de Western Blot. A menudo. las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o mecánicos. no iónicos si no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga negativa y positiva y la carga neta es 0. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida. mediante el uso de solución tampón que contiene detergentes. sonda para romper las membranas celulares La muestra se pulve. de la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico. se requiere el uso de un proceso mecánico para la disrupción de la compleja matriz celular. de la proteína de interés. más utilizados habitualmente. Triton X-100 Lisado total de células NP-40.

se pueden separar en el gel según su tamaño (SDSPAGE).Glicerofosfato EDTA EGTA Enzimas diana Fosfatasas Serina/ Treonina Mg++/Mn++ Metaloproteasas Ca++ Metaloproteasas Proteasas de Serinas. durate la preparación de la muestra. así Las proteínas. Por tanto. Electroforesis en Acrilamida Las proteínas del extracto se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradación de proteínas:  Evitar excesivos ciclos de congelación/ descongelación. las proteínas. en particular en estudios de fosforilación. Leupeptin Pepstatina A PMSF Nota: con el kit Afyon ™ SDS-PAGE de preparación de muestra. Inhibidores Proteasas Aprotinina EDTA EGTA Leupeptin Pepstatina A PMSF Concentración en Enzimas diana el Tampón de lisis 1-2 µg/ml 1-10 mM 1-10 mM 1-2 µg/ml 1µg/ml (17-170 µg/ml) O.1—1 mM Concentración en el Tampón de lisis 1 mM 1-10 mM 1-10 mM 1-2 µg/ml 1µg/ml (17-170 µg/ml) O. se puede controlar la cantidad de carga de la proteína mediante la cantidad de resina utilizada. para determinar la carga de proteína apropiada. mediante la acción del detergente Dodecilsulfato Sódico (SDS). Asegurar la carga de la cantidad correcta de proteínas en el gel. es importante determinar la concentración de proteínas por las siguientes razones: 1. A menudo.1—1 mM Proteasas de Serina Mg++/Mn++ Metaloproteasas Ca++ Metaloproteasas Proteasas de Serinas. para 5 µg de proteína se utilizan 20 µl de resina Afyon. Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la extracción de proteínas. Cisteinas Proteasas de Aspartico Proteasas de Serina Inhibidores Fosfatasas  . Información para pedidos K-02101-025 Afyon ™ SDS-PAGE ssmple preparation kit Página 5 . cualquier actividad proteásica.  Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis. Cisteinas Proteasas de Aspartico Proteasas de Serina 3. Por ejemplo.  Trabajar rápido y mantener las muestras en frío durante todo el proceso. Medición de proteína total Previamente a la electroforesis. es importante evitar.Análisis de Proteínas Con la rotura celular. se requiere hacer experimentos preliminares con cantidades seriadas de proteínas. La cantidad de proteína óptima a cargar dependerá de la prevalencia de la proteína de interés y de la sensibilidad del anticuerpo primario. puede ser interesante reducir la actividad de la fosfatasa alcalina. Tabla 3. En la tabla 3 se muestran los inhibidores deproteasa y fosfatasa de uso más habitual. Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un mayor ruido de fondo y unión no específica de los anticuerpos. se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés. se revisten con carga negativa. Además de inhibir la actividad de la proteasa. En primer lugar. evitando la necesidad de determinar la concentración de proteína.

 Rango lineal pequeño. Descripción del método Existen diversos métodos para medir la proteína total de una muestra. Esto se logra con la realización de un ensayo de concentración crecientes. Elección de un ensayo de proteínas Absorvancia Tabla 4. aunque se puede utilizar cualquier proteína producida en el laboratorio o disponible comercialmente. En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva estándar. Bradford y Ácido Bincocinico (BCA) (Tabla 4). Métodos físicos para la dirupción de muestras Ensayo Bradford Descripción El colorante azul de Coomasie se une a las proteínas y sufre un cambio de absorvancia Ventajas La realización de los ensayos son generalmente rápidos y sencillos Inconvenientes  Interferencia de SDS o de otros detergentes a altas concentraciones . metricamente  Menos varia(reacción de ción proteíBiuret) na-proteína que en el método Bradford. Si la cantidad de proteína cargada por carril es la misma. El tiempo de da en literatura ensayo puede ser mayor que en otros métodos  No es práctico para grupos grandes de muestras  Se pueden formar precipitados Hay muchos kits de determinación de proteínas disponibles comercialmente. Interferencia con agentes quelantes o reductores del Cobre BCA Reducción de  Compatible iones de Cu2+ con la mayo mediante interación con las ría de deterproteínas.  La facilidad/rapidez del ensayo. lector de placas. el gentes  ComercialBCA se une a los iones de mente dispoCu1+ y forman nible en forun producto mato comcoloreado que patible con se puede meagentes dir espectroforeductores. de proteína pura. Proteína (mg) Figura 6. Realización de Western Blots cuantitativos o semi-cuantitativos. Los valores de absorvancia se trazan en función del contenido conocido de la proteína estándar utilizada. Se representa la absorvancia de las soluciones estándar que contienen la proteína conocida (línea roja). La concentración de la proteína de interés se puede determinar extrapolando la absorvancia obtenida en la curva patrón o estándar (línea verde de puntos). se debe realizar una curva estándar en cada ensayo. Estos ensayos colorimétricos se basan en las reacciones que se producen entre las proteínas de la muestra y los reactivos de detección.revisar el protocolo del fabricante para identificar sustancias interferentes. El contenido de la proteína de interés en la muestra (línea verde) se puede determinar mediante la extrapolación de la absorvancia obtenida a la cantidad o concentración de proteína correspondiente. se pueden comparar los niveles relativos de la proteína de interés. Similar al BCA (reacción de Biuret) Lowry Muy bien cita. La elección depende de muchos factores:  El equipo de lectura disponible en el laboratorio (espectrofotómetro.Electroforesis en Acrilamida 2. etc…). El estándar utilizado con mayor frecuencia es la albúmina de suero bovino (BSA). Con el fin de determinar la concentración de proteínas totales en una muestra. Un experimento de Western Blot cuantitativo es útil para estudio de cambios de expresión de proteínas o de modificaciones proteicas como la fosforilación. Página 6 . Ejemplo de la curva estándar de un ensayo de proteínas.  La cantidad de muestra disponible.  Los reactivos del tampón de lisis . Los más habituales son los métodos Lowry.

