Análisis de Proteínas

Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección

advansta

Análisis de Proteínas

Análisis de Proteínas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés. Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras. Esta guía de laboratorio describe los pasos involucrados en la realización de un Western blot, incluyendo la preparación de muestras, la separación de proteínas, la transferencia y la detección.

Índice de Contenidos
1. Western Blot: Visión General 2. Preparación de las muestras 3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida 4. Transferencia Electroforética 5. Hibridación Anticuerpos 6. Detección 7. Solución de Problemas 8. Herramientas y Referencias Técnicas

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1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4. Página 1

La disrupción mecánica con un homogenizador disgrega los tejidos. Los materiales de partida incluyen planta. células cultivadas. tejidos animales. Western Blot: Visión General Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso. Se aplica voltaje en el tanque de transferencia y las proteínas migran desde el gel a la membrana. Transferencia electroforética a una membrana Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana. que conducirá la corriente. Un cartucho aplica presión y mantiene un estrecho contacto entre el gel y la membrana. Así. Se utiliza una pipeta para cargar las muestras en los pocillos del gel Una fuente de alimentación proporciona el voltaje El gel se coloca dentro de un tanque de electroforesis lleno de tampón. Figura 2. la migración de la muestra se puede monitorizar. Se prepara un gel de acrilamida. de forma proporcional a la masa de cada proteína. dónde quedan inmovilizadas.. bisacrilamida. Se añade un colorante de carga.Western Blot: Visión General 1. o bacterias. Procesos adicionales logran el fraccionamiento subcelular Se usan tampones conteniendo detergentes para la lisis celular Figura 1. El gel y la membrana se coloca entre papel de filtro y almohadillas de esponja. Figura 3. Electroforesis en gel de Acrilamida Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. a. Preparación de muestras b. El dodecilsulfato de sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere. levadura. Preparación de la muestra Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química. una carga negativa a cada una de ellas. La proteínas con carga negativa migran desde el ánodo. Electroforesis en Acrilamida c. Transferencia de Proteínas a la Membrana Página 2 .

A continuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana. Los materiales de partida incluyen tejidos vegetales. Para la detección de quimioluminiscencia. Dicha luz puede ser detectada en una película de rayos X. Hibridación de Anticuerpo Figura 5. Detección de las Bandas Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido. mediante un sistema de captación de imágenes. levadura. Detección quimioluminiscente de las bandas de proteínas Página 3 . e.Análisis de Proteínas a. Figura 4. La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz emitid por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario. se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP). o bacterias. proporcionando una forma de detección. células en cultivo. Tras varios lavados de la membrana. se procede a detectar la localización de la banda en la membrana. tejidos animales. se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma específica al anticuerpo primario. Hibridación del Anticuerpo La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos. o de forma digital. la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción enzimática que da como resultado final la emisión de luz.

se suelen lisar utilizando una solución tampón con detergente y sin la aplicación de métodos mecánicos. tejidos. unida a la membrana. Las células en cultivo. tales como el homogenizador Dounce Los detergentes Triton son suaves y no iónicos Para antígenos con niveles bajos de expresión pueden ser necesarios procesos de enriquecimiento Citoplasmático (unida a citoesqueleto) Tris-Triton Membrana mitocon.. útil para protocolos de enriquecimiento de proteínas mitocondriales o nucleares Homogenizador Dounce Homogenizador de ultrasonidos Ondas de sonido Células. RIPA drial o nuclear (multiples detergentes). más utilizados habitualmente. La estructura química de los detergentes permite romper las membranas celulares y solubilizar las proteínas. bacemitidas por una terias. que va dirigida a enriquecer la proteína de interés dentro del extracto final. Tabla 1. Tipo de muestra Gran cantidad de tejido Células tisulares. Preparación de la muestra Una adecuada preparación de la muestra es esencial para tener éxito en un ensayo de Western Blot. afectando así a los procesos de fraccionamiento subcelular. RIPA..Las proteínas citoplasmáticas se pueden unir a las proteínas del citoesqueleto. citoplasmática. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar según las características del grupo polar: iónicos si el grupo polar tiene carga positiva o negativa. en muestras tisulares de plantas y animales. Triton X-100 Página 4 . dentro de la célula. La elección de la substancia detergente. En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampón y detergentes.NP-40. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida. Deoxicolatos) Puede combinarse con métodos mecánicos. frecuentemente. se requiere el uso de un proceso mecánico para la disrupción de la compleja matriz celular. En la tabla 1 se resumen los métodos mecánicos que habitualmente se utilizan en la extracción de proteínas para inmunotransferencia. según el tipo de proteína y localización subcelular.Preparación de la muestra 2. etc. Disrupción mecánica que suele preceder a un proceso químico de lisis celular. Soluciones Tampón y detergentes. de la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico. según el tipo de proteína de interés y la localización subcelular Tipo/Localización Proteína de interés Nativa (no desnaturalizada) Citoplasmáticos (soluble) Detergente o Solución Tampón Detergente suave no iónico Tris-HCl TComentarios Evitar detergentes desnaturalizantes (SDS. las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o mecánicos. En la mayoría de ensayos. mediante el uso de solución tampón que contiene detergentes. Triton X-100 Lisado total de células NP-40. A menudo. de la proteína de interés. dentro de orgánulos celulares como el núcleo y las mitocondrias. sonda para romper las membranas celulares La muestra se pulve. depende en parte de la localización.Tejido animal o o riza utilizando un vegetal mortero y una almirez refrigerados La ruptura celular se Levaduras produce por agitación de las perlas de vidrio Pulverización en Nitrógeno líquido Perlas de vidrio Tabla 2. Métodos físicos para la dirupción de muestras Método Licuadora Descripción La muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias Tubo de vidrio con pistón ajustado maja las células por acción de corte. no iónicos si no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga negativa y positiva y la carga neta es 0.

