Análisis de Proteínas

Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección

advansta

Análisis de Proteínas

Análisis de Proteínas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés. Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras. Esta guía de laboratorio describe los pasos involucrados en la realización de un Western blot, incluyendo la preparación de muestras, la separación de proteínas, la transferencia y la detección.

Índice de Contenidos
1. Western Blot: Visión General 2. Preparación de las muestras 3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida 4. Transferencia Electroforética 5. Hibridación Anticuerpos 6. Detección 7. Solución de Problemas 8. Herramientas y Referencias Técnicas

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1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4. Página 1

Se utiliza una pipeta para cargar las muestras en los pocillos del gel Una fuente de alimentación proporciona el voltaje El gel se coloca dentro de un tanque de electroforesis lleno de tampón. Se prepara un gel de acrilamida. Se añade un colorante de carga. de forma proporcional a la masa de cada proteína. Los materiales de partida incluyen planta. El gel y la membrana se coloca entre papel de filtro y almohadillas de esponja. Figura 2. Transferencia electroforética a una membrana Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana. Transferencia de Proteínas a la Membrana Página 2 . a. levadura. Figura 3. Electroforesis en gel de Acrilamida Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. Un cartucho aplica presión y mantiene un estrecho contacto entre el gel y la membrana. Preparación de muestras b. La proteínas con carga negativa migran desde el ánodo. Electroforesis en Acrilamida c. Se aplica voltaje en el tanque de transferencia y las proteínas migran desde el gel a la membrana. tejidos animales.. Procesos adicionales logran el fraccionamiento subcelular Se usan tampones conteniendo detergentes para la lisis celular Figura 1. dónde quedan inmovilizadas. El dodecilsulfato de sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere. la migración de la muestra se puede monitorizar. Preparación de la muestra Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química. células cultivadas. La disrupción mecánica con un homogenizador disgrega los tejidos. Así. una carga negativa a cada una de ellas.Western Blot: Visión General 1. Western Blot: Visión General Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso. o bacterias. que conducirá la corriente. bisacrilamida.

células en cultivo. se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma específica al anticuerpo primario. Detección quimioluminiscente de las bandas de proteínas Página 3 . se procede a detectar la localización de la banda en la membrana. Para la detección de quimioluminiscencia. proporcionando una forma de detección. Figura 4. se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP). levadura. La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz emitid por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario. Hibridación de Anticuerpo Figura 5. Dicha luz puede ser detectada en una película de rayos X. A continuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana. Los materiales de partida incluyen tejidos vegetales. o de forma digital. o bacterias. mediante un sistema de captación de imágenes. Tras varios lavados de la membrana. e. Detección de las Bandas Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido. tejidos animales. la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción enzimática que da como resultado final la emisión de luz. Hibridación del Anticuerpo La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos.Análisis de Proteínas a.

NP-40. de la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico.Preparación de la muestra 2. frecuentemente. Disrupción mecánica que suele preceder a un proceso químico de lisis celular. se suelen lisar utilizando una solución tampón con detergente y sin la aplicación de métodos mecánicos. en muestras tisulares de plantas y animales. no iónicos si no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga negativa y positiva y la carga neta es 0. depende en parte de la localización. las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o mecánicos. A menudo. En la tabla 1 se resumen los métodos mecánicos que habitualmente se utilizan en la extracción de proteínas para inmunotransferencia. Soluciones Tampón y detergentes. más utilizados habitualmente. citoplasmática.Tejido animal o o riza utilizando un vegetal mortero y una almirez refrigerados La ruptura celular se Levaduras produce por agitación de las perlas de vidrio Pulverización en Nitrógeno líquido Perlas de vidrio Tabla 2. se requiere el uso de un proceso mecánico para la disrupción de la compleja matriz celular. sonda para romper las membranas celulares La muestra se pulve. Tipo de muestra Gran cantidad de tejido Células tisulares.. dentro de la célula. Deoxicolatos) Puede combinarse con métodos mecánicos. unida a la membrana. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida.Las proteínas citoplasmáticas se pueden unir a las proteínas del citoesqueleto. tejidos. En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampón y detergentes. Métodos físicos para la dirupción de muestras Método Licuadora Descripción La muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias Tubo de vidrio con pistón ajustado maja las células por acción de corte. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar según las características del grupo polar: iónicos si el grupo polar tiene carga positiva o negativa. mediante el uso de solución tampón que contiene detergentes. La elección de la substancia detergente. tales como el homogenizador Dounce Los detergentes Triton son suaves y no iónicos Para antígenos con niveles bajos de expresión pueden ser necesarios procesos de enriquecimiento Citoplasmático (unida a citoesqueleto) Tris-Triton Membrana mitocon. según el tipo de proteína y localización subcelular. La estructura química de los detergentes permite romper las membranas celulares y solubilizar las proteínas. según el tipo de proteína de interés y la localización subcelular Tipo/Localización Proteína de interés Nativa (no desnaturalizada) Citoplasmáticos (soluble) Detergente o Solución Tampón Detergente suave no iónico Tris-HCl TComentarios Evitar detergentes desnaturalizantes (SDS. afectando así a los procesos de fraccionamiento subcelular. útil para protocolos de enriquecimiento de proteínas mitocondriales o nucleares Homogenizador Dounce Homogenizador de ultrasonidos Ondas de sonido Células. Triton X-100 Lisado total de células NP-40. bacemitidas por una terias. Las células en cultivo. RIPA drial o nuclear (multiples detergentes). Triton X-100 Página 4 . RIPA. En la mayoría de ensayos. Preparación de la muestra Una adecuada preparación de la muestra es esencial para tener éxito en un ensayo de Western Blot. que va dirigida a enriquecer la proteína de interés dentro del extracto final. dentro de orgánulos celulares como el núcleo y las mitocondrias. Tabla 1.. de la proteína de interés. etc.