Análisis de Proteínas Tampón de carga de muestras Una vez se tienen las muestras de proteína. En condiciones no desnaturalizantes/no reductoras. manteniendo su carga intrínseca SDS El SDS se une a la proteína y da lugar a una linearización y a una uniformidad de la carga negativa de ésta.  Migra por delante de las proteínas. Molécula colorante pequeña:  Da color a la muestra para ayudar a la carga. Reactivo Glicero. se pueden conservar congeladas. Mecanismo de desnaturalización por SDS de las proteínas. Agentes reductores  Evita la oxidación de cisteínas.  Destruye la estructura secundaria/ terciaria y lineariza la proteína. si se necesitan condiciones no desnaturalizantes /no reductoras. Propósito Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar la muestra la fondo del pocillo y evitar que se extienda a los pocillos adyacentes. Mantiene el pH adecuado Azul de Bromofenol SDS Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y garantizan que las muestras se separan de forma reproducible. La proteína se encuentra en su estado conformacional. Advansta dispone de tampones de carga reductores y no reductores. Figura 7. Previamente a la carga del gel.  Unión a la proteína de forma regular. para asegurar que la desnaturalización/ reducción es total. de modo que se puede hacer el seguimiento del movimiento de las muestras en el gel.  Evita las interacciones hidrofóbicas y rompe los enlaces de hidrógeno. combinándolas con un tampón de carga y cargar la muestra en un gel de electroforesis. Detergente desnaturalizante  Cola hidrofóbica que rodea la esqueleto peptídico. se pueden utilizar inmediatamente. En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanismo de desnaturalización del SDS.  Completan la linearización de la proteína al romper los puentes disulfuro. Los componentes del tampón de carga varían. las muestras se someten a una incubación a 95ºC durante 5-10 minutos. beta mercaptoetanol o ditiotreitol. No se utilizarán ni SDS. teniendo cuidado en evitar ciclos repetitivos de congelación/ descongelación. Tabla 5. dependiendo de las condiciones deseadas. Componentes del tampón de carga. Información para pedidos R– 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x) R-03019-B10 Reducing protein sample loading buffer (2x) Tampón Tris Pepstatina A Beta Mercaptoetanol o DTT Página 7 . Los ingredientes típicos de un tampón de carga para detectar proteínas bajo condiciones desnaturalizantes/reductoras se describen en la Tabla 5. esta incubación no es necesaria. aportando carga negativa de forma proporcional al tamaño de la proteína. carril a carril y gel a gel. Alternativamente.

Los geles de SDS-PAGE están disponibles comercialmente o se pueden elaborar en el propio laboratorio. (tabla 7). determina el tamaño del poro. la mayoría de ensayos Western Blot. El tamaño de poro determina la ratio de separación de las proteínas. Están disponibles en diversos tamaños. Los geles pre-fabricados son muy prácticos pero debido al coste. según la cantidad de acrilamida y bisacrilamida. Los geles con mayor espesor. no son tan rentables como los elaborados por el usuario.5 10 12 15 20 Rango Peso Molecular (kDa) 25-500 15-300 10-200 10-45 5-40    Página 8 .Electroforesis en Acrilamida Gel de Electroforesis Si se requieren condiciones naturales para que el anticuerpo pueda detectar el epítopo. También se procesarán más lentamente y requieren tiempos de transferencia mas largos que los geles más delgados El porcentaje del gel. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis de proteínas Reactivos Acrilamida Bisacrilamida SDS Propósito Moléculas que polimerizan para formar cadenas. las proteínas cargadas negativamente. Forman uniones con las cadenas de acrilamida para formar un entramado. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reducción. Porcentaje 7. en la electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en el tampón de electroforesis. Las moléculas más pequeñas migran más rápidamente que aquellas con pesos moleculares mayores. Mantiene la linearidad y la uniformidad de carga de las proteínas según la electroforesis. Tabla 7. En esta situación. la tasa de migración viene determinada por su peso molecular. Generación de radicales libres que catalizan la reacción de polimerización.  Tabla 6. Tampón Tris Persulfato de Amonio TEMED Los espaciadores de gel (ver Figura 8) controlan el espesor del gel. A más porcentaje menos tamaño de poro. Elección del grosor del gel y del tamaño de poro El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína de interés dictan el espesor y tamaño de poro del gel. pueden aceptar mayor volumen de carga. cuando se someten a un campo eléctrico. Debido a que el SDS iguala la carga en todas las proteínas. las proteínas mantienen su estructura tridimensional y la migración en el gel depende de su masa: relación de carga de la proteína por encima de su tamaño. Sin embargo. se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes. En la tabla 6. Rango de separación de proteínas según el porcentaje de acrilamida. también conocida como PAGE nativo. se describen los componentes químicos de un gel de SDS-PAGE. Mantiene el pH adecuado. Aumenta la generación de radicales libres por el persulfato de amonio. migran al electrodo positivo.

