Análisis de Proteínas

Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección

advansta

Análisis de Proteínas

Análisis de Proteínas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés. Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras. Esta guía de laboratorio describe los pasos involucrados en la realización de un Western blot, incluyendo la preparación de muestras, la separación de proteínas, la transferencia y la detección.

Índice de Contenidos
1. Western Blot: Visión General 2. Preparación de las muestras 3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida 4. Transferencia Electroforética 5. Hibridación Anticuerpos 6. Detección 7. Solución de Problemas 8. Herramientas y Referencias Técnicas

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1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4. Página 1

Western Blot: Visión General 1. Se utiliza una pipeta para cargar las muestras en los pocillos del gel Una fuente de alimentación proporciona el voltaje El gel se coloca dentro de un tanque de electroforesis lleno de tampón. El gel y la membrana se coloca entre papel de filtro y almohadillas de esponja. tejidos animales. Se prepara un gel de acrilamida.. Se añade un colorante de carga. a. Western Blot: Visión General Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso. Preparación de muestras b. que conducirá la corriente. células cultivadas. bisacrilamida. dónde quedan inmovilizadas. Figura 2. Preparación de la muestra Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química. Los materiales de partida incluyen planta. Figura 3. una carga negativa a cada una de ellas. Electroforesis en gel de Acrilamida Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. Procesos adicionales logran el fraccionamiento subcelular Se usan tampones conteniendo detergentes para la lisis celular Figura 1. la migración de la muestra se puede monitorizar. Se aplica voltaje en el tanque de transferencia y las proteínas migran desde el gel a la membrana. La proteínas con carga negativa migran desde el ánodo. La disrupción mecánica con un homogenizador disgrega los tejidos. levadura. Electroforesis en Acrilamida c. o bacterias. Un cartucho aplica presión y mantiene un estrecho contacto entre el gel y la membrana. Transferencia electroforética a una membrana Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana. Así. Transferencia de Proteínas a la Membrana Página 2 . de forma proporcional a la masa de cada proteína. El dodecilsulfato de sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere.

Para la detección de quimioluminiscencia. o de forma digital. Los materiales de partida incluyen tejidos vegetales. proporcionando una forma de detección.Análisis de Proteínas a. la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción enzimática que da como resultado final la emisión de luz. Figura 4. levadura. La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz emitid por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario. Hibridación del Anticuerpo La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos. células en cultivo. Tras varios lavados de la membrana. se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP). mediante un sistema de captación de imágenes. Dicha luz puede ser detectada en una película de rayos X. Detección de las Bandas Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido. A continuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana. se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma específica al anticuerpo primario. Detección quimioluminiscente de las bandas de proteínas Página 3 . se procede a detectar la localización de la banda en la membrana. e. o bacterias. tejidos animales. Hibridación de Anticuerpo Figura 5.

A menudo. La elección de la substancia detergente. sonda para romper las membranas celulares La muestra se pulve. más utilizados habitualmente. en muestras tisulares de plantas y animales. Las células en cultivo.Tejido animal o o riza utilizando un vegetal mortero y una almirez refrigerados La ruptura celular se Levaduras produce por agitación de las perlas de vidrio Pulverización en Nitrógeno líquido Perlas de vidrio Tabla 2. que va dirigida a enriquecer la proteína de interés dentro del extracto final. tales como el homogenizador Dounce Los detergentes Triton son suaves y no iónicos Para antígenos con niveles bajos de expresión pueden ser necesarios procesos de enriquecimiento Citoplasmático (unida a citoesqueleto) Tris-Triton Membrana mitocon.Las proteínas citoplasmáticas se pueden unir a las proteínas del citoesqueleto. La estructura química de los detergentes permite romper las membranas celulares y solubilizar las proteínas. mediante el uso de solución tampón que contiene detergentes. según el tipo de proteína de interés y la localización subcelular Tipo/Localización Proteína de interés Nativa (no desnaturalizada) Citoplasmáticos (soluble) Detergente o Solución Tampón Detergente suave no iónico Tris-HCl TComentarios Evitar detergentes desnaturalizantes (SDS. etc. según el tipo de proteína y localización subcelular. frecuentemente. se requiere el uso de un proceso mecánico para la disrupción de la compleja matriz celular. RIPA drial o nuclear (multiples detergentes). En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampón y detergentes. Triton X-100 Lisado total de células NP-40. RIPA. bacemitidas por una terias. depende en parte de la localización. En la mayoría de ensayos. no iónicos si no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga negativa y positiva y la carga neta es 0. útil para protocolos de enriquecimiento de proteínas mitocondriales o nucleares Homogenizador Dounce Homogenizador de ultrasonidos Ondas de sonido Células. las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o mecánicos. se suelen lisar utilizando una solución tampón con detergente y sin la aplicación de métodos mecánicos. Soluciones Tampón y detergentes.. Triton X-100 Página 4 . Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar según las características del grupo polar: iónicos si el grupo polar tiene carga positiva o negativa. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida. citoplasmática. En la tabla 1 se resumen los métodos mecánicos que habitualmente se utilizan en la extracción de proteínas para inmunotransferencia. Tabla 1. de la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico. dentro de la célula.NP-40. dentro de orgánulos celulares como el núcleo y las mitocondrias. Deoxicolatos) Puede combinarse con métodos mecánicos. Disrupción mecánica que suele preceder a un proceso químico de lisis celular. Métodos físicos para la dirupción de muestras Método Licuadora Descripción La muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias Tubo de vidrio con pistón ajustado maja las células por acción de corte. Preparación de la muestra Una adecuada preparación de la muestra es esencial para tener éxito en un ensayo de Western Blot.. tejidos. afectando así a los procesos de fraccionamiento subcelular. Tipo de muestra Gran cantidad de tejido Células tisulares. de la proteína de interés. unida a la membrana.Preparación de la muestra 2.