las proteínas. es importante evitar.1—1 mM Concentración en el Tampón de lisis 1 mM 1-10 mM 1-10 mM 1-2 µg/ml 1µg/ml (17-170 µg/ml) O. Electroforesis en Acrilamida Las proteínas del extracto se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). en particular en estudios de fosforilación. La cantidad de proteína óptima a cargar dependerá de la prevalencia de la proteína de interés y de la sensibilidad del anticuerpo primario. mediante la acción del detergente Dodecilsulfato Sódico (SDS). puede ser interesante reducir la actividad de la fosfatasa alcalina. Información para pedidos K-02101-025 Afyon ™ SDS-PAGE ssmple preparation kit Página 5 . cualquier actividad proteásica. para determinar la carga de proteína apropiada. para 5 µg de proteína se utilizan 20 µl de resina Afyon. Por ejemplo. Cisteinas Proteasas de Aspartico Proteasas de Serina Inhibidores Fosfatasas  . Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un mayor ruido de fondo y unión no específica de los anticuerpos. A menudo. En la tabla 3 se muestran los inhibidores deproteasa y fosfatasa de uso más habitual. es importante determinar la concentración de proteínas por las siguientes razones: 1. Por tanto. durate la preparación de la muestra. se pueden separar en el gel según su tamaño (SDSPAGE). Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la extracción de proteínas. se puede controlar la cantidad de carga de la proteína mediante la cantidad de resina utilizada. Leupeptin Pepstatina A PMSF Nota: con el kit Afyon ™ SDS-PAGE de preparación de muestra.  Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis. se requiere hacer experimentos preliminares con cantidades seriadas de proteínas.Glicerofosfato EDTA EGTA Enzimas diana Fosfatasas Serina/ Treonina Mg++/Mn++ Metaloproteasas Ca++ Metaloproteasas Proteasas de Serinas. Además de inhibir la actividad de la proteasa. evitando la necesidad de determinar la concentración de proteína.1—1 mM Proteasas de Serina Mg++/Mn++ Metaloproteasas Ca++ Metaloproteasas Proteasas de Serinas. Tabla 3. se revisten con carga negativa.  Trabajar rápido y mantener las muestras en frío durante todo el proceso. Cisteinas Proteasas de Aspartico Proteasas de Serina 3. La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradación de proteínas:  Evitar excesivos ciclos de congelación/ descongelación. Inhibidores Proteasas Aprotinina EDTA EGTA Leupeptin Pepstatina A PMSF Concentración en Enzimas diana el Tampón de lisis 1-2 µg/ml 1-10 mM 1-10 mM 1-2 µg/ml 1µg/ml (17-170 µg/ml) O. Asegurar la carga de la cantidad correcta de proteínas en el gel. se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés. En primer lugar. así Las proteínas. Medición de proteína total Previamente a la electroforesis.Análisis de Proteínas Con la rotura celular.