Tras fijación de los lados. El péptido de bloqueo se mezcla con el anticuerpo primario antes de la incubación con la membrana y evita la uníón del anticuerpo a la proteína diana. Preparación del gel de electroforesis para la separación de proteínas. verter el gel resolutivo y esperar que el gel se polimerice. 4. Pueden estar marcadas por la detección por fluorescencia o quimioluminiscencia. si está disponible. Verter el ―stacking gel‖ y quitar el peine una vez el gel haya polimerizado. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre los cristales. Para mejorar la nitidez de la banda el gel resolutivo se corona con una acrilamida de menor porcentaje (stacking gel). es importante diseñar el experimento incorporando los controles y estándares necesarios para la validación de los resultados. La expresión cuantitativa de la proteína de interés puede normalizarse con la del control de carga para cada muestra. Colocar el peine en la parte superior del gel. Puede ser una línea celular que sobreexprese la proteína de interés.Análisis de Proteínas Elaboración del gel Si el gel de acrilamida esta elaborado en el laboratorio. Son una mezcla de proteínas purificadas de peso molecular conocido. El gel está listo para cargar las muestras y la electroforesis.     Página 9 . Se utiliza para verificar que la carga de proteína por carril es más o menos igual. Figura 8. los distintos reactivos se mezclan y se vierte en el molde. Los tipos de estándares y controles utilizados incluyen: 1. así como teñidos o incoloros. 2. Puede ser una muestra de tejido del que se conozca que expresa altos niveles de la proteína de interés. Generalmente. Diseño Experimental. 3. espaciadores lateral. Controles y Estándares Antes de la carga del gel. Se pueden utilizar otras especies como tejido de control si el anticuerpo tiene reactividad cruzada apropiada. Marcadores de Peso Molecular. Controles Positivos.  1. Se utilizan para verificar si la proteína de interés está dentro del rango de tamaño apropiado. así los niveles de proteínas se pueden comparar de forma cuantitativa. Péptidos de bloqueo   Algunos proveedores ofrecen péptidos de bloqueo para sus anticuerpos. Disponible en diversos intervalos de pesos moleculares. formado por el conjunto de dos cristales. espaciador inferior. Estos estudios demuestran que el anticuerpo utilizado se une de forma específica a la proteína de interés. Similar a los ―housekeeping genes‖ en Biología Molecular. Las versiones preteñidas se utilizan para controlar el progreso de la electroforesis y comprobar la eficacia de la posterior transferencia. peines y un sistema de sujeción (Figura 8). Controles de carga   Como norma general se utilizan proteínas con niveles de expresión constante para todas las muestras.      2. dónde la acrilamida se polimeriza en aproximadamente 30 minutos.  Para verificar si el anticuerpo primario se une a la proteína correcta. Por tanto no se detectará ninguna banda. son una muestra de la proteína de interés purificada. Lavar los pocillos con ddH20. Algunos tratamientos pueden alterar la expresión de estas proteínas ―housekeeping‖.

El aumento de la resistencia. del electrodo negativo.8 Gly Proteinas Resolving Gel pH 8. Normalmente se cargan de 20 a 40 µg de proteína total por carril. Página 10 . La glicina empieza a perder su carga a pH 6. Concentración de bandas de proteínas por el flujo iónico en el sistema discontinuo de Laemmli. el gel se somete a un campo eléctrico generado por una fuente de alimentación. En este método.8 y ralentiza su movimiento. El progreso en el gel se monitoriza observando el frente coloreado por el colorante presente en el tampón de carga y la posición de los marcadores de tamaño siempre que estos estén teñidos.8) Gly Proteinas CL- Stacking Gel pH 6. Los iones de cloruro avanzan por delante de la Gly.8 Tampón de Electroforesis (pH 8. en el Stacking Gel. obliga a las proteínas a alejarse. El tampón utilizado durante la electroforesis. se aleja del electrodo negativo.3. La técnica de electroforesis más habitualmente utilizada es la de Laemmli.Electroforesis en Acrilamida Inicio de Electroforesis Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta. contiene Tris (mantiene el pH). Glicina (conductor electricidad) y SDS (mantiene las proteínas cargadas negativamente). Las proteínas se separan según su peso molecular por el   Figura 9. los valores de pH de la capa de gel de apilamiento o concentración (Stacking Gel) y el gel de resolución (Resolving Gel) son diferentes. aumenta su carga negativa y se mueve por delante de las proteínas. de forma apilada. Muestra (pH 6. debido a un mayor pH del ―Resolving Gel‖. La glicina. Es importante conocer de antemano. la glicina. el volumen que se puede cargar por pocillo. Una vez finalizada la carga. Con la aplicación de un campo eléctrico. La figura 9 ilustra el flujo de iones durante la electroforesis. para así evitar sobrecargas que pueden dar lugar a la pérdida de muestra o derrames en pocillos adyacentes.3)    La glicina tiene carga negativa en el tampón de electroforesis a pH 8.