Asegurar la carga de la cantidad correcta de proteínas en el gel. mediante la acción del detergente Dodecilsulfato Sódico (SDS). En la tabla 3 se muestran los inhibidores deproteasa y fosfatasa de uso más habitual. Además de inhibir la actividad de la proteasa. Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un mayor ruido de fondo y unión no específica de los anticuerpos. La cantidad de proteína óptima a cargar dependerá de la prevalencia de la proteína de interés y de la sensibilidad del anticuerpo primario. durate la preparación de la muestra. se revisten con carga negativa. es importante evitar. las proteínas. así Las proteínas.  Trabajar rápido y mantener las muestras en frío durante todo el proceso. evitando la necesidad de determinar la concentración de proteína. Información para pedidos K-02101-025 Afyon ™ SDS-PAGE ssmple preparation kit Página 5 . Inhibidores Proteasas Aprotinina EDTA EGTA Leupeptin Pepstatina A PMSF Concentración en Enzimas diana el Tampón de lisis 1-2 µg/ml 1-10 mM 1-10 mM 1-2 µg/ml 1µg/ml (17-170 µg/ml) O. Medición de proteína total Previamente a la electroforesis. en particular en estudios de fosforilación. Por tanto. para determinar la carga de proteína apropiada. Por ejemplo.  Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis. A menudo. para 5 µg de proteína se utilizan 20 µl de resina Afyon. se pueden separar en el gel según su tamaño (SDSPAGE). Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la extracción de proteínas. La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradación de proteínas:  Evitar excesivos ciclos de congelación/ descongelación.1—1 mM Concentración en el Tampón de lisis 1 mM 1-10 mM 1-10 mM 1-2 µg/ml 1µg/ml (17-170 µg/ml) O. Tabla 3. Electroforesis en Acrilamida Las proteínas del extracto se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE).Glicerofosfato EDTA EGTA Enzimas diana Fosfatasas Serina/ Treonina Mg++/Mn++ Metaloproteasas Ca++ Metaloproteasas Proteasas de Serinas. Cisteinas Proteasas de Aspartico Proteasas de Serina 3. Cisteinas Proteasas de Aspartico Proteasas de Serina Inhibidores Fosfatasas  . En primer lugar. se requiere hacer experimentos preliminares con cantidades seriadas de proteínas.Análisis de Proteínas Con la rotura celular.1—1 mM Proteasas de Serina Mg++/Mn++ Metaloproteasas Ca++ Metaloproteasas Proteasas de Serinas. puede ser interesante reducir la actividad de la fosfatasa alcalina. cualquier actividad proteásica. es importante determinar la concentración de proteínas por las siguientes razones: 1. Leupeptin Pepstatina A PMSF Nota: con el kit Afyon ™ SDS-PAGE de preparación de muestra. se puede controlar la cantidad de carga de la proteína mediante la cantidad de resina utilizada. se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés.

El estándar utilizado con mayor frecuencia es la albúmina de suero bovino (BSA). el gentes  ComercialBCA se une a los iones de mente dispoCu1+ y forman nible en forun producto mato comcoloreado que patible con se puede meagentes dir espectroforeductores. El tiempo de da en literatura ensayo puede ser mayor que en otros métodos  No es práctico para grupos grandes de muestras  Se pueden formar precipitados Hay muchos kits de determinación de proteínas disponibles comercialmente. Un experimento de Western Blot cuantitativo es útil para estudio de cambios de expresión de proteínas o de modificaciones proteicas como la fosforilación. Descripción del método Existen diversos métodos para medir la proteína total de una muestra. Con el fin de determinar la concentración de proteínas totales en una muestra. Proteína (mg) Figura 6. Bradford y Ácido Bincocinico (BCA) (Tabla 4). La elección depende de muchos factores:  El equipo de lectura disponible en el laboratorio (espectrofotómetro. Si la cantidad de proteína cargada por carril es la misma. se debe realizar una curva estándar en cada ensayo. etc…). aunque se puede utilizar cualquier proteína producida en el laboratorio o disponible comercialmente. Ejemplo de la curva estándar de un ensayo de proteínas. En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva estándar.  Los reactivos del tampón de lisis . Realización de Western Blots cuantitativos o semi-cuantitativos.Electroforesis en Acrilamida 2. Métodos físicos para la dirupción de muestras Ensayo Bradford Descripción El colorante azul de Coomasie se une a las proteínas y sufre un cambio de absorvancia Ventajas La realización de los ensayos son generalmente rápidos y sencillos Inconvenientes  Interferencia de SDS o de otros detergentes a altas concentraciones . Estos ensayos colorimétricos se basan en las reacciones que se producen entre las proteínas de la muestra y los reactivos de detección. Se representa la absorvancia de las soluciones estándar que contienen la proteína conocida (línea roja). El contenido de la proteína de interés en la muestra (línea verde) se puede determinar mediante la extrapolación de la absorvancia obtenida a la cantidad o concentración de proteína correspondiente. Los más habituales son los métodos Lowry.revisar el protocolo del fabricante para identificar sustancias interferentes. Elección de un ensayo de proteínas Absorvancia Tabla 4.  Rango lineal pequeño. Esto se logra con la realización de un ensayo de concentración crecientes. Similar al BCA (reacción de Biuret) Lowry Muy bien cita.  La cantidad de muestra disponible. lector de placas. se pueden comparar los niveles relativos de la proteína de interés.  La facilidad/rapidez del ensayo. metricamente  Menos varia(reacción de ción proteíBiuret) na-proteína que en el método Bradford. Página 6 . Los valores de absorvancia se trazan en función del contenido conocido de la proteína estándar utilizada. Interferencia con agentes quelantes o reductores del Cobre BCA Reducción de  Compatible iones de Cu2+ con la mayo mediante interación con las ría de deterproteínas. de proteína pura. La concentración de la proteína de interés se puede determinar extrapolando la absorvancia obtenida en la curva patrón o estándar (línea verde de puntos).