en particular en estudios de fosforilación. para 5 µg de proteína se utilizan 20 µl de resina Afyon. Por tanto. se puede controlar la cantidad de carga de la proteína mediante la cantidad de resina utilizada.1—1 mM Concentración en el Tampón de lisis 1 mM 1-10 mM 1-10 mM 1-2 µg/ml 1µg/ml (17-170 µg/ml) O. puede ser interesante reducir la actividad de la fosfatasa alcalina.Glicerofosfato EDTA EGTA Enzimas diana Fosfatasas Serina/ Treonina Mg++/Mn++ Metaloproteasas Ca++ Metaloproteasas Proteasas de Serinas. Por ejemplo. La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradación de proteínas:  Evitar excesivos ciclos de congelación/ descongelación.1—1 mM Proteasas de Serina Mg++/Mn++ Metaloproteasas Ca++ Metaloproteasas Proteasas de Serinas. evitando la necesidad de determinar la concentración de proteína. es importante determinar la concentración de proteínas por las siguientes razones: 1. Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la extracción de proteínas. cualquier actividad proteásica. se revisten con carga negativa. mediante la acción del detergente Dodecilsulfato Sódico (SDS). para determinar la carga de proteína apropiada. las proteínas. Asegurar la carga de la cantidad correcta de proteínas en el gel. Información para pedidos K-02101-025 Afyon ™ SDS-PAGE ssmple preparation kit Página 5 . durate la preparación de la muestra.  Trabajar rápido y mantener las muestras en frío durante todo el proceso. es importante evitar. En primer lugar. Leupeptin Pepstatina A PMSF Nota: con el kit Afyon ™ SDS-PAGE de preparación de muestra. Inhibidores Proteasas Aprotinina EDTA EGTA Leupeptin Pepstatina A PMSF Concentración en Enzimas diana el Tampón de lisis 1-2 µg/ml 1-10 mM 1-10 mM 1-2 µg/ml 1µg/ml (17-170 µg/ml) O. A menudo. Electroforesis en Acrilamida Las proteínas del extracto se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). se pueden separar en el gel según su tamaño (SDSPAGE).Análisis de Proteínas Con la rotura celular. Medición de proteína total Previamente a la electroforesis. Cisteinas Proteasas de Aspartico Proteasas de Serina 3. Además de inhibir la actividad de la proteasa.  Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis. se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés. En la tabla 3 se muestran los inhibidores deproteasa y fosfatasa de uso más habitual. se requiere hacer experimentos preliminares con cantidades seriadas de proteínas. La cantidad de proteína óptima a cargar dependerá de la prevalencia de la proteína de interés y de la sensibilidad del anticuerpo primario. Cisteinas Proteasas de Aspartico Proteasas de Serina Inhibidores Fosfatasas  . así Las proteínas. Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un mayor ruido de fondo y unión no específica de los anticuerpos. Tabla 3.

Proteína (mg) Figura 6. Métodos físicos para la dirupción de muestras Ensayo Bradford Descripción El colorante azul de Coomasie se une a las proteínas y sufre un cambio de absorvancia Ventajas La realización de los ensayos son generalmente rápidos y sencillos Inconvenientes  Interferencia de SDS o de otros detergentes a altas concentraciones . Un experimento de Western Blot cuantitativo es útil para estudio de cambios de expresión de proteínas o de modificaciones proteicas como la fosforilación. Si la cantidad de proteína cargada por carril es la misma. metricamente  Menos varia(reacción de ción proteíBiuret) na-proteína que en el método Bradford. Realización de Western Blots cuantitativos o semi-cuantitativos.  Rango lineal pequeño. Estos ensayos colorimétricos se basan en las reacciones que se producen entre las proteínas de la muestra y los reactivos de detección. Similar al BCA (reacción de Biuret) Lowry Muy bien cita. Descripción del método Existen diversos métodos para medir la proteína total de una muestra. Página 6 . Ejemplo de la curva estándar de un ensayo de proteínas.  Los reactivos del tampón de lisis . El estándar utilizado con mayor frecuencia es la albúmina de suero bovino (BSA). Bradford y Ácido Bincocinico (BCA) (Tabla 4). En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva estándar.revisar el protocolo del fabricante para identificar sustancias interferentes. etc…). Se representa la absorvancia de las soluciones estándar que contienen la proteína conocida (línea roja).Electroforesis en Acrilamida 2. de proteína pura. La elección depende de muchos factores:  El equipo de lectura disponible en el laboratorio (espectrofotómetro. Elección de un ensayo de proteínas Absorvancia Tabla 4. Los más habituales son los métodos Lowry. se pueden comparar los niveles relativos de la proteína de interés. Esto se logra con la realización de un ensayo de concentración crecientes. aunque se puede utilizar cualquier proteína producida en el laboratorio o disponible comercialmente. Interferencia con agentes quelantes o reductores del Cobre BCA Reducción de  Compatible iones de Cu2+ con la mayo mediante interación con las ría de deterproteínas. se debe realizar una curva estándar en cada ensayo. el gentes  ComercialBCA se une a los iones de mente dispoCu1+ y forman nible en forun producto mato comcoloreado que patible con se puede meagentes dir espectroforeductores.  La facilidad/rapidez del ensayo. La concentración de la proteína de interés se puede determinar extrapolando la absorvancia obtenida en la curva patrón o estándar (línea verde de puntos). lector de placas. El contenido de la proteína de interés en la muestra (línea verde) se puede determinar mediante la extrapolación de la absorvancia obtenida a la cantidad o concentración de proteína correspondiente. El tiempo de da en literatura ensayo puede ser mayor que en otros métodos  No es práctico para grupos grandes de muestras  Se pueden formar precipitados Hay muchos kits de determinación de proteínas disponibles comercialmente. Los valores de absorvancia se trazan en función del contenido conocido de la proteína estándar utilizada. Con el fin de determinar la concentración de proteínas totales en una muestra.  La cantidad de muestra disponible.