Previamente a la transferencia. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas. La mayoría de los sistemas de transferencia utilizan la generación de un campo eléctrico para conducir a las proteínas desde el electrodo negativo al positivo. un mayor ruido de fondo. ofrece una mayor resistencai mecánica. Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre -cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamaño de minigel. Los sistemas de transferencia están disponibles en formato semiseco o húmedo. un estrecho contacto entre el gel y la membrana.Análisis de Proteínas 4. Figura 8. La membrana de PVDF. La membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiempo y elimina la contaminación accidental de las membranas con guantes o tijeras contamindas. Información para pedidos L-08001-010 L-08002-010 L-08003-010 Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm Membrana Nitrocelulosa 0. La figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la membrana en un transferencia semiseca o húmeda. con el objetivo de reducir el ruido de fondo al utilizar métodos de detección de fluorescencia. SDS (opcional) y metanos (para membranas de nitrocelulosa). sin embargo no son apropiados para transferencia de proteínas de gran tamaño (>70 kDa) y pueden causar. Ambos métodos requieren. permitiendo así que la hibridación de un anticuerpo las pueda detectar. las diferencias en sus características puden influir a la hora de la elección. Los sistemas semisecos son más rápidos y requeiren menor cantidad de volumen de Tampón que los sistemas húmedos. Transferencia de proteínas a una membrana. las proteínas se transfieren a una membrana. para una transferencia efectiva de las proteínas. membranas PVDF de baja autofluorescencia.45 µm 8x10 cm Membrana Nitrocelulosa 0.22 µm 8x10 cm Página 11 . tanto el gel como la membrana se equilibran en una solución tampón pre-enfriada. Glicina. según el sistema de detección. Recientemente se han desarrollado. Transferencia a una Membrana Una vez la electroforesis del gel ha terminado. resistencia la SDS y una mayor unión que la nitrocelulosa. Aunque ambas funcionan bien en experimentos de inmunotransferencia. el tampón de transferencia contiene Tris. Típicamente.

Electroforesis en Acrilamida A continuación se describen algunas sugerencias para la consecución exitosa de una transferencia:  Bloqueo El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incubando con una solución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo. Disminuir el voltaje o el tiempo si fuera necesario. La membrana debe ser desteñida antes del proceso de transferencia. se pueden seleccionar otras soluciones de bloqueo alternativas. WesternBright. Las proteínas más pequeñas se transferirán más rápidamente y pueden atravesar la membrana. Es preferible. Reducir o eliminar el SDS o utilizar una membrana con un tamaño de poro menor puede ayudar a una mayor retención de la proteína.   Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo y de lavado para su línea de reactivos de detección.. 500 ml AdvanBlockTM-PF. como la leche descremada en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA). cuando se inicia un nuevo protocolo.  Evitar la manipulación de las membranas con las manos desnudas. La primera elección. . ya que es más rentable que el BSA. TBS. 200 ml AvantTM Buffer Pouches . sin embargo y debido a la presencia de biotina en las fosfoproteínas. Las burbujas de aire entre el gel y la membrana pueden causar transferencia defectuosa y desigual. Las proteínas y aceites de la piel pueden adherirse a la membrana y pueden dar lugar a manchas no deseadas en la membrana.TBS Página 12 . A menudo. son soluciones a base de proteínas. el uso de agentes bloqueantes no proteicos.que facilitan una rápida y fácil preparación Información para pedidos R-03024-D50 R-03023-D20 R-01038-020 R-01039-020 AdvanWashTM. puede que no sea la mejor elección cuando se van a utilizar anticuerpos fosfoespecíficos o en métodos de detección de biotina. Incrementar la cantidad de SDS y disminuir la concentración de Metanol pueden facilitar la transferencia de proteínas de gran tamaño. para estas y otras situaciones. es la utilización de la leche descremada en polvo. un sistema de refrigeración o hacer la transferencia en una cámara fría. El colorante Ponceau S puede utilizarse para teñir la membrana y asegurarse de la eficacia de la transferencia. Ajustar las condiciones de transferencia al tamaño de la proteína. Es aconsejable utilizar tampón frio. La tinción con Coomassie puede usarse para la tinción del gel una vez realziada la transferencia y comprobar los residuos de proteína en el gel. Se pueden eliminar haciendo rodar suavemente una pipeta Pasteur por encima del ―sándwich‖ formado por el gel/ membrana/papel de filtro.. Una incubación durante una hora (temperatura ambiente o a 4ºC) suele ser suficiente para un bloqueo de los lugares de unión no específicos del anticuerpo.PBS AvantTM Buffer Pouches . así como soluciones tampón en polvo de PCS. No permitir un sobrecalentamiento durante la transferencia.    El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampón Tris salino) o en PBS (Tampón Fosfato salino). se puede añadir también detergente Tween 20. Si los niveles del ruido de fondo son demasiados altos. La aparición de marcadores de tamaño preteñidos en la membrana es indicación que se ha completado la transferencia.