Mantiene el pH adecuado Azul de Bromofenol SDS Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y garantizan que las muestras se separan de forma reproducible. teniendo cuidado en evitar ciclos repetitivos de congelación/ descongelación. En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanismo de desnaturalización del SDS. Tabla 5. Agentes reductores  Evita la oxidación de cisteínas. esta incubación no es necesaria.  Migra por delante de las proteínas. Los ingredientes típicos de un tampón de carga para detectar proteínas bajo condiciones desnaturalizantes/reductoras se describen en la Tabla 5. Componentes del tampón de carga. Figura 7. de modo que se puede hacer el seguimiento del movimiento de las muestras en el gel. Los componentes del tampón de carga varían. Advansta dispone de tampones de carga reductores y no reductores. En condiciones no desnaturalizantes/no reductoras. combinándolas con un tampón de carga y cargar la muestra en un gel de electroforesis. se pueden utilizar inmediatamente. beta mercaptoetanol o ditiotreitol. si se necesitan condiciones no desnaturalizantes /no reductoras. manteniendo su carga intrínseca SDS El SDS se une a la proteína y da lugar a una linearización y a una uniformidad de la carga negativa de ésta. Información para pedidos R– 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x) R-03019-B10 Reducing protein sample loading buffer (2x) Tampón Tris Pepstatina A Beta Mercaptoetanol o DTT Página 7 .  Completan la linearización de la proteína al romper los puentes disulfuro. aportando carga negativa de forma proporcional al tamaño de la proteína.  Destruye la estructura secundaria/ terciaria y lineariza la proteína. No se utilizarán ni SDS. Previamente a la carga del gel. Alternativamente. se pueden conservar congeladas.  Unión a la proteína de forma regular.Análisis de Proteínas Tampón de carga de muestras Una vez se tienen las muestras de proteína. Mecanismo de desnaturalización por SDS de las proteínas. Molécula colorante pequeña:  Da color a la muestra para ayudar a la carga. las muestras se someten a una incubación a 95ºC durante 5-10 minutos. para asegurar que la desnaturalización/ reducción es total. carril a carril y gel a gel. dependiendo de las condiciones deseadas. Propósito Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar la muestra la fondo del pocillo y evitar que se extienda a los pocillos adyacentes. Detergente desnaturalizante  Cola hidrofóbica que rodea la esqueleto peptídico. La proteína se encuentra en su estado conformacional. Reactivo Glicero.  Evita las interacciones hidrofóbicas y rompe los enlaces de hidrógeno.

pueden aceptar mayor volumen de carga. Los geles pre-fabricados son muy prácticos pero debido al coste. en la electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en el tampón de electroforesis. Los geles con mayor espesor. Mantiene la linearidad y la uniformidad de carga de las proteínas según la electroforesis. Tabla 7. las proteínas mantienen su estructura tridimensional y la migración en el gel depende de su masa: relación de carga de la proteína por encima de su tamaño. Elección del grosor del gel y del tamaño de poro El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína de interés dictan el espesor y tamaño de poro del gel. También se procesarán más lentamente y requieren tiempos de transferencia mas largos que los geles más delgados El porcentaje del gel.5 10 12 15 20 Rango Peso Molecular (kDa) 25-500 15-300 10-200 10-45 5-40    Página 8 . según la cantidad de acrilamida y bisacrilamida. las proteínas cargadas negativamente. Forman uniones con las cadenas de acrilamida para formar un entramado. Están disponibles en diversos tamaños. no son tan rentables como los elaborados por el usuario. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reducción. se describen los componentes químicos de un gel de SDS-PAGE. (tabla 7). cuando se someten a un campo eléctrico. Las moléculas más pequeñas migran más rápidamente que aquellas con pesos moleculares mayores. A más porcentaje menos tamaño de poro. migran al electrodo positivo. Generación de radicales libres que catalizan la reacción de polimerización. El tamaño de poro determina la ratio de separación de las proteínas. la tasa de migración viene determinada por su peso molecular. determina el tamaño del poro. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis de proteínas Reactivos Acrilamida Bisacrilamida SDS Propósito Moléculas que polimerizan para formar cadenas. En la tabla 6.  Tabla 6. se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes. Aumenta la generación de radicales libres por el persulfato de amonio. En esta situación. Debido a que el SDS iguala la carga en todas las proteínas. Sin embargo.Electroforesis en Acrilamida Gel de Electroforesis Si se requieren condiciones naturales para que el anticuerpo pueda detectar el epítopo. Rango de separación de proteínas según el porcentaje de acrilamida. Porcentaje 7. Los geles de SDS-PAGE están disponibles comercialmente o se pueden elaborar en el propio laboratorio. también conocida como PAGE nativo. Tampón Tris Persulfato de Amonio TEMED Los espaciadores de gel (ver Figura 8) controlan el espesor del gel. Mantiene el pH adecuado. la mayoría de ensayos Western Blot.

Colocar el peine en la parte superior del gel. Péptidos de bloqueo   Algunos proveedores ofrecen péptidos de bloqueo para sus anticuerpos. formado por el conjunto de dos cristales. Controles Positivos.Análisis de Proteínas Elaboración del gel Si el gel de acrilamida esta elaborado en el laboratorio. Diseño Experimental. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre los cristales. Controles de carga   Como norma general se utilizan proteínas con niveles de expresión constante para todas las muestras. espaciadores lateral. Por tanto no se detectará ninguna banda. Controles y Estándares Antes de la carga del gel. 4. 2. El gel está listo para cargar las muestras y la electroforesis. Puede ser una muestra de tejido del que se conozca que expresa altos niveles de la proteína de interés. Marcadores de Peso Molecular. peines y un sistema de sujeción (Figura 8). dónde la acrilamida se polimeriza en aproximadamente 30 minutos. Se utilizan para verificar si la proteína de interés está dentro del rango de tamaño apropiado. Las versiones preteñidas se utilizan para controlar el progreso de la electroforesis y comprobar la eficacia de la posterior transferencia. Disponible en diversos intervalos de pesos moleculares. Preparación del gel de electroforesis para la separación de proteínas. espaciador inferior. Figura 8. así como teñidos o incoloros. así los niveles de proteínas se pueden comparar de forma cuantitativa. Verter el ―stacking gel‖ y quitar el peine una vez el gel haya polimerizado. Algunos tratamientos pueden alterar la expresión de estas proteínas ―housekeeping‖.  Para verificar si el anticuerpo primario se une a la proteína correcta. Son una mezcla de proteínas purificadas de peso molecular conocido. son una muestra de la proteína de interés purificada. Tras fijación de los lados. Los tipos de estándares y controles utilizados incluyen: 1. Pueden estar marcadas por la detección por fluorescencia o quimioluminiscencia. los distintos reactivos se mezclan y se vierte en el molde. si está disponible.     Página 9 . verter el gel resolutivo y esperar que el gel se polimerice. Similar a los ―housekeeping genes‖ en Biología Molecular. es importante diseñar el experimento incorporando los controles y estándares necesarios para la validación de los resultados.      2. Se utiliza para verificar que la carga de proteína por carril es más o menos igual. Lavar los pocillos con ddH20. Para mejorar la nitidez de la banda el gel resolutivo se corona con una acrilamida de menor porcentaje (stacking gel). Se pueden utilizar otras especies como tejido de control si el anticuerpo tiene reactividad cruzada apropiada. El péptido de bloqueo se mezcla con el anticuerpo primario antes de la incubación con la membrana y evita la uníón del anticuerpo a la proteína diana. Puede ser una línea celular que sobreexprese la proteína de interés. Generalmente. Estos estudios demuestran que el anticuerpo utilizado se une de forma específica a la proteína de interés. 3. La expresión cuantitativa de la proteína de interés puede normalizarse con la del control de carga para cada muestra.  1.