Proteína (mg) Figura 6. Con el fin de determinar la concentración de proteínas totales en una muestra.  Rango lineal pequeño. Estos ensayos colorimétricos se basan en las reacciones que se producen entre las proteínas de la muestra y los reactivos de detección. el gentes  ComercialBCA se une a los iones de mente dispoCu1+ y forman nible en forun producto mato comcoloreado que patible con se puede meagentes dir espectroforeductores. En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva estándar. Elección de un ensayo de proteínas Absorvancia Tabla 4. Los valores de absorvancia se trazan en función del contenido conocido de la proteína estándar utilizada. de proteína pura. Esto se logra con la realización de un ensayo de concentración crecientes.  La cantidad de muestra disponible. El contenido de la proteína de interés en la muestra (línea verde) se puede determinar mediante la extrapolación de la absorvancia obtenida a la cantidad o concentración de proteína correspondiente. Un experimento de Western Blot cuantitativo es útil para estudio de cambios de expresión de proteínas o de modificaciones proteicas como la fosforilación. Ejemplo de la curva estándar de un ensayo de proteínas. Realización de Western Blots cuantitativos o semi-cuantitativos. etc…). Si la cantidad de proteína cargada por carril es la misma. aunque se puede utilizar cualquier proteína producida en el laboratorio o disponible comercialmente. Los más habituales son los métodos Lowry.Electroforesis en Acrilamida 2.  Los reactivos del tampón de lisis . El tiempo de da en literatura ensayo puede ser mayor que en otros métodos  No es práctico para grupos grandes de muestras  Se pueden formar precipitados Hay muchos kits de determinación de proteínas disponibles comercialmente. se debe realizar una curva estándar en cada ensayo. Se representa la absorvancia de las soluciones estándar que contienen la proteína conocida (línea roja). metricamente  Menos varia(reacción de ción proteíBiuret) na-proteína que en el método Bradford. Similar al BCA (reacción de Biuret) Lowry Muy bien cita. La elección depende de muchos factores:  El equipo de lectura disponible en el laboratorio (espectrofotómetro.revisar el protocolo del fabricante para identificar sustancias interferentes. La concentración de la proteína de interés se puede determinar extrapolando la absorvancia obtenida en la curva patrón o estándar (línea verde de puntos). Descripción del método Existen diversos métodos para medir la proteína total de una muestra. lector de placas. El estándar utilizado con mayor frecuencia es la albúmina de suero bovino (BSA). Bradford y Ácido Bincocinico (BCA) (Tabla 4). Página 6 . Interferencia con agentes quelantes o reductores del Cobre BCA Reducción de  Compatible iones de Cu2+ con la mayo mediante interación con las ría de deterproteínas. se pueden comparar los niveles relativos de la proteína de interés.  La facilidad/rapidez del ensayo. Métodos físicos para la dirupción de muestras Ensayo Bradford Descripción El colorante azul de Coomasie se une a las proteínas y sufre un cambio de absorvancia Ventajas La realización de los ensayos son generalmente rápidos y sencillos Inconvenientes  Interferencia de SDS o de otros detergentes a altas concentraciones .

combinándolas con un tampón de carga y cargar la muestra en un gel de electroforesis. Detergente desnaturalizante  Cola hidrofóbica que rodea la esqueleto peptídico. Componentes del tampón de carga. aportando carga negativa de forma proporcional al tamaño de la proteína. Propósito Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar la muestra la fondo del pocillo y evitar que se extienda a los pocillos adyacentes. Alternativamente. teniendo cuidado en evitar ciclos repetitivos de congelación/ descongelación. Advansta dispone de tampones de carga reductores y no reductores. Reactivo Glicero. Molécula colorante pequeña:  Da color a la muestra para ayudar a la carga.  Unión a la proteína de forma regular. se pueden utilizar inmediatamente. manteniendo su carga intrínseca SDS El SDS se une a la proteína y da lugar a una linearización y a una uniformidad de la carga negativa de ésta. En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanismo de desnaturalización del SDS. Agentes reductores  Evita la oxidación de cisteínas. Los ingredientes típicos de un tampón de carga para detectar proteínas bajo condiciones desnaturalizantes/reductoras se describen en la Tabla 5. se pueden conservar congeladas. de modo que se puede hacer el seguimiento del movimiento de las muestras en el gel.  Destruye la estructura secundaria/ terciaria y lineariza la proteína. Figura 7.Análisis de Proteínas Tampón de carga de muestras Una vez se tienen las muestras de proteína. Información para pedidos R– 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x) R-03019-B10 Reducing protein sample loading buffer (2x) Tampón Tris Pepstatina A Beta Mercaptoetanol o DTT Página 7 . Mantiene el pH adecuado Azul de Bromofenol SDS Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y garantizan que las muestras se separan de forma reproducible. Previamente a la carga del gel. esta incubación no es necesaria. La proteína se encuentra en su estado conformacional. beta mercaptoetanol o ditiotreitol. Los componentes del tampón de carga varían. En condiciones no desnaturalizantes/no reductoras. las muestras se someten a una incubación a 95ºC durante 5-10 minutos. dependiendo de las condiciones deseadas.  Migra por delante de las proteínas. si se necesitan condiciones no desnaturalizantes /no reductoras. No se utilizarán ni SDS.  Completan la linearización de la proteína al romper los puentes disulfuro. Mecanismo de desnaturalización por SDS de las proteínas.  Evita las interacciones hidrofóbicas y rompe los enlaces de hidrógeno. para asegurar que la desnaturalización/ reducción es total. Tabla 5. carril a carril y gel a gel.