Tiempo requerido para su producción Coste de Preparación Largo Mayor coste . Hibridación del Anticuerpo. burro u oveja y son finalmente purificados y probados. o por modificaciones químicas (glicosilación fosforilación) o por diferencias en la secuencia peptídica debido a la presencia de polimorfismos. las células que sintetizan anticuerpos se aíslan del bazo del animal y se fusionan con células del mieloma. reconocer al antígeno en condiciones de desnaturalización/reducción de la proteína. Los geles nativos se pueden utilizar cuando los anticuerpos requieren de la proteína plegada para el reconocimiento del antígeno. comúnmente conejo. Reactividad cruzada potencial  Reactividad cruzada menos probable. El primer paso en la producción de ambos anticuerpos. cabra.  Potencial para reconocer otras proteínas que contengan el epítopo. Los dos tipos tienen distintas ventajas y desventajas y se diferencian según la forma en la que se sintetizan. Más corto Anticuerpos Primarios: Monoclonal vs Policlonal. Después del proceso de bloqueo. es la inyección de un antígeno en un animal. Variabilidad Tolerancia a condiciones variables Poca tolerancia Más tolerante a conpuede dejar de diciones variables. tanto anticuerpos primarios monoclonales como policlonales. Anticuerpos Monoclonales Reconocimiento epitopo y sensibilidad  Reconocimiento de un único epítopo  Menos sensibilidad debido a que sólo un anticuerpo se une a cada proteína Anticuerpos Policlonales  Reconocimiento múltiples epítopos en una proteína  Más sensible debido a los multiples lugares de unión de anticuerpo en cada proteína.  Reactividad cruzada más probable. para provocar una respuesta inmune.Análisis de Proteínas 5.  Reactividad cruzada con otras especies más probable.  Bueno para proteínas poco abundantes.  Mayor ruido de fondo potencial debido al reconocimiento de multiples epítopos.reMenor coste quiere personal capacitado y equipamiento especializado. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales. Tabla 8. los anticuerpos reconocen una secuencia de aminoácidos pequeña (epítopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de la proteína en condiciones desnaturalizantes y reductoras. Página 13 . Los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir del suero del animal. En general. Lo hibridomas resultantes secretan anticuerpos al medio de cultivo. Algunas características de los anticuerpos monoclonales y policlonales se describen en la Tabla 8. la membrana se incuba con el anticuerpo primario. Los hibridomas con secreción más estable se seleccionan y pueden ser cultivados indefinidamente. el cual se analiza y determina la afinidad al antígeno. Los lotes de un mismo hibridoma son muy estables. Los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epítopos del antígeno y en cambio los monoclonales reconocen un único epítopo de la proteína. Propenso a cierta variabilidad entre lotes. En la transferencia Western se pueden utilizar. Para la síntesis de un anticuerpo monoclonal.

IgG2a. IgM. la abundancia de la proteína en la muestra y la sensibilidad del sistema de detección afectarán a la cantidad de anticuerpo a utilizar. 500 µl Después de la incubación con el anticuerpo primario. PBS. También es posible una incubación a 4ºC durante toda la noche. o sea. ya que los anticuerpos específicos para sub-clases se utilian mayoritariamente. IgE) y posiblemente la subclase (IgG1. En métodos de detección indirectos (sección 6). Para anticuerpos monoclonales se debe considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG.  Página 14 . Si el primer Ac es de conejo. TBST o en un tampón de disolución de anticuerpo comercial. Durante la incubación. IgA. pero a menudo la concentración óptima de anticuerpo debe determinarse empíricamente.  Nota: Advansta ofrece una línea completa de anticuerpos secundarios marcados para detección mediante quimioluminscencia o fluorecencia. es necesario un anticuerpo secundario apropiado. Un menor volumen puede utilizarse si la membrana se sella dentro de una bolsa e incuba en un agitador orbital.  Generalmente. En algunos casos. e incubar en un agitador de vaivén. el segundo Ac debe ser anti-conejo. El fabricante puede recomendar una cantidad inicial. 250 µl Anticuerpo Secundario conjugado HRP cabra-anti-ratón. 50 µl IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón. 50 µl IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo. en experimentos de doble etiquetado u otras aplicaciones. deber ser producido en otra especie distinta a conejo. debe ser totalmente lavada de la membrana. 500 µl Anticuerpo Secundario conjugado APC cabra-anti-conejo. A continuación se describen las consideraciones a tener en cuenta a la hora de la elección de un anticuerpo secundario:  Las especie del primer Ac dicta la elección del Ac secundario. la membrana debe someterse a agitación suave y sumergida en la disolución. IgD. puede reutilizarse.  Información para pedidos R-05051-050 R-05051-250 R-05052-050 R-05051-250 R-05071-500 R-05072-500 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo. TBST o PBST). un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente suele ser suficiente. ya que puede eliminar la actividad de la peroxidasa e interferir en los métodos de detección. se procede a la eliminación del excedente mediante tampones de lavado (TBS. La afinidad del anticuerpo. Si se utiliza acida sódica como conservante. Un anticuerpo con amplia especificidad inmunoglobulínica debería ser suficiente.Hibridación Anticuerpos Incubación de los anticuerpos El anticuerpo primario se diluye en tampón de bloqueo.…). la disolución con el anticuerpo. 250 µl IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón.

Quimioluminiscencia. Página 15 . 1. Detección directa e indirecta de proteínas Tabla 9.Análisis de Proteínas 6. Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan comúnmente anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP). que puede ser detectada mediante la exposición de la membrana a una película de rayos X o captada de forma digital utilizando una cámara CCD. la intensidad de la señal puede variar con la incubación o el tiempo de exposición. fácil de documentar. 20x25 cm. Fluorescencia y 3. En la detección indirecta. Los anticuerpos se pueden marcar mediante kits disponibles en le mercado u obtenerlos ya marcados. señal debido a la  Menos posibilidaunión de múltides de unión no ples Ac secundaespecífica. Detección.porque se basa en una reacción enzimática. rios a cada Ac primario. 100 uds Película Rayos X LucentBlueTM . la membrana puede tratarse para re-utilizarse. La reacción entre el encima y el substrato produce luz. la película tiene un rango dinámico limitado. 13x18 cm. Westernbright Quantum y WesternBright Sirius.  La inmunorreactividad del Anticuerpo puede estar afectada por el marcaje. no son posibles detecciones multiplex (detección de mas de una proteína. es el anticuerpo secundario el que está conjugado con un marcaje detectable. La detección de la proteína se puede hacer mediante métodos directos o indirectos. Los métodos directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable.  Puede ser más costoso. Métodos de detección. Colorimetría. 100 uds la detección de señales de quimioluminiscencia en experimentos realizados con los substratos WesternBright HRP.  Más pasos. un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer anticuerpo. se pueden hacer multiples exposiciones en películas de rayos X. Lo métodos indirectos utilizan dos anticuerpos. biotina o molécula fluorescente. incluyedo WesternBrightTM ECL. 2. Ventajas: muy sensible. sólo un color de reacción) Figura 11 . Inconvenientes Nota: LucentBlueTM es una película que ha sido optimizada para Información para pedidos L07014-100 L07013-100 Película Rayos X LucentBlueTM . Quimioluminiscencia.el mismo Ac secundario puede utilizarse para diversos anticuerpos de la misma especie. Los métodos más comúnmente utilizados para detectar proteínas son: 1. como un enzima. semicuantitativa . La figura 11. cada uno con sus ventajas e inconvenientes. Inconvenientes: requiere una habitación oscura (película rayos X) o sistemas de imagen caros.  Mayor posibilidad de unión no inespecífica. Ventajas e Inconvenientes de los métodos de detección Indirecto Ventajas Directo  Amplificación de  Menos pasos.ilustra los métodos de detección directos e indirectos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e inconvenientes de los dos métodos.  Versátil .