Molécula colorante pequeña:  Da color a la muestra para ayudar a la carga. Los ingredientes típicos de un tampón de carga para detectar proteínas bajo condiciones desnaturalizantes/reductoras se describen en la Tabla 5. Figura 7. Mantiene el pH adecuado Azul de Bromofenol SDS Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y garantizan que las muestras se separan de forma reproducible.  Unión a la proteína de forma regular. Tabla 5. las muestras se someten a una incubación a 95ºC durante 5-10 minutos. En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanismo de desnaturalización del SDS.  Completan la linearización de la proteína al romper los puentes disulfuro.  Destruye la estructura secundaria/ terciaria y lineariza la proteína.  Migra por delante de las proteínas. No se utilizarán ni SDS. dependiendo de las condiciones deseadas. si se necesitan condiciones no desnaturalizantes /no reductoras. Información para pedidos R– 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x) R-03019-B10 Reducing protein sample loading buffer (2x) Tampón Tris Pepstatina A Beta Mercaptoetanol o DTT Página 7 . La proteína se encuentra en su estado conformacional. Agentes reductores  Evita la oxidación de cisteínas. de modo que se puede hacer el seguimiento del movimiento de las muestras en el gel. se pueden utilizar inmediatamente. Mecanismo de desnaturalización por SDS de las proteínas.Análisis de Proteínas Tampón de carga de muestras Una vez se tienen las muestras de proteína.  Evita las interacciones hidrofóbicas y rompe los enlaces de hidrógeno. manteniendo su carga intrínseca SDS El SDS se une a la proteína y da lugar a una linearización y a una uniformidad de la carga negativa de ésta. teniendo cuidado en evitar ciclos repetitivos de congelación/ descongelación. Los componentes del tampón de carga varían. Advansta dispone de tampones de carga reductores y no reductores. Previamente a la carga del gel. Reactivo Glicero. Propósito Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar la muestra la fondo del pocillo y evitar que se extienda a los pocillos adyacentes. para asegurar que la desnaturalización/ reducción es total. Alternativamente. En condiciones no desnaturalizantes/no reductoras. Detergente desnaturalizante  Cola hidrofóbica que rodea la esqueleto peptídico. se pueden conservar congeladas. Componentes del tampón de carga. esta incubación no es necesaria. combinándolas con un tampón de carga y cargar la muestra en un gel de electroforesis. beta mercaptoetanol o ditiotreitol. carril a carril y gel a gel. aportando carga negativa de forma proporcional al tamaño de la proteína.

se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes. Tabla 7. la tasa de migración viene determinada por su peso molecular. Rango de separación de proteínas según el porcentaje de acrilamida. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis de proteínas Reactivos Acrilamida Bisacrilamida SDS Propósito Moléculas que polimerizan para formar cadenas. Forman uniones con las cadenas de acrilamida para formar un entramado. cuando se someten a un campo eléctrico. la mayoría de ensayos Western Blot. También se procesarán más lentamente y requieren tiempos de transferencia mas largos que los geles más delgados El porcentaje del gel. en la electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en el tampón de electroforesis. Los geles pre-fabricados son muy prácticos pero debido al coste.Electroforesis en Acrilamida Gel de Electroforesis Si se requieren condiciones naturales para que el anticuerpo pueda detectar el epítopo. las proteínas cargadas negativamente. En esta situación. migran al electrodo positivo. se describen los componentes químicos de un gel de SDS-PAGE. Están disponibles en diversos tamaños.  Tabla 6. según la cantidad de acrilamida y bisacrilamida. no son tan rentables como los elaborados por el usuario. Sin embargo. Elección del grosor del gel y del tamaño de poro El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína de interés dictan el espesor y tamaño de poro del gel. determina el tamaño del poro. Generación de radicales libres que catalizan la reacción de polimerización. pueden aceptar mayor volumen de carga. Porcentaje 7. Las moléculas más pequeñas migran más rápidamente que aquellas con pesos moleculares mayores. Tampón Tris Persulfato de Amonio TEMED Los espaciadores de gel (ver Figura 8) controlan el espesor del gel. En la tabla 6.5 10 12 15 20 Rango Peso Molecular (kDa) 25-500 15-300 10-200 10-45 5-40    Página 8 . Aumenta la generación de radicales libres por el persulfato de amonio. A más porcentaje menos tamaño de poro. también conocida como PAGE nativo. Los geles con mayor espesor. Mantiene el pH adecuado. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reducción. Mantiene la linearidad y la uniformidad de carga de las proteínas según la electroforesis. Debido a que el SDS iguala la carga en todas las proteínas. El tamaño de poro determina la ratio de separación de las proteínas. (tabla 7). las proteínas mantienen su estructura tridimensional y la migración en el gel depende de su masa: relación de carga de la proteína por encima de su tamaño. Los geles de SDS-PAGE están disponibles comercialmente o se pueden elaborar en el propio laboratorio.

espaciador inferior.Análisis de Proteínas Elaboración del gel Si el gel de acrilamida esta elaborado en el laboratorio. Puede ser una línea celular que sobreexprese la proteína de interés.     Página 9 . verter el gel resolutivo y esperar que el gel se polimerice. Generalmente. Similar a los ―housekeeping genes‖ en Biología Molecular. 4. El péptido de bloqueo se mezcla con el anticuerpo primario antes de la incubación con la membrana y evita la uníón del anticuerpo a la proteína diana. son una muestra de la proteína de interés purificada.  Para verificar si el anticuerpo primario se une a la proteína correcta. Para mejorar la nitidez de la banda el gel resolutivo se corona con una acrilamida de menor porcentaje (stacking gel). así los niveles de proteínas se pueden comparar de forma cuantitativa. 2. Algunos tratamientos pueden alterar la expresión de estas proteínas ―housekeeping‖. Colocar el peine en la parte superior del gel.      2. La expresión cuantitativa de la proteína de interés puede normalizarse con la del control de carga para cada muestra. Marcadores de Peso Molecular. Los tipos de estándares y controles utilizados incluyen: 1. es importante diseñar el experimento incorporando los controles y estándares necesarios para la validación de los resultados. los distintos reactivos se mezclan y se vierte en el molde. así como teñidos o incoloros. Controles Positivos. formado por el conjunto de dos cristales. si está disponible. Controles de carga   Como norma general se utilizan proteínas con niveles de expresión constante para todas las muestras. Verter el ―stacking gel‖ y quitar el peine una vez el gel haya polimerizado. Se utilizan para verificar si la proteína de interés está dentro del rango de tamaño apropiado.  1. Tras fijación de los lados. Diseño Experimental. Por tanto no se detectará ninguna banda. Disponible en diversos intervalos de pesos moleculares. Se pueden utilizar otras especies como tejido de control si el anticuerpo tiene reactividad cruzada apropiada. Puede ser una muestra de tejido del que se conozca que expresa altos niveles de la proteína de interés. Controles y Estándares Antes de la carga del gel. Lavar los pocillos con ddH20. Figura 8. dónde la acrilamida se polimeriza en aproximadamente 30 minutos. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre los cristales. Se utiliza para verificar que la carga de proteína por carril es más o menos igual. Péptidos de bloqueo   Algunos proveedores ofrecen péptidos de bloqueo para sus anticuerpos. 3. Son una mezcla de proteínas purificadas de peso molecular conocido. Preparación del gel de electroforesis para la separación de proteínas. Las versiones preteñidas se utilizan para controlar el progreso de la electroforesis y comprobar la eficacia de la posterior transferencia. El gel está listo para cargar las muestras y la electroforesis. peines y un sistema de sujeción (Figura 8). Pueden estar marcadas por la detección por fluorescencia o quimioluminiscencia. Estos estudios demuestran que el anticuerpo utilizado se une de forma específica a la proteína de interés. espaciadores lateral.