Aumenta la generación de radicales libres por el persulfato de amonio. Porcentaje 7. cuando se someten a un campo eléctrico. A más porcentaje menos tamaño de poro. determina el tamaño del poro. en la electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en el tampón de electroforesis. Tampón Tris Persulfato de Amonio TEMED Los espaciadores de gel (ver Figura 8) controlan el espesor del gel. también conocida como PAGE nativo. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reducción. las proteínas mantienen su estructura tridimensional y la migración en el gel depende de su masa: relación de carga de la proteína por encima de su tamaño. Debido a que el SDS iguala la carga en todas las proteínas. la tasa de migración viene determinada por su peso molecular. Las moléculas más pequeñas migran más rápidamente que aquellas con pesos moleculares mayores. las proteínas cargadas negativamente. Sin embargo. Los geles con mayor espesor. Los geles de SDS-PAGE están disponibles comercialmente o se pueden elaborar en el propio laboratorio. El tamaño de poro determina la ratio de separación de las proteínas. se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes. Generación de radicales libres que catalizan la reacción de polimerización. En la tabla 6. migran al electrodo positivo. no son tan rentables como los elaborados por el usuario. (tabla 7).5 10 12 15 20 Rango Peso Molecular (kDa) 25-500 15-300 10-200 10-45 5-40    Página 8 . Elección del grosor del gel y del tamaño de poro El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína de interés dictan el espesor y tamaño de poro del gel. Tabla 7. Rango de separación de proteínas según el porcentaje de acrilamida. Están disponibles en diversos tamaños. la mayoría de ensayos Western Blot. En esta situación.  Tabla 6.Electroforesis en Acrilamida Gel de Electroforesis Si se requieren condiciones naturales para que el anticuerpo pueda detectar el epítopo. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis de proteínas Reactivos Acrilamida Bisacrilamida SDS Propósito Moléculas que polimerizan para formar cadenas. se describen los componentes químicos de un gel de SDS-PAGE. Los geles pre-fabricados son muy prácticos pero debido al coste. También se procesarán más lentamente y requieren tiempos de transferencia mas largos que los geles más delgados El porcentaje del gel. pueden aceptar mayor volumen de carga. Mantiene el pH adecuado. Mantiene la linearidad y la uniformidad de carga de las proteínas según la electroforesis. Forman uniones con las cadenas de acrilamida para formar un entramado. según la cantidad de acrilamida y bisacrilamida.

formado por el conjunto de dos cristales. Los tipos de estándares y controles utilizados incluyen: 1. Lavar los pocillos con ddH20. así como teñidos o incoloros. Péptidos de bloqueo   Algunos proveedores ofrecen péptidos de bloqueo para sus anticuerpos.  Para verificar si el anticuerpo primario se une a la proteína correcta. Son una mezcla de proteínas purificadas de peso molecular conocido. Similar a los ―housekeeping genes‖ en Biología Molecular. El péptido de bloqueo se mezcla con el anticuerpo primario antes de la incubación con la membrana y evita la uníón del anticuerpo a la proteína diana. Pueden estar marcadas por la detección por fluorescencia o quimioluminiscencia. espaciador inferior. Se utilizan para verificar si la proteína de interés está dentro del rango de tamaño apropiado. Verter el ―stacking gel‖ y quitar el peine una vez el gel haya polimerizado. Controles Positivos. 3. Para mejorar la nitidez de la banda el gel resolutivo se corona con una acrilamida de menor porcentaje (stacking gel). peines y un sistema de sujeción (Figura 8). Controles y Estándares Antes de la carga del gel.      2. Tras fijación de los lados. son una muestra de la proteína de interés purificada. Generalmente. los distintos reactivos se mezclan y se vierte en el molde. Estos estudios demuestran que el anticuerpo utilizado se une de forma específica a la proteína de interés. Controles de carga   Como norma general se utilizan proteínas con niveles de expresión constante para todas las muestras. La expresión cuantitativa de la proteína de interés puede normalizarse con la del control de carga para cada muestra. espaciadores lateral. El gel está listo para cargar las muestras y la electroforesis. Disponible en diversos intervalos de pesos moleculares. Puede ser una muestra de tejido del que se conozca que expresa altos niveles de la proteína de interés. Se pueden utilizar otras especies como tejido de control si el anticuerpo tiene reactividad cruzada apropiada. 4.     Página 9 . Diseño Experimental. 2. Las versiones preteñidas se utilizan para controlar el progreso de la electroforesis y comprobar la eficacia de la posterior transferencia. así los niveles de proteínas se pueden comparar de forma cuantitativa. Marcadores de Peso Molecular. dónde la acrilamida se polimeriza en aproximadamente 30 minutos. Preparación del gel de electroforesis para la separación de proteínas. si está disponible. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre los cristales. Figura 8. Algunos tratamientos pueden alterar la expresión de estas proteínas ―housekeeping‖. es importante diseñar el experimento incorporando los controles y estándares necesarios para la validación de los resultados. Colocar el peine en la parte superior del gel. Por tanto no se detectará ninguna banda. Puede ser una línea celular que sobreexprese la proteína de interés.  1. verter el gel resolutivo y esperar que el gel se polimerice.Análisis de Proteínas Elaboración del gel Si el gel de acrilamida esta elaborado en el laboratorio. Se utiliza para verificar que la carga de proteína por carril es más o menos igual.