8 y ralentiza su movimiento. La figura 9 ilustra el flujo de iones durante la electroforesis. aumenta su carga negativa y se mueve por delante de las proteínas. se aleja del electrodo negativo. Los iones de cloruro avanzan por delante de la Gly. El tampón utilizado durante la electroforesis. Con la aplicación de un campo eléctrico. debido a un mayor pH del ―Resolving Gel‖. La glicina empieza a perder su carga a pH 6. Glicina (conductor electricidad) y SDS (mantiene las proteínas cargadas negativamente). del electrodo negativo.Electroforesis en Acrilamida Inicio de Electroforesis Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta. el volumen que se puede cargar por pocillo. Normalmente se cargan de 20 a 40 µg de proteína total por carril. de forma apilada. Las proteínas se separan según su peso molecular por el   Figura 9.3)    La glicina tiene carga negativa en el tampón de electroforesis a pH 8. La técnica de electroforesis más habitualmente utilizada es la de Laemmli. El progreso en el gel se monitoriza observando el frente coloreado por el colorante presente en el tampón de carga y la posición de los marcadores de tamaño siempre que estos estén teñidos.3. Es importante conocer de antemano. el gel se somete a un campo eléctrico generado por una fuente de alimentación. En este método. los valores de pH de la capa de gel de apilamiento o concentración (Stacking Gel) y el gel de resolución (Resolving Gel) son diferentes. El aumento de la resistencia. Concentración de bandas de proteínas por el flujo iónico en el sistema discontinuo de Laemmli. Una vez finalizada la carga. contiene Tris (mantiene el pH). Página 10 .8 Gly Proteinas Resolving Gel pH 8. obliga a las proteínas a alejarse.8 Tampón de Electroforesis (pH 8. La glicina.8) Gly Proteinas CL- Stacking Gel pH 6. Muestra (pH 6. en el Stacking Gel. la glicina. para así evitar sobrecargas que pueden dar lugar a la pérdida de muestra o derrames en pocillos adyacentes.

Transferencia a una Membrana Una vez la electroforesis del gel ha terminado. Ambos métodos requieren. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas. un mayor ruido de fondo.Análisis de Proteínas 4. Los sistemas semisecos son más rápidos y requeiren menor cantidad de volumen de Tampón que los sistemas húmedos. Transferencia de proteínas a una membrana. para una transferencia efectiva de las proteínas. Previamente a la transferencia. Recientemente se han desarrollado. sin embargo no son apropiados para transferencia de proteínas de gran tamaño (>70 kDa) y pueden causar. tanto el gel como la membrana se equilibran en una solución tampón pre-enfriada. Glicina. La mayoría de los sistemas de transferencia utilizan la generación de un campo eléctrico para conducir a las proteínas desde el electrodo negativo al positivo. SDS (opcional) y metanos (para membranas de nitrocelulosa). resistencia la SDS y una mayor unión que la nitrocelulosa. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiempo y elimina la contaminación accidental de las membranas con guantes o tijeras contamindas. con el objetivo de reducir el ruido de fondo al utilizar métodos de detección de fluorescencia. Típicamente. el tampón de transferencia contiene Tris. Información para pedidos L-08001-010 L-08002-010 L-08003-010 Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm Membrana Nitrocelulosa 0. Aunque ambas funcionan bien en experimentos de inmunotransferencia. La membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol. Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre -cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamaño de minigel. las diferencias en sus características puden influir a la hora de la elección. La membrana de PVDF. según el sistema de detección. ofrece una mayor resistencai mecánica. Los sistemas de transferencia están disponibles en formato semiseco o húmedo. membranas PVDF de baja autofluorescencia.45 µm 8x10 cm Membrana Nitrocelulosa 0. permitiendo así que la hibridación de un anticuerpo las pueda detectar. un estrecho contacto entre el gel y la membrana. La figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la membrana en un transferencia semiseca o húmeda. Figura 8.22 µm 8x10 cm Página 11 . las proteínas se transfieren a una membrana.