Las proteínas se separan según su peso molecular por el   Figura 9. debido a un mayor pH del ―Resolving Gel‖. obliga a las proteínas a alejarse. contiene Tris (mantiene el pH).8) Gly Proteinas CL- Stacking Gel pH 6. de forma apilada. el gel se somete a un campo eléctrico generado por una fuente de alimentación.8 Tampón de Electroforesis (pH 8. en el Stacking Gel.Electroforesis en Acrilamida Inicio de Electroforesis Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta. Concentración de bandas de proteínas por el flujo iónico en el sistema discontinuo de Laemmli. la glicina.3)    La glicina tiene carga negativa en el tampón de electroforesis a pH 8. La glicina. se aleja del electrodo negativo. El progreso en el gel se monitoriza observando el frente coloreado por el colorante presente en el tampón de carga y la posición de los marcadores de tamaño siempre que estos estén teñidos.8 y ralentiza su movimiento. La figura 9 ilustra el flujo de iones durante la electroforesis. Normalmente se cargan de 20 a 40 µg de proteína total por carril. En este método. los valores de pH de la capa de gel de apilamiento o concentración (Stacking Gel) y el gel de resolución (Resolving Gel) son diferentes. Página 10 . La técnica de electroforesis más habitualmente utilizada es la de Laemmli. Los iones de cloruro avanzan por delante de la Gly. Con la aplicación de un campo eléctrico. para así evitar sobrecargas que pueden dar lugar a la pérdida de muestra o derrames en pocillos adyacentes. Es importante conocer de antemano.8 Gly Proteinas Resolving Gel pH 8. Muestra (pH 6. La glicina empieza a perder su carga a pH 6. Glicina (conductor electricidad) y SDS (mantiene las proteínas cargadas negativamente). Una vez finalizada la carga. El tampón utilizado durante la electroforesis. aumenta su carga negativa y se mueve por delante de las proteínas. del electrodo negativo.3. el volumen que se puede cargar por pocillo. El aumento de la resistencia.

Aunque ambas funcionan bien en experimentos de inmunotransferencia. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas. las diferencias en sus características puden influir a la hora de la elección. Previamente a la transferencia. membranas PVDF de baja autofluorescencia. un estrecho contacto entre el gel y la membrana. Información para pedidos L-08001-010 L-08002-010 L-08003-010 Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm Membrana Nitrocelulosa 0. Ambos métodos requieren. Los sistemas de transferencia están disponibles en formato semiseco o húmedo. Transferencia a una Membrana Una vez la electroforesis del gel ha terminado. Transferencia de proteínas a una membrana. resistencia la SDS y una mayor unión que la nitrocelulosa. Figura 8. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiempo y elimina la contaminación accidental de las membranas con guantes o tijeras contamindas. para una transferencia efectiva de las proteínas. Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre -cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamaño de minigel. con el objetivo de reducir el ruido de fondo al utilizar métodos de detección de fluorescencia. ofrece una mayor resistencai mecánica. La mayoría de los sistemas de transferencia utilizan la generación de un campo eléctrico para conducir a las proteínas desde el electrodo negativo al positivo. SDS (opcional) y metanos (para membranas de nitrocelulosa). La figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la membrana en un transferencia semiseca o húmeda. sin embargo no son apropiados para transferencia de proteínas de gran tamaño (>70 kDa) y pueden causar.22 µm 8x10 cm Página 11 . Los sistemas semisecos son más rápidos y requeiren menor cantidad de volumen de Tampón que los sistemas húmedos.Análisis de Proteínas 4. las proteínas se transfieren a una membrana. La membrana de PVDF.45 µm 8x10 cm Membrana Nitrocelulosa 0. un mayor ruido de fondo. según el sistema de detección. La membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol. el tampón de transferencia contiene Tris. Recientemente se han desarrollado. Típicamente. permitiendo así que la hibridación de un anticuerpo las pueda detectar. Glicina. tanto el gel como la membrana se equilibran en una solución tampón pre-enfriada.