Concentración de bandas de proteínas por el flujo iónico en el sistema discontinuo de Laemmli. del electrodo negativo. El aumento de la resistencia. el volumen que se puede cargar por pocillo. En este método. La técnica de electroforesis más habitualmente utilizada es la de Laemmli. aumenta su carga negativa y se mueve por delante de las proteínas.Electroforesis en Acrilamida Inicio de Electroforesis Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta.3)    La glicina tiene carga negativa en el tampón de electroforesis a pH 8. la glicina. debido a un mayor pH del ―Resolving Gel‖. Los iones de cloruro avanzan por delante de la Gly. Las proteínas se separan según su peso molecular por el   Figura 9. El progreso en el gel se monitoriza observando el frente coloreado por el colorante presente en el tampón de carga y la posición de los marcadores de tamaño siempre que estos estén teñidos. en el Stacking Gel. Muestra (pH 6. el gel se somete a un campo eléctrico generado por una fuente de alimentación. La glicina empieza a perder su carga a pH 6. contiene Tris (mantiene el pH).8 Gly Proteinas Resolving Gel pH 8. los valores de pH de la capa de gel de apilamiento o concentración (Stacking Gel) y el gel de resolución (Resolving Gel) son diferentes.8) Gly Proteinas CL- Stacking Gel pH 6.8 y ralentiza su movimiento. La figura 9 ilustra el flujo de iones durante la electroforesis. se aleja del electrodo negativo. Página 10 .3. obliga a las proteínas a alejarse. para así evitar sobrecargas que pueden dar lugar a la pérdida de muestra o derrames en pocillos adyacentes. Una vez finalizada la carga. Con la aplicación de un campo eléctrico. Es importante conocer de antemano. La glicina. Glicina (conductor electricidad) y SDS (mantiene las proteínas cargadas negativamente). El tampón utilizado durante la electroforesis.8 Tampón de Electroforesis (pH 8. Normalmente se cargan de 20 a 40 µg de proteína total por carril. de forma apilada.

sin embargo no son apropiados para transferencia de proteínas de gran tamaño (>70 kDa) y pueden causar. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiempo y elimina la contaminación accidental de las membranas con guantes o tijeras contamindas. el tampón de transferencia contiene Tris. ofrece una mayor resistencai mecánica. Recientemente se han desarrollado. Información para pedidos L-08001-010 L-08002-010 L-08003-010 Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm Membrana Nitrocelulosa 0. resistencia la SDS y una mayor unión que la nitrocelulosa. Los sistemas semisecos son más rápidos y requeiren menor cantidad de volumen de Tampón que los sistemas húmedos. Ambos métodos requieren. La figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la membrana en un transferencia semiseca o húmeda. las proteínas se transfieren a una membrana. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas. un mayor ruido de fondo. las diferencias en sus características puden influir a la hora de la elección. permitiendo así que la hibridación de un anticuerpo las pueda detectar. Transferencia de proteínas a una membrana. Figura 8. La mayoría de los sistemas de transferencia utilizan la generación de un campo eléctrico para conducir a las proteínas desde el electrodo negativo al positivo. tanto el gel como la membrana se equilibran en una solución tampón pre-enfriada. Los sistemas de transferencia están disponibles en formato semiseco o húmedo. La membrana de PVDF. SDS (opcional) y metanos (para membranas de nitrocelulosa).22 µm 8x10 cm Página 11 . La membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol. Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre -cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamaño de minigel. Típicamente. Previamente a la transferencia. Aunque ambas funcionan bien en experimentos de inmunotransferencia.Análisis de Proteínas 4. para una transferencia efectiva de las proteínas. Transferencia a una Membrana Una vez la electroforesis del gel ha terminado. según el sistema de detección. con el objetivo de reducir el ruido de fondo al utilizar métodos de detección de fluorescencia. membranas PVDF de baja autofluorescencia.45 µm 8x10 cm Membrana Nitrocelulosa 0. Glicina. un estrecho contacto entre el gel y la membrana.