Se pueden eliminar haciendo rodar suavemente una pipeta Pasteur por encima del ―sándwich‖ formado por el gel/ membrana/papel de filtro. La membrana debe ser desteñida antes del proceso de transferencia. La primera elección. . sin embargo y debido a la presencia de biotina en las fosfoproteínas. Disminuir el voltaje o el tiempo si fuera necesario.PBS AvantTM Buffer Pouches . es la utilización de la leche descremada en polvo. cuando se inicia un nuevo protocolo. así como soluciones tampón en polvo de PCS. son soluciones a base de proteínas. como la leche descremada en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA).Electroforesis en Acrilamida A continuación se describen algunas sugerencias para la consecución exitosa de una transferencia:  Bloqueo El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incubando con una solución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo. Las proteínas y aceites de la piel pueden adherirse a la membrana y pueden dar lugar a manchas no deseadas en la membrana. A menudo.que facilitan una rápida y fácil preparación Información para pedidos R-03024-D50 R-03023-D20 R-01038-020 R-01039-020 AdvanWashTM. un sistema de refrigeración o hacer la transferencia en una cámara fría. WesternBright.. TBS.    El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampón Tris salino) o en PBS (Tampón Fosfato salino). Incrementar la cantidad de SDS y disminuir la concentración de Metanol pueden facilitar la transferencia de proteínas de gran tamaño. ya que es más rentable que el BSA. La tinción con Coomassie puede usarse para la tinción del gel una vez realziada la transferencia y comprobar los residuos de proteína en el gel. 500 ml AdvanBlockTM-PF. Es preferible. No permitir un sobrecalentamiento durante la transferencia. El colorante Ponceau S puede utilizarse para teñir la membrana y asegurarse de la eficacia de la transferencia.TBS Página 12 . Reducir o eliminar el SDS o utilizar una membrana con un tamaño de poro menor puede ayudar a una mayor retención de la proteína. se pueden seleccionar otras soluciones de bloqueo alternativas. Una incubación durante una hora (temperatura ambiente o a 4ºC) suele ser suficiente para un bloqueo de los lugares de unión no específicos del anticuerpo.. Si los niveles del ruido de fondo son demasiados altos. Ajustar las condiciones de transferencia al tamaño de la proteína. se puede añadir también detergente Tween 20. Las burbujas de aire entre el gel y la membrana pueden causar transferencia defectuosa y desigual. para estas y otras situaciones. puede que no sea la mejor elección cuando se van a utilizar anticuerpos fosfoespecíficos o en métodos de detección de biotina. 200 ml AvantTM Buffer Pouches . Las proteínas más pequeñas se transferirán más rápidamente y pueden atravesar la membrana. Es aconsejable utilizar tampón frio.   Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo y de lavado para su línea de reactivos de detección. La aparición de marcadores de tamaño preteñidos en la membrana es indicación que se ha completado la transferencia.  Evitar la manipulación de las membranas con las manos desnudas. el uso de agentes bloqueantes no proteicos.

burro u oveja y son finalmente purificados y probados. Lo hibridomas resultantes secretan anticuerpos al medio de cultivo.Análisis de Proteínas 5. En general. Los dos tipos tienen distintas ventajas y desventajas y se diferencian según la forma en la que se sintetizan. Después del proceso de bloqueo.  Bueno para proteínas poco abundantes. Hibridación del Anticuerpo. Los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir del suero del animal. Más corto Anticuerpos Primarios: Monoclonal vs Policlonal. cabra. Variabilidad Tolerancia a condiciones variables Poca tolerancia Más tolerante a conpuede dejar de diciones variables. Página 13 . Tiempo requerido para su producción Coste de Preparación Largo Mayor coste . Propenso a cierta variabilidad entre lotes. para provocar una respuesta inmune. tanto anticuerpos primarios monoclonales como policlonales. las células que sintetizan anticuerpos se aíslan del bazo del animal y se fusionan con células del mieloma.reMenor coste quiere personal capacitado y equipamiento especializado. Anticuerpos Monoclonales Reconocimiento epitopo y sensibilidad  Reconocimiento de un único epítopo  Menos sensibilidad debido a que sólo un anticuerpo se une a cada proteína Anticuerpos Policlonales  Reconocimiento múltiples epítopos en una proteína  Más sensible debido a los multiples lugares de unión de anticuerpo en cada proteína.  Reactividad cruzada más probable. Algunas características de los anticuerpos monoclonales y policlonales se describen en la Tabla 8. Los lotes de un mismo hibridoma son muy estables. los anticuerpos reconocen una secuencia de aminoácidos pequeña (epítopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de la proteína en condiciones desnaturalizantes y reductoras.  Mayor ruido de fondo potencial debido al reconocimiento de multiples epítopos. la membrana se incuba con el anticuerpo primario. Los hibridomas con secreción más estable se seleccionan y pueden ser cultivados indefinidamente. o por modificaciones químicas (glicosilación fosforilación) o por diferencias en la secuencia peptídica debido a la presencia de polimorfismos. Los geles nativos se pueden utilizar cuando los anticuerpos requieren de la proteína plegada para el reconocimiento del antígeno.  Reactividad cruzada con otras especies más probable. comúnmente conejo. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales. Los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epítopos del antígeno y en cambio los monoclonales reconocen un único epítopo de la proteína. Tabla 8. Para la síntesis de un anticuerpo monoclonal. Reactividad cruzada potencial  Reactividad cruzada menos probable.  Potencial para reconocer otras proteínas que contengan el epítopo. el cual se analiza y determina la afinidad al antígeno. El primer paso en la producción de ambos anticuerpos. En la transferencia Western se pueden utilizar. reconocer al antígeno en condiciones de desnaturalización/reducción de la proteína. es la inyección de un antígeno en un animal.

TBST o en un tampón de disolución de anticuerpo comercial.  Información para pedidos R-05051-050 R-05051-250 R-05052-050 R-05051-250 R-05071-500 R-05072-500 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo. 250 µl IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón. en experimentos de doble etiquetado u otras aplicaciones. TBST o PBST). deber ser producido en otra especie distinta a conejo. Si se utiliza acida sódica como conservante. e incubar en un agitador de vaivén. A continuación se describen las consideraciones a tener en cuenta a la hora de la elección de un anticuerpo secundario:  Las especie del primer Ac dicta la elección del Ac secundario.…). Durante la incubación. la membrana debe someterse a agitación suave y sumergida en la disolución. puede reutilizarse. o sea. se procede a la eliminación del excedente mediante tampones de lavado (TBS. También es posible una incubación a 4ºC durante toda la noche.Hibridación Anticuerpos Incubación de los anticuerpos El anticuerpo primario se diluye en tampón de bloqueo. el segundo Ac debe ser anti-conejo.  Generalmente. ya que los anticuerpos específicos para sub-clases se utilian mayoritariamente.  Página 14 . es necesario un anticuerpo secundario apropiado. IgD. debe ser totalmente lavada de la membrana. ya que puede eliminar la actividad de la peroxidasa e interferir en los métodos de detección. 50 µl IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo. la abundancia de la proteína en la muestra y la sensibilidad del sistema de detección afectarán a la cantidad de anticuerpo a utilizar. En métodos de detección indirectos (sección 6). 250 µl Anticuerpo Secundario conjugado HRP cabra-anti-ratón. En algunos casos. La afinidad del anticuerpo. Si el primer Ac es de conejo. 50 µl IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón. pero a menudo la concentración óptima de anticuerpo debe determinarse empíricamente. un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente suele ser suficiente. Un menor volumen puede utilizarse si la membrana se sella dentro de una bolsa e incuba en un agitador orbital. El fabricante puede recomendar una cantidad inicial. IgG2a. la disolución con el anticuerpo. IgA. IgE) y posiblemente la subclase (IgG1. Para anticuerpos monoclonales se debe considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG. PBS. 500 µl Anticuerpo Secundario conjugado APC cabra-anti-conejo.  Nota: Advansta ofrece una línea completa de anticuerpos secundarios marcados para detección mediante quimioluminscencia o fluorecencia. IgM. Un anticuerpo con amplia especificidad inmunoglobulínica debería ser suficiente. 500 µl Después de la incubación con el anticuerpo primario.