concentración de muestra y tipos experimentales. Nota: WesternBright TM MCF permite la detección. La cantidad de colorante convertido es proporcional al cantidad en la muestra. el color se desvanece con el tiempo. Fluorescencia. El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo. que cuando es ―excitado‖ emite luz. Este procedimiento puede conservar las muestras. Inconvenientes: no es tan sensible como los otros dos métodos. no requiere cámara oscura. aporta datas cuantificables. Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento pueden ser costosos. pueden usarse Ac primarios marcados (para proteínas abundantes) y eliminar pasos. Las membranas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en protocolos de lavados para reutilización. fácil documentación de resultados. pero consume mucho tiempo. La luz emitida. no se requiere el uso de una cámara oscura. Re-utilización de la membrana Después de captar la imagen. o diferentes isoformas de la proteína. se pueden detectar múltiples proteínas de forma simultanea. Información para pedidos K-12042-D10 K-12042-D10 K-12045-D20 K-12042-D10 WesternBrightTM Quantum Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) WesternBrightTM Sirius Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) WesternBrightTM ECL Western Blotting HRP Substrate (para 2000 cm2 de membrana) WesternBrightTM ECL Spray Página 16 . de dos proteínas en una sola membrana. se detecta mediante un dispositivo capaz de medir la fluorescencia o mediante una cámara CCD provista con los filtros de longitud de onda apropiada. las membranas se pueden documentar fácilmente mediante fotografía. Perfecto para aquellos experimentos en los que se necesite comparar la proteína de interés con un control de carga. La intensidad de la tinción puede ser medida por espectrofotometría o por un densitómetro. 3. no es tan sensible como la quimioluminiscencia (puede no ser apropiado para proteínas poco abundantes). Información para pedidos K-12021-010 WesternBrightTM fluorescent Western blotting kit Nota: Advansta suministra una línea completa de reactivos de detección de quimioluminiscencia optimizados para los diferenentes métodos. apto para ensayos multiplex con múltiples colorantes. La imagen se digitaliza para su análisis. Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incrementarse utilizando el sistema streptavidina/ biotina). El enzima convierte el colorante en un producto insoluble que es visible en la membrana. es ideal para comparar la proteína de interés con un control de carga. Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado previamente a un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina).Detección 2. mediante la detección fluorescente multicolor. Colorimetría. la membrana puede ser tratada para volver a ser utilizada para la detección de otra proteína. Ventajas: sencilla de realizar. amplio rango dinámico. Con la detección multiplex de fluorescencia.

21) Lavado inapropiado (ver 25) Unión ineficiente del Anticuerpo (ver 3.Análisis de Proteínas 7.18.19) Bloqueo Insuficiente (ver 24) Transferencia Inadecuada (ver 2) La proteína es mayor a lo esperado (ver 8. 9) Bandas Difusas (ver 13) El gel corre demasiado rápido o demasiado lento (ver 20. Bandas artefactuales D. Ruido de fondo excesivo Preparación Muestra (ver 1) La proteína es menor de lo esperado (ver 7) Bandas Incompletas (ver 12) El gel polimeriza demasiado rápido o demasiado lento (ver 17. Tamaño incorrecto de la banda C. Problemas en la electroforesis E. 6) Frente corre curvado ―smiling‖ (ver 22) Elección de Membrana (ver 27) Bandas distorsionadas (ver 16) Frente corre inclinado (ver 23) Unión no específica del Anticuerpo (ver 28) Revelado de la película (ver 29) Página 17 . 4) Rayas Verticales (ver 14) Bandas Múltiples (ver 10) Distorsión Lateral (ver 15) Las bandas aparecen muy altas o muy bajas en el gel (ver 11) Contaminación Reactivos (ver 26) Problemas con los reactivos (ver 5. Solución de Problemas Solución de problemas con Western Blot A. No se puede ver la proteína de interés B.