WesternBright. La primera elección. 200 ml AvantTM Buffer Pouches . 500 ml AdvanBlockTM-PF. ya que es más rentable que el BSA. Si los niveles del ruido de fondo son demasiados altos. Las burbujas de aire entre el gel y la membrana pueden causar transferencia defectuosa y desigual. La aparición de marcadores de tamaño preteñidos en la membrana es indicación que se ha completado la transferencia. El colorante Ponceau S puede utilizarse para teñir la membrana y asegurarse de la eficacia de la transferencia. Se pueden eliminar haciendo rodar suavemente una pipeta Pasteur por encima del ―sándwich‖ formado por el gel/ membrana/papel de filtro.TBS Página 12 . Es preferible. La membrana debe ser desteñida antes del proceso de transferencia. se puede añadir también detergente Tween 20. Reducir o eliminar el SDS o utilizar una membrana con un tamaño de poro menor puede ayudar a una mayor retención de la proteína.que facilitan una rápida y fácil preparación Información para pedidos R-03024-D50 R-03023-D20 R-01038-020 R-01039-020 AdvanWashTM. puede que no sea la mejor elección cuando se van a utilizar anticuerpos fosfoespecíficos o en métodos de detección de biotina. TBS.Electroforesis en Acrilamida A continuación se describen algunas sugerencias para la consecución exitosa de una transferencia:  Bloqueo El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incubando con una solución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo.. Incrementar la cantidad de SDS y disminuir la concentración de Metanol pueden facilitar la transferencia de proteínas de gran tamaño. para estas y otras situaciones.   Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo y de lavado para su línea de reactivos de detección. es la utilización de la leche descremada en polvo..  Evitar la manipulación de las membranas con las manos desnudas. son soluciones a base de proteínas. como la leche descremada en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA).PBS AvantTM Buffer Pouches . La tinción con Coomassie puede usarse para la tinción del gel una vez realziada la transferencia y comprobar los residuos de proteína en el gel. así como soluciones tampón en polvo de PCS. Es aconsejable utilizar tampón frio. un sistema de refrigeración o hacer la transferencia en una cámara fría. Una incubación durante una hora (temperatura ambiente o a 4ºC) suele ser suficiente para un bloqueo de los lugares de unión no específicos del anticuerpo. sin embargo y debido a la presencia de biotina en las fosfoproteínas. Las proteínas más pequeñas se transferirán más rápidamente y pueden atravesar la membrana. Ajustar las condiciones de transferencia al tamaño de la proteína.    El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampón Tris salino) o en PBS (Tampón Fosfato salino). . A menudo. cuando se inicia un nuevo protocolo. No permitir un sobrecalentamiento durante la transferencia. Disminuir el voltaje o el tiempo si fuera necesario. se pueden seleccionar otras soluciones de bloqueo alternativas. el uso de agentes bloqueantes no proteicos. Las proteínas y aceites de la piel pueden adherirse a la membrana y pueden dar lugar a manchas no deseadas en la membrana.

Después del proceso de bloqueo. Para la síntesis de un anticuerpo monoclonal. Tabla 8. En la transferencia Western se pueden utilizar. Los geles nativos se pueden utilizar cuando los anticuerpos requieren de la proteína plegada para el reconocimiento del antígeno. Tiempo requerido para su producción Coste de Preparación Largo Mayor coste . cabra. En general.  Mayor ruido de fondo potencial debido al reconocimiento de multiples epítopos.Análisis de Proteínas 5. tanto anticuerpos primarios monoclonales como policlonales. Lo hibridomas resultantes secretan anticuerpos al medio de cultivo. Propenso a cierta variabilidad entre lotes. o por modificaciones químicas (glicosilación fosforilación) o por diferencias en la secuencia peptídica debido a la presencia de polimorfismos. Página 13 . Reactividad cruzada potencial  Reactividad cruzada menos probable. Variabilidad Tolerancia a condiciones variables Poca tolerancia Más tolerante a conpuede dejar de diciones variables.  Reactividad cruzada con otras especies más probable. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales. Los dos tipos tienen distintas ventajas y desventajas y se diferencian según la forma en la que se sintetizan. los anticuerpos reconocen una secuencia de aminoácidos pequeña (epítopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de la proteína en condiciones desnaturalizantes y reductoras. Los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir del suero del animal. comúnmente conejo. Más corto Anticuerpos Primarios: Monoclonal vs Policlonal. Anticuerpos Monoclonales Reconocimiento epitopo y sensibilidad  Reconocimiento de un único epítopo  Menos sensibilidad debido a que sólo un anticuerpo se une a cada proteína Anticuerpos Policlonales  Reconocimiento múltiples epítopos en una proteína  Más sensible debido a los multiples lugares de unión de anticuerpo en cada proteína. Hibridación del Anticuerpo. para provocar una respuesta inmune.reMenor coste quiere personal capacitado y equipamiento especializado. Los hibridomas con secreción más estable se seleccionan y pueden ser cultivados indefinidamente. burro u oveja y son finalmente purificados y probados. el cual se analiza y determina la afinidad al antígeno. la membrana se incuba con el anticuerpo primario.  Reactividad cruzada más probable. El primer paso en la producción de ambos anticuerpos. las células que sintetizan anticuerpos se aíslan del bazo del animal y se fusionan con células del mieloma. reconocer al antígeno en condiciones de desnaturalización/reducción de la proteína. Algunas características de los anticuerpos monoclonales y policlonales se describen en la Tabla 8. Los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epítopos del antígeno y en cambio los monoclonales reconocen un único epítopo de la proteína. Los lotes de un mismo hibridoma son muy estables.  Potencial para reconocer otras proteínas que contengan el epítopo. es la inyección de un antígeno en un animal.  Bueno para proteínas poco abundantes.