Westernbright Quantum y WesternBright Sirius. La figura 11. 1. Lo métodos indirectos utilizan dos anticuerpos. fácil de documentar. rios a cada Ac primario. como un enzima. La reacción entre el encima y el substrato produce luz. un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer anticuerpo.ilustra los métodos de detección directos e indirectos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e inconvenientes de los dos métodos. sólo un color de reacción) Figura 11 . cada uno con sus ventajas e inconvenientes. Los métodos más comúnmente utilizados para detectar proteínas son: 1. Quimioluminiscencia. 100 uds Película Rayos X LucentBlueTM . que puede ser detectada mediante la exposición de la membrana a una película de rayos X o captada de forma digital utilizando una cámara CCD.  Mayor posibilidad de unión no inespecífica. semicuantitativa .Análisis de Proteínas 6. Métodos de detección. la membrana puede tratarse para re-utilizarse. Ventajas e Inconvenientes de los métodos de detección Indirecto Ventajas Directo  Amplificación de  Menos pasos. Inconvenientes Nota: LucentBlueTM es una película que ha sido optimizada para Información para pedidos L07014-100 L07013-100 Película Rayos X LucentBlueTM . Colorimetría. señal debido a la  Menos posibilidaunión de múltides de unión no ples Ac secundaespecífica. Fluorescencia y 3. 100 uds la detección de señales de quimioluminiscencia en experimentos realizados con los substratos WesternBright HRP. 20x25 cm. la película tiene un rango dinámico limitado. Ventajas: muy sensible. Detección. es el anticuerpo secundario el que está conjugado con un marcaje detectable.  Más pasos. no son posibles detecciones multiplex (detección de mas de una proteína.  Puede ser más costoso. incluyedo WesternBrightTM ECL. Los anticuerpos se pueden marcar mediante kits disponibles en le mercado u obtenerlos ya marcados. Detección directa e indirecta de proteínas Tabla 9.el mismo Ac secundario puede utilizarse para diversos anticuerpos de la misma especie. Quimioluminiscencia. Página 15 . La detección de la proteína se puede hacer mediante métodos directos o indirectos. biotina o molécula fluorescente. Inconvenientes: requiere una habitación oscura (película rayos X) o sistemas de imagen caros.  La inmunorreactividad del Anticuerpo puede estar afectada por el marcaje. Los métodos directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable. En la detección indirecta. la intensidad de la señal puede variar con la incubación o el tiempo de exposición.porque se basa en una reacción enzimática. 2. se pueden hacer multiples exposiciones en películas de rayos X. Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan comúnmente anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP).  Versátil . 13x18 cm.

que cuando es ―excitado‖ emite luz. Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incrementarse utilizando el sistema streptavidina/ biotina). Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento pueden ser costosos. Perfecto para aquellos experimentos en los que se necesite comparar la proteína de interés con un control de carga. fácil documentación de resultados. no requiere cámara oscura. Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado previamente a un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). pero consume mucho tiempo. se pueden detectar múltiples proteínas de forma simultanea. se detecta mediante un dispositivo capaz de medir la fluorescencia o mediante una cámara CCD provista con los filtros de longitud de onda apropiada. las membranas se pueden documentar fácilmente mediante fotografía. Nota: WesternBright TM MCF permite la detección. amplio rango dinámico. La luz emitida. Inconvenientes: no es tan sensible como los otros dos métodos. Información para pedidos K-12021-010 WesternBrightTM fluorescent Western blotting kit Nota: Advansta suministra una línea completa de reactivos de detección de quimioluminiscencia optimizados para los diferenentes métodos. La intensidad de la tinción puede ser medida por espectrofotometría o por un densitómetro. apto para ensayos multiplex con múltiples colorantes. El enzima convierte el colorante en un producto insoluble que es visible en la membrana. Colorimetría. Fluorescencia. o diferentes isoformas de la proteína.Detección 2. La imagen se digitaliza para su análisis. mediante la detección fluorescente multicolor. Re-utilización de la membrana Después de captar la imagen. concentración de muestra y tipos experimentales. Con la detección multiplex de fluorescencia. el color se desvanece con el tiempo. Este procedimiento puede conservar las muestras. es ideal para comparar la proteína de interés con un control de carga. Ventajas: sencilla de realizar. no se requiere el uso de una cámara oscura. pueden usarse Ac primarios marcados (para proteínas abundantes) y eliminar pasos. 3. Las membranas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en protocolos de lavados para reutilización. de dos proteínas en una sola membrana. Información para pedidos K-12042-D10 K-12042-D10 K-12045-D20 K-12042-D10 WesternBrightTM Quantum Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) WesternBrightTM Sirius Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) WesternBrightTM ECL Western Blotting HRP Substrate (para 2000 cm2 de membrana) WesternBrightTM ECL Spray Página 16 . La cantidad de colorante convertido es proporcional al cantidad en la muestra. aporta datas cuantificables. no es tan sensible como la quimioluminiscencia (puede no ser apropiado para proteínas poco abundantes). El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo. la membrana puede ser tratada para volver a ser utilizada para la detección de otra proteína.