así como soluciones tampón en polvo de PCS. Se pueden eliminar haciendo rodar suavemente una pipeta Pasteur por encima del ―sándwich‖ formado por el gel/ membrana/papel de filtro. ya que es más rentable que el BSA.   Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo y de lavado para su línea de reactivos de detección. Incrementar la cantidad de SDS y disminuir la concentración de Metanol pueden facilitar la transferencia de proteínas de gran tamaño.. A menudo.    El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampón Tris salino) o en PBS (Tampón Fosfato salino). Una incubación durante una hora (temperatura ambiente o a 4ºC) suele ser suficiente para un bloqueo de los lugares de unión no específicos del anticuerpo. cuando se inicia un nuevo protocolo. Ajustar las condiciones de transferencia al tamaño de la proteína. un sistema de refrigeración o hacer la transferencia en una cámara fría.que facilitan una rápida y fácil preparación Información para pedidos R-03024-D50 R-03023-D20 R-01038-020 R-01039-020 AdvanWashTM. se pueden seleccionar otras soluciones de bloqueo alternativas. No permitir un sobrecalentamiento durante la transferencia.  Evitar la manipulación de las membranas con las manos desnudas. sin embargo y debido a la presencia de biotina en las fosfoproteínas. Reducir o eliminar el SDS o utilizar una membrana con un tamaño de poro menor puede ayudar a una mayor retención de la proteína. para estas y otras situaciones. 200 ml AvantTM Buffer Pouches . es la utilización de la leche descremada en polvo. La aparición de marcadores de tamaño preteñidos en la membrana es indicación que se ha completado la transferencia. 500 ml AdvanBlockTM-PF.PBS AvantTM Buffer Pouches . puede que no sea la mejor elección cuando se van a utilizar anticuerpos fosfoespecíficos o en métodos de detección de biotina. La primera elección. Es preferible.Electroforesis en Acrilamida A continuación se describen algunas sugerencias para la consecución exitosa de una transferencia:  Bloqueo El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incubando con una solución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo. son soluciones a base de proteínas. Las proteínas más pequeñas se transferirán más rápidamente y pueden atravesar la membrana. el uso de agentes bloqueantes no proteicos. El colorante Ponceau S puede utilizarse para teñir la membrana y asegurarse de la eficacia de la transferencia. Disminuir el voltaje o el tiempo si fuera necesario.TBS Página 12 . La tinción con Coomassie puede usarse para la tinción del gel una vez realziada la transferencia y comprobar los residuos de proteína en el gel. TBS. Es aconsejable utilizar tampón frio. como la leche descremada en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA). se puede añadir también detergente Tween 20. Las burbujas de aire entre el gel y la membrana pueden causar transferencia defectuosa y desigual. . WesternBright. Si los niveles del ruido de fondo son demasiados altos.. Las proteínas y aceites de la piel pueden adherirse a la membrana y pueden dar lugar a manchas no deseadas en la membrana. La membrana debe ser desteñida antes del proceso de transferencia.

Los hibridomas con secreción más estable se seleccionan y pueden ser cultivados indefinidamente. Variabilidad Tolerancia a condiciones variables Poca tolerancia Más tolerante a conpuede dejar de diciones variables.  Bueno para proteínas poco abundantes. comúnmente conejo. Página 13 . reconocer al antígeno en condiciones de desnaturalización/reducción de la proteína. Hibridación del Anticuerpo. o por modificaciones químicas (glicosilación fosforilación) o por diferencias en la secuencia peptídica debido a la presencia de polimorfismos. Después del proceso de bloqueo. cabra. es la inyección de un antígeno en un animal. El primer paso en la producción de ambos anticuerpos. tanto anticuerpos primarios monoclonales como policlonales. Propenso a cierta variabilidad entre lotes. los anticuerpos reconocen una secuencia de aminoácidos pequeña (epítopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de la proteína en condiciones desnaturalizantes y reductoras. Reactividad cruzada potencial  Reactividad cruzada menos probable. En general. el cual se analiza y determina la afinidad al antígeno.  Potencial para reconocer otras proteínas que contengan el epítopo. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales. Más corto Anticuerpos Primarios: Monoclonal vs Policlonal. las células que sintetizan anticuerpos se aíslan del bazo del animal y se fusionan con células del mieloma. Anticuerpos Monoclonales Reconocimiento epitopo y sensibilidad  Reconocimiento de un único epítopo  Menos sensibilidad debido a que sólo un anticuerpo se une a cada proteína Anticuerpos Policlonales  Reconocimiento múltiples epítopos en una proteína  Más sensible debido a los multiples lugares de unión de anticuerpo en cada proteína. Tiempo requerido para su producción Coste de Preparación Largo Mayor coste . Los geles nativos se pueden utilizar cuando los anticuerpos requieren de la proteína plegada para el reconocimiento del antígeno. Los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir del suero del animal.  Mayor ruido de fondo potencial debido al reconocimiento de multiples epítopos. Tabla 8. Algunas características de los anticuerpos monoclonales y policlonales se describen en la Tabla 8.  Reactividad cruzada con otras especies más probable.  Reactividad cruzada más probable.reMenor coste quiere personal capacitado y equipamiento especializado. la membrana se incuba con el anticuerpo primario. para provocar una respuesta inmune. Los lotes de un mismo hibridoma son muy estables.Análisis de Proteínas 5. Los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epítopos del antígeno y en cambio los monoclonales reconocen un único epítopo de la proteína. burro u oveja y son finalmente purificados y probados. En la transferencia Western se pueden utilizar. Los dos tipos tienen distintas ventajas y desventajas y se diferencian según la forma en la que se sintetizan. Lo hibridomas resultantes secretan anticuerpos al medio de cultivo. Para la síntesis de un anticuerpo monoclonal.

Para anticuerpos monoclonales se debe considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG. e incubar en un agitador de vaivén.…). IgA. En métodos de detección indirectos (sección 6). PBS. o sea. es necesario un anticuerpo secundario apropiado. 50 µl IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón. debe ser totalmente lavada de la membrana. 250 µl IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón. A continuación se describen las consideraciones a tener en cuenta a la hora de la elección de un anticuerpo secundario:  Las especie del primer Ac dicta la elección del Ac secundario.  Información para pedidos R-05051-050 R-05051-250 R-05052-050 R-05051-250 R-05071-500 R-05072-500 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo.Hibridación Anticuerpos Incubación de los anticuerpos El anticuerpo primario se diluye en tampón de bloqueo. 50 µl IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo. la abundancia de la proteína en la muestra y la sensibilidad del sistema de detección afectarán a la cantidad de anticuerpo a utilizar. Un anticuerpo con amplia especificidad inmunoglobulínica debería ser suficiente. La afinidad del anticuerpo. se procede a la eliminación del excedente mediante tampones de lavado (TBS. ya que los anticuerpos específicos para sub-clases se utilian mayoritariamente. IgD. IgE) y posiblemente la subclase (IgG1. En algunos casos. 500 µl Después de la incubación con el anticuerpo primario. deber ser producido en otra especie distinta a conejo. El fabricante puede recomendar una cantidad inicial. Un menor volumen puede utilizarse si la membrana se sella dentro de una bolsa e incuba en un agitador orbital. pero a menudo la concentración óptima de anticuerpo debe determinarse empíricamente. También es posible una incubación a 4ºC durante toda la noche. Durante la incubación. un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente suele ser suficiente. la disolución con el anticuerpo.  Página 14 . Si se utiliza acida sódica como conservante. IgG2a. 250 µl Anticuerpo Secundario conjugado HRP cabra-anti-ratón. en experimentos de doble etiquetado u otras aplicaciones. puede reutilizarse.  Generalmente. TBST o PBST).  Nota: Advansta ofrece una línea completa de anticuerpos secundarios marcados para detección mediante quimioluminscencia o fluorecencia. el segundo Ac debe ser anti-conejo. ya que puede eliminar la actividad de la peroxidasa e interferir en los métodos de detección. 500 µl Anticuerpo Secundario conjugado APC cabra-anti-conejo. la membrana debe someterse a agitación suave y sumergida en la disolución. TBST o en un tampón de disolución de anticuerpo comercial. Si el primer Ac es de conejo. IgM.