…). 500 µl Anticuerpo Secundario conjugado APC cabra-anti-conejo. se procede a la eliminación del excedente mediante tampones de lavado (TBS. Durante la incubación. el segundo Ac debe ser anti-conejo. ya que los anticuerpos específicos para sub-clases se utilian mayoritariamente. Si se utiliza acida sódica como conservante. Para anticuerpos monoclonales se debe considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG. deber ser producido en otra especie distinta a conejo. 500 µl Después de la incubación con el anticuerpo primario. 50 µl IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo. Un menor volumen puede utilizarse si la membrana se sella dentro de una bolsa e incuba en un agitador orbital. la disolución con el anticuerpo. e incubar en un agitador de vaivén. La afinidad del anticuerpo. PBS.  Página 14 . la abundancia de la proteína en la muestra y la sensibilidad del sistema de detección afectarán a la cantidad de anticuerpo a utilizar. TBST o en un tampón de disolución de anticuerpo comercial. pero a menudo la concentración óptima de anticuerpo debe determinarse empíricamente. IgD. A continuación se describen las consideraciones a tener en cuenta a la hora de la elección de un anticuerpo secundario:  Las especie del primer Ac dicta la elección del Ac secundario. IgA. IgE) y posiblemente la subclase (IgG1. En métodos de detección indirectos (sección 6). o sea. 250 µl IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón. 250 µl Anticuerpo Secundario conjugado HRP cabra-anti-ratón. También es posible una incubación a 4ºC durante toda la noche. es necesario un anticuerpo secundario apropiado.  Generalmente.Hibridación Anticuerpos Incubación de los anticuerpos El anticuerpo primario se diluye en tampón de bloqueo. IgG2a. la membrana debe someterse a agitación suave y sumergida en la disolución. debe ser totalmente lavada de la membrana. TBST o PBST). ya que puede eliminar la actividad de la peroxidasa e interferir en los métodos de detección. puede reutilizarse. Un anticuerpo con amplia especificidad inmunoglobulínica debería ser suficiente. El fabricante puede recomendar una cantidad inicial. 50 µl IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón.  Información para pedidos R-05051-050 R-05051-250 R-05052-050 R-05051-250 R-05071-500 R-05072-500 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo. En algunos casos.  Nota: Advansta ofrece una línea completa de anticuerpos secundarios marcados para detección mediante quimioluminscencia o fluorecencia. Si el primer Ac es de conejo. un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente suele ser suficiente. en experimentos de doble etiquetado u otras aplicaciones. IgM.

13x18 cm. Inconvenientes Nota: LucentBlueTM es una película que ha sido optimizada para Información para pedidos L07014-100 L07013-100 Película Rayos X LucentBlueTM .  Versátil . Detección directa e indirecta de proteínas Tabla 9. 100 uds Película Rayos X LucentBlueTM . Página 15 .ilustra los métodos de detección directos e indirectos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e inconvenientes de los dos métodos. Quimioluminiscencia. Colorimetría. Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan comúnmente anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP). que puede ser detectada mediante la exposición de la membrana a una película de rayos X o captada de forma digital utilizando una cámara CCD. Detección. Los métodos directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable. Ventajas e Inconvenientes de los métodos de detección Indirecto Ventajas Directo  Amplificación de  Menos pasos. la intensidad de la señal puede variar con la incubación o el tiempo de exposición. Westernbright Quantum y WesternBright Sirius. fácil de documentar.  Puede ser más costoso. 1. Lo métodos indirectos utilizan dos anticuerpos. La figura 11. es el anticuerpo secundario el que está conjugado con un marcaje detectable. como un enzima.  La inmunorreactividad del Anticuerpo puede estar afectada por el marcaje. En la detección indirecta.Análisis de Proteínas 6. se pueden hacer multiples exposiciones en películas de rayos X.  Mayor posibilidad de unión no inespecífica. Los métodos más comúnmente utilizados para detectar proteínas son: 1.el mismo Ac secundario puede utilizarse para diversos anticuerpos de la misma especie. la membrana puede tratarse para re-utilizarse. semicuantitativa . Métodos de detección. La reacción entre el encima y el substrato produce luz.porque se basa en una reacción enzimática. un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer anticuerpo. cada uno con sus ventajas e inconvenientes. la película tiene un rango dinámico limitado. sólo un color de reacción) Figura 11 . 20x25 cm. señal debido a la  Menos posibilidaunión de múltides de unión no ples Ac secundaespecífica. rios a cada Ac primario. 100 uds la detección de señales de quimioluminiscencia en experimentos realizados con los substratos WesternBright HRP. Fluorescencia y 3. Quimioluminiscencia. biotina o molécula fluorescente. Inconvenientes: requiere una habitación oscura (película rayos X) o sistemas de imagen caros. La detección de la proteína se puede hacer mediante métodos directos o indirectos.  Más pasos. no son posibles detecciones multiplex (detección de mas de una proteína. Ventajas: muy sensible. incluyedo WesternBrightTM ECL. Los anticuerpos se pueden marcar mediante kits disponibles en le mercado u obtenerlos ya marcados. 2.