19) Bloqueo Insuficiente (ver 24) Transferencia Inadecuada (ver 2) La proteína es mayor a lo esperado (ver 8. Solución de Problemas Solución de problemas con Western Blot A. Ruido de fondo excesivo Preparación Muestra (ver 1) La proteína es menor de lo esperado (ver 7) Bandas Incompletas (ver 12) El gel polimeriza demasiado rápido o demasiado lento (ver 17.21) Lavado inapropiado (ver 25) Unión ineficiente del Anticuerpo (ver 3. No se puede ver la proteína de interés B.Análisis de Proteínas 7. 6) Frente corre curvado ―smiling‖ (ver 22) Elección de Membrana (ver 27) Bandas distorsionadas (ver 16) Frente corre inclinado (ver 23) Unión no específica del Anticuerpo (ver 28) Revelado de la película (ver 29) Página 17 . 4) Rayas Verticales (ver 14) Bandas Múltiples (ver 10) Distorsión Lateral (ver 15) Las bandas aparecen muy altas o muy bajas en el gel (ver 11) Contaminación Reactivos (ver 26) Problemas con los reactivos (ver 5.18. Problemas en la electroforesis E. Tamaño incorrecto de la banda C. Bandas artefactuales D. 9) Bandas Difusas (ver 13) El gel corre demasiado rápido o demasiado lento (ver 20.

Conjugado/Substrato Inac.Reactivos viejos o inestables tivo Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sódica 6. Unión ineficiente del Anticuerpo primario Baja afinidad del anticuerpo por la proteí. Problema 7. Proteína más pequeña de lo esperado Mezclar conjugado + substrato en un tubo. o luminiscencia en oscuridad . Transferencia indadecuada Solución Intentar métodos alternativos. Congelación/descongelación de la muestra Proteína variante (Splicing) Solución Uso de inhibidores de proteasa/muestras frescas Consultar literatura/utilizar controles apropiados Consultar literatura para encontrar aditivos que puedan eliminar grupos químicos 8.…) 4. Proteína más larga de lo esperado Agregado de proteínas . pulso intactos de centrífuga previo a la carga de la muestra Página 18 . Unión ineficiente del Anticuerpo secundario Elección de especies errónea Utilizar un agente de bloqueo alternativo (ej.Incrementar la concentración del Antina o el anticuerpo es antiguo/débil cuerpo.…) Usar Anticuerpos dirigidos contra la especie del Anticuerpo primario Concentración insuficiente del Anticuerpo Aumentar concentración o comprar uno o Anticuerpo antiguo Anticuerpo nuevo 5. Preparación Muestra Causa(s) Extracción ineficiente Baja expresión de la proteína en el tejido o las células La proteína se ha degradado durante la extracción 2. fosforilación. acetilación.: BSA.Solución de Problemas A. Reactivo de detección (ECL) B. incluir control positivo en el gel Cargar más cantidad de proteína total en el gel.conseguir un nuevo reactivo si no hay señal Evitar utilizar disoluciones conteniendo este agente conservante La disolución es antigua o está almacena.puentes disulfuro Uso de DTT en tampón de muestra.Comprar reactivo nuevo da de forma inapropiada Causa (s) Proteólisis.: Leche. disminuir do la concentración de sales el tampón de lavado Antígeno enmascarado por el agente bloqueante (ej. juntar múltiples muestras Usar inhibidores de proteasa en le tampón de lisis Tampón de transferencia preparado inco. incluir un control positivo 9.Usar menor numero de lavados.Revisar el protocolo/disminuir metanol rrectamente/demasiado metanol en el tampón Proteínas de mayor tamaño necesitan mas tiempo/voltaje Contacto insuficiente entre el gel y la membrana Repetir con un tiempo mayor/mayor voltaje Revisar la almohadilla de fibra. sustituir si es muy delgada 3. Proteína más larga de lo esperado y/o bandas múltiples Proteínas modificadas de forma natural (glicosilación. concentrar utilizando Afyon. etc…) Cambio de la expresión de la proteína en la línea celular Utilizar cultivos anteriores. Problema 1. comprar un anticuerpo nuevo y almacenarlo de forma apropiada El Anticuerpo tiene reactividad cruzada débil con las especies de interés Probar con un Anticuerpo primario de diferente origen El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava.

Disminuir concentraciones. disminuir para proteínas de gran tamaño Solución Usando una pipeta. Distorsión de las bandas Difusión de la muestra en los pocillos durante la carga Fallo en la completa polimerización de los Incrementar TEMED/AP pocillos Presión aplicada excesiva a la hora de montar el gel Burbujas en el gel debido al uso de cristales sucios No apretar en exceso los tornillos del sistema. Distorsión lateral de las bandas 16. El gel polimeriza muy lento TEMED/AP Insuficiente La disolución de AP ha perdido su actividad Página 19 . apretar hasta encontrar primera resistencia Usar guantes en la preparación de los geles Uso de Etanol y H2O desionizada en la limpieza de los cristales Burbujas introducidas en el gel por el dispositivo de llenado (jeringa o pipeta) Burbujas de aire atrapadas por el peine No expulsar totalmente el volumen de la mezcla del gel Insertar el peine en ángulo y antes que se polimerice el gel Solución Repetir con TEMED y AP Preparar AP fresco Aplicar isopropanol antes de verter el gel de apilamiento (stacking gel) Incrementar la cantidad de TEMED/AP Preparar disolución fresca de AP D. Rayas en los carriles Alta concentración de sales en la muestra Disminuir la concentración de sal en el tampón de muestra Muestra muy concentrada o insuficiente SDS Incrementar concentración/usar más SDS Minimizar el tiempo de carga 15. Problema 12. asegurarse de la correcta preparación del tampón Asegurarse que las muestras se han incubado durante 2 min a 90ºC antes de cargarlas en el gel Preparar SDS nuevo para le tampón de muestra 11.Análisis de Proteínas B. El gel no polimeriza Causa (s) Fallo al añadir el TEMED y AP La disolución AP es estable durante dos o tres días a 4ºC El oxígeno inhibe la polimerización 18. intentar un rio o secundario experimento de bloqueo de péptido (eliminará la proteína de interés) Incrementar el porcentaje para proteínas de pequeño tamaño. Bandas Incompletas Causa(s) Burbujas entre el gel y la membrana 13. Problema (continuación) 10. Bandas Extras Causa(s) Solución Unión no específica del Anticuerpo prima. Problema 17. hacer rodar por encima del paquete gel/membrana para forzar la salida de las burbujas Incrementar voltaje. Bandas difusas Migración lenta Las muestras no se han calentado correctamente El SDS del tampón es antiguo 14. La proteína aparece muy Porcentaje erróneo/no óptimo del gel alta o muy baja en la membrana C.