 La inmunorreactividad del Anticuerpo puede estar afectada por el marcaje. Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan comúnmente anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP). no son posibles detecciones multiplex (detección de mas de una proteína.  Versátil . 2.  Mayor posibilidad de unión no inespecífica. Colorimetría. fácil de documentar. Quimioluminiscencia. se pueden hacer multiples exposiciones en películas de rayos X.  Puede ser más costoso. Los métodos más comúnmente utilizados para detectar proteínas son: 1. biotina o molécula fluorescente. la película tiene un rango dinámico limitado. es el anticuerpo secundario el que está conjugado con un marcaje detectable.  Más pasos. semicuantitativa . incluyedo WesternBrightTM ECL. cada uno con sus ventajas e inconvenientes. Inconvenientes Nota: LucentBlueTM es una película que ha sido optimizada para Información para pedidos L07014-100 L07013-100 Película Rayos X LucentBlueTM . Los métodos directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable.Análisis de Proteínas 6. Detección.el mismo Ac secundario puede utilizarse para diversos anticuerpos de la misma especie. la intensidad de la señal puede variar con la incubación o el tiempo de exposición. Quimioluminiscencia. 1. Métodos de detección. La detección de la proteína se puede hacer mediante métodos directos o indirectos. En la detección indirecta. 100 uds Película Rayos X LucentBlueTM . Ventajas e Inconvenientes de los métodos de detección Indirecto Ventajas Directo  Amplificación de  Menos pasos. Detección directa e indirecta de proteínas Tabla 9. 100 uds la detección de señales de quimioluminiscencia en experimentos realizados con los substratos WesternBright HRP. La reacción entre el encima y el substrato produce luz. rios a cada Ac primario. la membrana puede tratarse para re-utilizarse. Fluorescencia y 3. Inconvenientes: requiere una habitación oscura (película rayos X) o sistemas de imagen caros. La figura 11. que puede ser detectada mediante la exposición de la membrana a una película de rayos X o captada de forma digital utilizando una cámara CCD.ilustra los métodos de detección directos e indirectos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e inconvenientes de los dos métodos. 20x25 cm. 13x18 cm. Ventajas: muy sensible. señal debido a la  Menos posibilidaunión de múltides de unión no ples Ac secundaespecífica. Los anticuerpos se pueden marcar mediante kits disponibles en le mercado u obtenerlos ya marcados. Westernbright Quantum y WesternBright Sirius. un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer anticuerpo. Lo métodos indirectos utilizan dos anticuerpos.porque se basa en una reacción enzimática. sólo un color de reacción) Figura 11 . Página 15 . como un enzima.

Información para pedidos K-12042-D10 K-12042-D10 K-12045-D20 K-12042-D10 WesternBrightTM Quantum Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) WesternBrightTM Sirius Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) WesternBrightTM ECL Western Blotting HRP Substrate (para 2000 cm2 de membrana) WesternBrightTM ECL Spray Página 16 . Inconvenientes: no es tan sensible como los otros dos métodos. no requiere cámara oscura. la membrana puede ser tratada para volver a ser utilizada para la detección de otra proteína. el color se desvanece con el tiempo. apto para ensayos multiplex con múltiples colorantes. o diferentes isoformas de la proteína. pero consume mucho tiempo. Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incrementarse utilizando el sistema streptavidina/ biotina). La intensidad de la tinción puede ser medida por espectrofotometría o por un densitómetro. El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo. mediante la detección fluorescente multicolor. La imagen se digitaliza para su análisis. Ventajas: sencilla de realizar. es ideal para comparar la proteína de interés con un control de carga. El enzima convierte el colorante en un producto insoluble que es visible en la membrana. Perfecto para aquellos experimentos en los que se necesite comparar la proteína de interés con un control de carga. no es tan sensible como la quimioluminiscencia (puede no ser apropiado para proteínas poco abundantes). Las membranas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en protocolos de lavados para reutilización. Colorimetría. Re-utilización de la membrana Después de captar la imagen. Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento pueden ser costosos. Nota: WesternBright TM MCF permite la detección. Este procedimiento puede conservar las muestras. Información para pedidos K-12021-010 WesternBrightTM fluorescent Western blotting kit Nota: Advansta suministra una línea completa de reactivos de detección de quimioluminiscencia optimizados para los diferenentes métodos. se detecta mediante un dispositivo capaz de medir la fluorescencia o mediante una cámara CCD provista con los filtros de longitud de onda apropiada. 3. las membranas se pueden documentar fácilmente mediante fotografía. que cuando es ―excitado‖ emite luz. Fluorescencia. aporta datas cuantificables. no se requiere el uso de una cámara oscura. Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado previamente a un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). se pueden detectar múltiples proteínas de forma simultanea. amplio rango dinámico. La cantidad de colorante convertido es proporcional al cantidad en la muestra. concentración de muestra y tipos experimentales. Con la detección multiplex de fluorescencia. fácil documentación de resultados. pueden usarse Ac primarios marcados (para proteínas abundantes) y eliminar pasos. de dos proteínas en una sola membrana.Detección 2. La luz emitida.