fosforilación. Preparación Muestra Causa(s) Extracción ineficiente Baja expresión de la proteína en el tejido o las células La proteína se ha degradado durante la extracción 2. Congelación/descongelación de la muestra Proteína variante (Splicing) Solución Uso de inhibidores de proteasa/muestras frescas Consultar literatura/utilizar controles apropiados Consultar literatura para encontrar aditivos que puedan eliminar grupos químicos 8. sustituir si es muy delgada 3.Revisar el protocolo/disminuir metanol rrectamente/demasiado metanol en el tampón Proteínas de mayor tamaño necesitan mas tiempo/voltaje Contacto insuficiente entre el gel y la membrana Repetir con un tiempo mayor/mayor voltaje Revisar la almohadilla de fibra.conseguir un nuevo reactivo si no hay señal Evitar utilizar disoluciones conteniendo este agente conservante La disolución es antigua o está almacena. Transferencia indadecuada Solución Intentar métodos alternativos. juntar múltiples muestras Usar inhibidores de proteasa en le tampón de lisis Tampón de transferencia preparado inco. pulso intactos de centrífuga previo a la carga de la muestra Página 18 . Problema 7. incluir un control positivo 9.Incrementar la concentración del Antina o el anticuerpo es antiguo/débil cuerpo. comprar un anticuerpo nuevo y almacenarlo de forma apropiada El Anticuerpo tiene reactividad cruzada débil con las especies de interés Probar con un Anticuerpo primario de diferente origen El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava. Proteína más pequeña de lo esperado Mezclar conjugado + substrato en un tubo. Conjugado/Substrato Inac.puentes disulfuro Uso de DTT en tampón de muestra. Proteína más larga de lo esperado y/o bandas múltiples Proteínas modificadas de forma natural (glicosilación. concentrar utilizando Afyon. Unión ineficiente del Anticuerpo secundario Elección de especies errónea Utilizar un agente de bloqueo alternativo (ej. Reactivo de detección (ECL) B. Problema 1. disminuir do la concentración de sales el tampón de lavado Antígeno enmascarado por el agente bloqueante (ej.…) 4. Proteína más larga de lo esperado Agregado de proteínas . o luminiscencia en oscuridad .…) Usar Anticuerpos dirigidos contra la especie del Anticuerpo primario Concentración insuficiente del Anticuerpo Aumentar concentración o comprar uno o Anticuerpo antiguo Anticuerpo nuevo 5. incluir control positivo en el gel Cargar más cantidad de proteína total en el gel. etc…) Cambio de la expresión de la proteína en la línea celular Utilizar cultivos anteriores. Unión ineficiente del Anticuerpo primario Baja afinidad del anticuerpo por la proteí.Solución de Problemas A.Usar menor numero de lavados.: BSA.: Leche. acetilación.Comprar reactivo nuevo da de forma inapropiada Causa (s) Proteólisis.Reactivos viejos o inestables tivo Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sódica 6.

Disminuir concentraciones. Problema 17. El gel polimeriza muy lento TEMED/AP Insuficiente La disolución de AP ha perdido su actividad Página 19 . apretar hasta encontrar primera resistencia Usar guantes en la preparación de los geles Uso de Etanol y H2O desionizada en la limpieza de los cristales Burbujas introducidas en el gel por el dispositivo de llenado (jeringa o pipeta) Burbujas de aire atrapadas por el peine No expulsar totalmente el volumen de la mezcla del gel Insertar el peine en ángulo y antes que se polimerice el gel Solución Repetir con TEMED y AP Preparar AP fresco Aplicar isopropanol antes de verter el gel de apilamiento (stacking gel) Incrementar la cantidad de TEMED/AP Preparar disolución fresca de AP D. Bandas difusas Migración lenta Las muestras no se han calentado correctamente El SDS del tampón es antiguo 14. disminuir para proteínas de gran tamaño Solución Usando una pipeta. asegurarse de la correcta preparación del tampón Asegurarse que las muestras se han incubado durante 2 min a 90ºC antes de cargarlas en el gel Preparar SDS nuevo para le tampón de muestra 11. intentar un rio o secundario experimento de bloqueo de péptido (eliminará la proteína de interés) Incrementar el porcentaje para proteínas de pequeño tamaño.Análisis de Proteínas B. El gel no polimeriza Causa (s) Fallo al añadir el TEMED y AP La disolución AP es estable durante dos o tres días a 4ºC El oxígeno inhibe la polimerización 18. Bandas Extras Causa(s) Solución Unión no específica del Anticuerpo prima. Distorsión lateral de las bandas 16. Problema 12. Rayas en los carriles Alta concentración de sales en la muestra Disminuir la concentración de sal en el tampón de muestra Muestra muy concentrada o insuficiente SDS Incrementar concentración/usar más SDS Minimizar el tiempo de carga 15. La proteína aparece muy Porcentaje erróneo/no óptimo del gel alta o muy baja en la membrana C. Distorsión de las bandas Difusión de la muestra en los pocillos durante la carga Fallo en la completa polimerización de los Incrementar TEMED/AP pocillos Presión aplicada excesiva a la hora de montar el gel Burbujas en el gel debido al uso de cristales sucios No apretar en exceso los tornillos del sistema. hacer rodar por encima del paquete gel/membrana para forzar la salida de las burbujas Incrementar voltaje. Bandas Incompletas Causa(s) Burbujas entre el gel y la membrana 13. Problema (continuación) 10.