preparar nuevos Elegir membranas de Nitrocelulosa Utilizar únicamente membranas PVDF con baja autofluorescencia con Western Blots fluorescentes Estar seguro que la membrana esta húmeda durante todo el proceso Disminuir la concentración de Anticuerpo. Tiempo de carrera inusualmente corto 22. colocar una esquina en el tanque inferior del sistema de electroforesis. intentar con Anticuerpo monoclonal o purificado por afinidad Disminuir la cantidad de proteína 27. Frente curvado (smiling) Tampón demasiado diluido Migración demasiado rápida Generación de calor 23. Problema (continuación) 19. si no es cula o al CCD posible incrementar la dilución de los Anticuerpos o cargar menor cantidad de muestra Página 20 . El polimeriza demasiado rápido 20. Sobreexposición de la imagen El tiempo excesivo de exposición a la pelí. Tiempo de carrera inusualmente largo Causa(s) Cantidad excesiva de TEMED/AP Buffer de electroforesis demasiado concentrado Voltaje insuficiente 21. Condiciones de lavado inapropiadas Número insuficiente de lavados Concentración insuficiente de detergente Incrementar la concentración de detergente o usar detergentes más fuertes (SDS. o la leche contiene el antígeno de interés Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright MCF.Reducir los tiempos de exposición. Unión no específica del Anticuerpo primario o secundario Concentración muy alta del Anticuerpo o no purificado por afinidad Mucha cantidad de proteína en el gel 29. Elección de tipo de mem. refrigerar Aguantar el gel en ángulo. Contaminación de los reactivos Crecimiento bacteriano o fúngico en los tampones Revisar la turbidez de los tampones.Las membranas PVDF pueden tener más brana ruido de fondo que las de Nitrocelulosa Algunas membranas tienen alta autofluorescencia Membrana seca 28. Problema 24. manteniendo la relación entre ambos Revisar protocolo. lentamente volver a posición vertical Solución Usar BSA E. Frente inclinado Burbuja atrapada entre los cristales en la parte inferior del gel Solución Reducir la cantidad de TEMED/AP. NP-40) 26.Solución de Problemas D. diluir el tampón en caso necesario Incrementar voltaje Revisar el protocolo. Bloqueo insuficiente Causa(s) La presencia de Biotina en la leche es incompatible con el uso de Estreptavidina. reemplazar tampón en caso necesario Disminuir voltaje Disminuir voltaje. algún Anticuerpo primario puede requerir un bloqueante proteico La disolución está demasiado diluida Tiempo de bloqueo muy corto Algunos detergentes no son efectivos a bajas temperaturas Incluir BSA o leche en la disolución AdvanBlock-PF utilizada en la dilución del Anticuerpo primario Incrementar con un 5% la disolución Incrementar el tiempo de incubación Incubar a temperatura ambiente en vez de toda la noche a 4ºC Incrementar el número de lavados o la duración de cada uno de ellos 25.

R) Primera posición C Leucina (Leu. E) CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG G Cisteina (Cys.17 1.7 10 pmol o 6x1012 moléculas 6. T) AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG Histidina (His.000 20. G) Tabla 11. Herramientas y Referencias Técnicas g de Soluto Molaridad de una disolución = [Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolución) Tabla 10. Glutámico (Glu. N) Lisina (Lys. L) UCU UCC UCA UCG C Serina (Ser.2x1013 moléculas 1 nmol 10 µg 50 µg 100 µg 150 µg Tabla 12.7 pmol o 4x1012 moléculas Página 21 . Conversión entre masa y moles de proteína Peso molecular (Da) 10. F) Leucina (Leu. Aspártico (Asp. C) STOP Triptófano (Trp. D) A. Código genético y abreviaciones de los aminoácidos Segunda Posición U UUU UUC U UUA UUG Fenilalanina (Phe. H) Glutamina (Gln.35 1. Q) Asparagina (Asn.Análisis de Proteínas 8. M) Valina (Val. A) Glicina (Gly. W) Arginina (Arg. I) Metionina (Met. T) STOP UGU UGC UGA UGG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG CAU CAC CAA CAG Treonina (Thr.5 3. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale Proteina IgG IgM IgA Proteina A Avidina Estreptavidina Albumina suero bovino A280 Uds por 1 mg&ml 1.000 100. S) Arginina (Arg.2 1. S) UAU UAC UAA UAG A Tirosina (Tyr.000 150. R) A G GCU GCC GCA GCG Alanina (Ala.000 1 µg 100 pmol o 6x1013 moléculas 20 pmol o 1. K) A.3 0. V) Serina (Ser.4 0. L) Prolina (Pro. P) Isoleucina (Ile.

unidad de masa molecular mol molaridad. All other trademarks. Página 22 . LucentBlue™ and WesternBright™ are trademarks of the Company. Prefijos métricos M K m µ mega Kilo mili micro 106 103 10-3 10-6 n K f a nano pico femto atto 10-9 10-12 10-15 10-18 Tabla 16. service marks and tradenames appearing in this brochure a re the property of their respective owners. All rights reserved.1 156.12 128.2 87.2 57.1 129.05 137.2 113. Avant™.3 días 87. Afyon™.2 114.1 91.08 103.1 115.Herramientas y Referencias Tabla 13. AdvanBlock™.2 163. Vida media de los Radioisótopos más habituales Radioisótopo Carbono-14 (14C) Iodo-125 (125I) Fósforo-32 (32P) Azufre-35 (35S) Tritio (3H) Vida media 5.4 días 12.730 años 60 días 14.1 99.1 147. Masa molecular media de los aminoácidos Códigos Aminoácidos A C D E Tabla 14.4 años R S T V W Y Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Peo Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Masa molecular media 71. moles de soluto por litro de disolución F G H I K L M N P Q Tabla 15. The Advansta logo is a registered trademark of the Company. 1..2 Copyright © 2011 Advansta. Abreviaciones ds ss bp kb Da mol M doble cadena ( como en dsDNA) cadena sencilla (como en ssDNA) pares de base kilobase.08 101.2 131.07 186.000 bases o pares de base Dalton. Adva nWash™.2 128.1 113.

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