Análisis de Proteínas 7. Problemas en la electroforesis E. Solución de Problemas Solución de problemas con Western Blot A. 9) Bandas Difusas (ver 13) El gel corre demasiado rápido o demasiado lento (ver 20. 6) Frente corre curvado ―smiling‖ (ver 22) Elección de Membrana (ver 27) Bandas distorsionadas (ver 16) Frente corre inclinado (ver 23) Unión no específica del Anticuerpo (ver 28) Revelado de la película (ver 29) Página 17 . Tamaño incorrecto de la banda C. No se puede ver la proteína de interés B. 4) Rayas Verticales (ver 14) Bandas Múltiples (ver 10) Distorsión Lateral (ver 15) Las bandas aparecen muy altas o muy bajas en el gel (ver 11) Contaminación Reactivos (ver 26) Problemas con los reactivos (ver 5.18. Ruido de fondo excesivo Preparación Muestra (ver 1) La proteína es menor de lo esperado (ver 7) Bandas Incompletas (ver 12) El gel polimeriza demasiado rápido o demasiado lento (ver 17. Bandas artefactuales D.21) Lavado inapropiado (ver 25) Unión ineficiente del Anticuerpo (ver 3.19) Bloqueo Insuficiente (ver 24) Transferencia Inadecuada (ver 2) La proteína es mayor a lo esperado (ver 8.

conseguir un nuevo reactivo si no hay señal Evitar utilizar disoluciones conteniendo este agente conservante La disolución es antigua o está almacena. Problema 1.Usar menor numero de lavados.: Leche. o luminiscencia en oscuridad .puentes disulfuro Uso de DTT en tampón de muestra.Comprar reactivo nuevo da de forma inapropiada Causa (s) Proteólisis. incluir control positivo en el gel Cargar más cantidad de proteína total en el gel. Unión ineficiente del Anticuerpo primario Baja afinidad del anticuerpo por la proteí. sustituir si es muy delgada 3. Preparación Muestra Causa(s) Extracción ineficiente Baja expresión de la proteína en el tejido o las células La proteína se ha degradado durante la extracción 2.: BSA. Reactivo de detección (ECL) B. juntar múltiples muestras Usar inhibidores de proteasa en le tampón de lisis Tampón de transferencia preparado inco. disminuir do la concentración de sales el tampón de lavado Antígeno enmascarado por el agente bloqueante (ej.Incrementar la concentración del Antina o el anticuerpo es antiguo/débil cuerpo. acetilación. Unión ineficiente del Anticuerpo secundario Elección de especies errónea Utilizar un agente de bloqueo alternativo (ej.Reactivos viejos o inestables tivo Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sódica 6. Proteína más pequeña de lo esperado Mezclar conjugado + substrato en un tubo. fosforilación.…) 4.…) Usar Anticuerpos dirigidos contra la especie del Anticuerpo primario Concentración insuficiente del Anticuerpo Aumentar concentración o comprar uno o Anticuerpo antiguo Anticuerpo nuevo 5. Congelación/descongelación de la muestra Proteína variante (Splicing) Solución Uso de inhibidores de proteasa/muestras frescas Consultar literatura/utilizar controles apropiados Consultar literatura para encontrar aditivos que puedan eliminar grupos químicos 8. incluir un control positivo 9. Conjugado/Substrato Inac.Revisar el protocolo/disminuir metanol rrectamente/demasiado metanol en el tampón Proteínas de mayor tamaño necesitan mas tiempo/voltaje Contacto insuficiente entre el gel y la membrana Repetir con un tiempo mayor/mayor voltaje Revisar la almohadilla de fibra. concentrar utilizando Afyon. Transferencia indadecuada Solución Intentar métodos alternativos. Problema 7. comprar un anticuerpo nuevo y almacenarlo de forma apropiada El Anticuerpo tiene reactividad cruzada débil con las especies de interés Probar con un Anticuerpo primario de diferente origen El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava. pulso intactos de centrífuga previo a la carga de la muestra Página 18 . Proteína más larga de lo esperado y/o bandas múltiples Proteínas modificadas de forma natural (glicosilación.Solución de Problemas A. etc…) Cambio de la expresión de la proteína en la línea celular Utilizar cultivos anteriores. Proteína más larga de lo esperado Agregado de proteínas .

La proteína aparece muy Porcentaje erróneo/no óptimo del gel alta o muy baja en la membrana C. Distorsión lateral de las bandas 16. asegurarse de la correcta preparación del tampón Asegurarse que las muestras se han incubado durante 2 min a 90ºC antes de cargarlas en el gel Preparar SDS nuevo para le tampón de muestra 11. Problema (continuación) 10. Problema 12. intentar un rio o secundario experimento de bloqueo de péptido (eliminará la proteína de interés) Incrementar el porcentaje para proteínas de pequeño tamaño. Bandas Incompletas Causa(s) Burbujas entre el gel y la membrana 13. Distorsión de las bandas Difusión de la muestra en los pocillos durante la carga Fallo en la completa polimerización de los Incrementar TEMED/AP pocillos Presión aplicada excesiva a la hora de montar el gel Burbujas en el gel debido al uso de cristales sucios No apretar en exceso los tornillos del sistema. Problema 17. El gel no polimeriza Causa (s) Fallo al añadir el TEMED y AP La disolución AP es estable durante dos o tres días a 4ºC El oxígeno inhibe la polimerización 18. disminuir para proteínas de gran tamaño Solución Usando una pipeta.Análisis de Proteínas B. Rayas en los carriles Alta concentración de sales en la muestra Disminuir la concentración de sal en el tampón de muestra Muestra muy concentrada o insuficiente SDS Incrementar concentración/usar más SDS Minimizar el tiempo de carga 15. apretar hasta encontrar primera resistencia Usar guantes en la preparación de los geles Uso de Etanol y H2O desionizada en la limpieza de los cristales Burbujas introducidas en el gel por el dispositivo de llenado (jeringa o pipeta) Burbujas de aire atrapadas por el peine No expulsar totalmente el volumen de la mezcla del gel Insertar el peine en ángulo y antes que se polimerice el gel Solución Repetir con TEMED y AP Preparar AP fresco Aplicar isopropanol antes de verter el gel de apilamiento (stacking gel) Incrementar la cantidad de TEMED/AP Preparar disolución fresca de AP D. Bandas Extras Causa(s) Solución Unión no específica del Anticuerpo prima. Bandas difusas Migración lenta Las muestras no se han calentado correctamente El SDS del tampón es antiguo 14. hacer rodar por encima del paquete gel/membrana para forzar la salida de las burbujas Incrementar voltaje. El gel polimeriza muy lento TEMED/AP Insuficiente La disolución de AP ha perdido su actividad Página 19 .Disminuir concentraciones.