Reducir los tiempos de exposición.Solución de Problemas D. El polimeriza demasiado rápido 20. o la leche contiene el antígeno de interés Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright MCF. Condiciones de lavado inapropiadas Número insuficiente de lavados Concentración insuficiente de detergente Incrementar la concentración de detergente o usar detergentes más fuertes (SDS. manteniendo la relación entre ambos Revisar protocolo. Unión no específica del Anticuerpo primario o secundario Concentración muy alta del Anticuerpo o no purificado por afinidad Mucha cantidad de proteína en el gel 29. NP-40) 26.Las membranas PVDF pueden tener más brana ruido de fondo que las de Nitrocelulosa Algunas membranas tienen alta autofluorescencia Membrana seca 28. refrigerar Aguantar el gel en ángulo. Tiempo de carrera inusualmente largo Causa(s) Cantidad excesiva de TEMED/AP Buffer de electroforesis demasiado concentrado Voltaje insuficiente 21. intentar con Anticuerpo monoclonal o purificado por afinidad Disminuir la cantidad de proteína 27. algún Anticuerpo primario puede requerir un bloqueante proteico La disolución está demasiado diluida Tiempo de bloqueo muy corto Algunos detergentes no son efectivos a bajas temperaturas Incluir BSA o leche en la disolución AdvanBlock-PF utilizada en la dilución del Anticuerpo primario Incrementar con un 5% la disolución Incrementar el tiempo de incubación Incubar a temperatura ambiente en vez de toda la noche a 4ºC Incrementar el número de lavados o la duración de cada uno de ellos 25. Problema 24. Frente curvado (smiling) Tampón demasiado diluido Migración demasiado rápida Generación de calor 23. reemplazar tampón en caso necesario Disminuir voltaje Disminuir voltaje. preparar nuevos Elegir membranas de Nitrocelulosa Utilizar únicamente membranas PVDF con baja autofluorescencia con Western Blots fluorescentes Estar seguro que la membrana esta húmeda durante todo el proceso Disminuir la concentración de Anticuerpo. Bloqueo insuficiente Causa(s) La presencia de Biotina en la leche es incompatible con el uso de Estreptavidina. Contaminación de los reactivos Crecimiento bacteriano o fúngico en los tampones Revisar la turbidez de los tampones. diluir el tampón en caso necesario Incrementar voltaje Revisar el protocolo. Elección de tipo de mem. Tiempo de carrera inusualmente corto 22. lentamente volver a posición vertical Solución Usar BSA E. Problema (continuación) 19. colocar una esquina en el tanque inferior del sistema de electroforesis. Frente inclinado Burbuja atrapada entre los cristales en la parte inferior del gel Solución Reducir la cantidad de TEMED/AP. Sobreexposición de la imagen El tiempo excesivo de exposición a la pelí. si no es cula o al CCD posible incrementar la dilución de los Anticuerpos o cargar menor cantidad de muestra Página 20 .

Aspártico (Asp. L) UCU UCC UCA UCG C Serina (Ser.7 10 pmol o 6x1012 moléculas 6. M) Valina (Val. A) Glicina (Gly. S) UAU UAC UAA UAG A Tirosina (Tyr. L) Prolina (Pro. W) Arginina (Arg.4 0.000 1 µg 100 pmol o 6x1013 moléculas 20 pmol o 1. G) Tabla 11. N) Lisina (Lys. C) STOP Triptófano (Trp.5 3. H) Glutamina (Gln. P) Isoleucina (Ile. T) AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG Histidina (His.17 1. V) Serina (Ser. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale Proteina IgG IgM IgA Proteina A Avidina Estreptavidina Albumina suero bovino A280 Uds por 1 mg&ml 1. R) Primera posición C Leucina (Leu. T) STOP UGU UGC UGA UGG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG CAU CAC CAA CAG Treonina (Thr. Q) Asparagina (Asn. R) A G GCU GCC GCA GCG Alanina (Ala.2x1013 moléculas 1 nmol 10 µg 50 µg 100 µg 150 µg Tabla 12. S) Arginina (Arg. Código genético y abreviaciones de los aminoácidos Segunda Posición U UUU UUC U UUA UUG Fenilalanina (Phe.000 150.2 1. Glutámico (Glu. E) CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG G Cisteina (Cys. Conversión entre masa y moles de proteína Peso molecular (Da) 10.3 0. F) Leucina (Leu.7 pmol o 4x1012 moléculas Página 21 . I) Metionina (Met.Análisis de Proteínas 8. K) A.000 20. Herramientas y Referencias Técnicas g de Soluto Molaridad de una disolución = [Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolución) Tabla 10.35 1.000 100. D) A.

1 113.1 115. 1.4 años R S T V W Y Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Peo Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Masa molecular media 71. AdvanBlock™.1 91. Vida media de los Radioisótopos más habituales Radioisótopo Carbono-14 (14C) Iodo-125 (125I) Fósforo-32 (32P) Azufre-35 (35S) Tritio (3H) Vida media 5. The Advansta logo is a registered trademark of the Company.2 57. Afyon™.07 186. Prefijos métricos M K m µ mega Kilo mili micro 106 103 10-3 10-6 n K f a nano pico femto atto 10-9 10-12 10-15 10-18 Tabla 16.730 años 60 días 14.1 99. All other trademarks.08 103. Adva nWash™.1 156.05 137.2 131.2 128. Avant™..1 129. unidad de masa molecular mol molaridad.2 Copyright © 2011 Advansta.08 101.12 128. Abreviaciones ds ss bp kb Da mol M doble cadena ( como en dsDNA) cadena sencilla (como en ssDNA) pares de base kilobase. service marks and tradenames appearing in this brochure a re the property of their respective owners.3 días 87.4 días 12.2 114.2 113.000 bases o pares de base Dalton. Página 22 . moles de soluto por litro de disolución F G H I K L M N P Q Tabla 15.2 87. Masa molecular media de los aminoácidos Códigos Aminoácidos A C D E Tabla 14.1 147.Herramientas y Referencias Tabla 13. LucentBlue™ and WesternBright™ are trademarks of the Company.2 163. All rights reserved.

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