Contaminación de los reactivos Crecimiento bacteriano o fúngico en los tampones Revisar la turbidez de los tampones. reemplazar tampón en caso necesario Disminuir voltaje Disminuir voltaje. Problema (continuación) 19. lentamente volver a posición vertical Solución Usar BSA E. colocar una esquina en el tanque inferior del sistema de electroforesis. intentar con Anticuerpo monoclonal o purificado por afinidad Disminuir la cantidad de proteína 27. Bloqueo insuficiente Causa(s) La presencia de Biotina en la leche es incompatible con el uso de Estreptavidina. Elección de tipo de mem.Las membranas PVDF pueden tener más brana ruido de fondo que las de Nitrocelulosa Algunas membranas tienen alta autofluorescencia Membrana seca 28. si no es cula o al CCD posible incrementar la dilución de los Anticuerpos o cargar menor cantidad de muestra Página 20 . Problema 24. preparar nuevos Elegir membranas de Nitrocelulosa Utilizar únicamente membranas PVDF con baja autofluorescencia con Western Blots fluorescentes Estar seguro que la membrana esta húmeda durante todo el proceso Disminuir la concentración de Anticuerpo. o la leche contiene el antígeno de interés Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright MCF. Frente inclinado Burbuja atrapada entre los cristales en la parte inferior del gel Solución Reducir la cantidad de TEMED/AP.Reducir los tiempos de exposición. Unión no específica del Anticuerpo primario o secundario Concentración muy alta del Anticuerpo o no purificado por afinidad Mucha cantidad de proteína en el gel 29. NP-40) 26. algún Anticuerpo primario puede requerir un bloqueante proteico La disolución está demasiado diluida Tiempo de bloqueo muy corto Algunos detergentes no son efectivos a bajas temperaturas Incluir BSA o leche en la disolución AdvanBlock-PF utilizada en la dilución del Anticuerpo primario Incrementar con un 5% la disolución Incrementar el tiempo de incubación Incubar a temperatura ambiente en vez de toda la noche a 4ºC Incrementar el número de lavados o la duración de cada uno de ellos 25. Tiempo de carrera inusualmente corto 22.Solución de Problemas D. refrigerar Aguantar el gel en ángulo. Frente curvado (smiling) Tampón demasiado diluido Migración demasiado rápida Generación de calor 23. Tiempo de carrera inusualmente largo Causa(s) Cantidad excesiva de TEMED/AP Buffer de electroforesis demasiado concentrado Voltaje insuficiente 21. diluir el tampón en caso necesario Incrementar voltaje Revisar el protocolo. Condiciones de lavado inapropiadas Número insuficiente de lavados Concentración insuficiente de detergente Incrementar la concentración de detergente o usar detergentes más fuertes (SDS. Sobreexposición de la imagen El tiempo excesivo de exposición a la pelí. manteniendo la relación entre ambos Revisar protocolo. El polimeriza demasiado rápido 20.

7 pmol o 4x1012 moléculas Página 21 .000 100. G) Tabla 11.000 150. Q) Asparagina (Asn.2 1.2x1013 moléculas 1 nmol 10 µg 50 µg 100 µg 150 µg Tabla 12. Herramientas y Referencias Técnicas g de Soluto Molaridad de una disolución = [Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolución) Tabla 10. K) A. S) UAU UAC UAA UAG A Tirosina (Tyr.3 0. P) Isoleucina (Ile.5 3.35 1.000 20. W) Arginina (Arg. H) Glutamina (Gln. Conversión entre masa y moles de proteína Peso molecular (Da) 10. A) Glicina (Gly. F) Leucina (Leu. T) STOP UGU UGC UGA UGG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG CAU CAC CAA CAG Treonina (Thr. T) AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG Histidina (His.Análisis de Proteínas 8. I) Metionina (Met. S) Arginina (Arg. Glutámico (Glu. L) UCU UCC UCA UCG C Serina (Ser.000 1 µg 100 pmol o 6x1013 moléculas 20 pmol o 1. M) Valina (Val. Código genético y abreviaciones de los aminoácidos Segunda Posición U UUU UUC U UUA UUG Fenilalanina (Phe. N) Lisina (Lys. D) A.17 1. V) Serina (Ser. R) A G GCU GCC GCA GCG Alanina (Ala.7 10 pmol o 6x1012 moléculas 6. R) Primera posición C Leucina (Leu. Aspártico (Asp.4 0. C) STOP Triptófano (Trp. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale Proteina IgG IgM IgA Proteina A Avidina Estreptavidina Albumina suero bovino A280 Uds por 1 mg&ml 1. L) Prolina (Pro. E) CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG G Cisteina (Cys.

Masa molecular media de los aminoácidos Códigos Aminoácidos A C D E Tabla 14.2 128.08 103. Abreviaciones ds ss bp kb Da mol M doble cadena ( como en dsDNA) cadena sencilla (como en ssDNA) pares de base kilobase.Herramientas y Referencias Tabla 13.2 113. The Advansta logo is a registered trademark of the Company.2 Copyright © 2011 Advansta.2 87.730 años 60 días 14. Afyon™.05 137. AdvanBlock™.08 101.2 57. All other trademarks.1 99. moles de soluto por litro de disolución F G H I K L M N P Q Tabla 15. Página 22 . Vida media de los Radioisótopos más habituales Radioisótopo Carbono-14 (14C) Iodo-125 (125I) Fósforo-32 (32P) Azufre-35 (35S) Tritio (3H) Vida media 5.3 días 87. All rights reserved.2 163.1 147. Prefijos métricos M K m µ mega Kilo mili micro 106 103 10-3 10-6 n K f a nano pico femto atto 10-9 10-12 10-15 10-18 Tabla 16.07 186. service marks and tradenames appearing in this brochure a re the property of their respective owners. Adva nWash™. unidad de masa molecular mol molaridad.1 113.1 156.1 91.4 días 12.2 131..1 129. Avant™.1 115.000 bases o pares de base Dalton.2 114. 1.4 años R S T V W Y Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Peo Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Masa molecular media 71.12 128. LucentBlue™ and WesternBright™ are trademarks of the Company.

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