no es tan sensible como la quimioluminiscencia (puede no ser apropiado para proteínas poco abundantes). El enzima convierte el colorante en un producto insoluble que es visible en la membrana. Fluorescencia. es ideal para comparar la proteína de interés con un control de carga. que cuando es ―excitado‖ emite luz. de dos proteínas en una sola membrana. pueden usarse Ac primarios marcados (para proteínas abundantes) y eliminar pasos. no requiere cámara oscura. Nota: WesternBright TM MCF permite la detección. Las membranas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en protocolos de lavados para reutilización. El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo. el color se desvanece con el tiempo. La intensidad de la tinción puede ser medida por espectrofotometría o por un densitómetro. amplio rango dinámico. Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento pueden ser costosos. Información para pedidos K-12021-010 WesternBrightTM fluorescent Western blotting kit Nota: Advansta suministra una línea completa de reactivos de detección de quimioluminiscencia optimizados para los diferenentes métodos. Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incrementarse utilizando el sistema streptavidina/ biotina). se detecta mediante un dispositivo capaz de medir la fluorescencia o mediante una cámara CCD provista con los filtros de longitud de onda apropiada. aporta datas cuantificables. no se requiere el uso de una cámara oscura. mediante la detección fluorescente multicolor. Este procedimiento puede conservar las muestras. Inconvenientes: no es tan sensible como los otros dos métodos. las membranas se pueden documentar fácilmente mediante fotografía. Re-utilización de la membrana Después de captar la imagen. La imagen se digitaliza para su análisis. Información para pedidos K-12042-D10 K-12042-D10 K-12045-D20 K-12042-D10 WesternBrightTM Quantum Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) WesternBrightTM Sirius Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) WesternBrightTM ECL Western Blotting HRP Substrate (para 2000 cm2 de membrana) WesternBrightTM ECL Spray Página 16 . Ventajas: sencilla de realizar. Colorimetría. Con la detección multiplex de fluorescencia. Perfecto para aquellos experimentos en los que se necesite comparar la proteína de interés con un control de carga. pero consume mucho tiempo. La luz emitida. se pueden detectar múltiples proteínas de forma simultanea. fácil documentación de resultados. apto para ensayos multiplex con múltiples colorantes. 3. concentración de muestra y tipos experimentales. Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado previamente a un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina).Detección 2. La cantidad de colorante convertido es proporcional al cantidad en la muestra. la membrana puede ser tratada para volver a ser utilizada para la detección de otra proteína. o diferentes isoformas de la proteína.

Problemas en la electroforesis E. 9) Bandas Difusas (ver 13) El gel corre demasiado rápido o demasiado lento (ver 20. Ruido de fondo excesivo Preparación Muestra (ver 1) La proteína es menor de lo esperado (ver 7) Bandas Incompletas (ver 12) El gel polimeriza demasiado rápido o demasiado lento (ver 17.21) Lavado inapropiado (ver 25) Unión ineficiente del Anticuerpo (ver 3. Solución de Problemas Solución de problemas con Western Blot A.19) Bloqueo Insuficiente (ver 24) Transferencia Inadecuada (ver 2) La proteína es mayor a lo esperado (ver 8. No se puede ver la proteína de interés B.18.Análisis de Proteínas 7. Bandas artefactuales D. 6) Frente corre curvado ―smiling‖ (ver 22) Elección de Membrana (ver 27) Bandas distorsionadas (ver 16) Frente corre inclinado (ver 23) Unión no específica del Anticuerpo (ver 28) Revelado de la película (ver 29) Página 17 . Tamaño incorrecto de la banda C. 4) Rayas Verticales (ver 14) Bandas Múltiples (ver 10) Distorsión Lateral (ver 15) Las bandas aparecen muy altas o muy bajas en el gel (ver 11) Contaminación Reactivos (ver 26) Problemas con los reactivos (ver 5.

incluir control positivo en el gel Cargar más cantidad de proteína total en el gel.Revisar el protocolo/disminuir metanol rrectamente/demasiado metanol en el tampón Proteínas de mayor tamaño necesitan mas tiempo/voltaje Contacto insuficiente entre el gel y la membrana Repetir con un tiempo mayor/mayor voltaje Revisar la almohadilla de fibra. juntar múltiples muestras Usar inhibidores de proteasa en le tampón de lisis Tampón de transferencia preparado inco. Proteína más pequeña de lo esperado Mezclar conjugado + substrato en un tubo.Reactivos viejos o inestables tivo Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sódica 6. acetilación. etc…) Cambio de la expresión de la proteína en la línea celular Utilizar cultivos anteriores. Reactivo de detección (ECL) B. Proteína más larga de lo esperado Agregado de proteínas . concentrar utilizando Afyon.…) 4. Congelación/descongelación de la muestra Proteína variante (Splicing) Solución Uso de inhibidores de proteasa/muestras frescas Consultar literatura/utilizar controles apropiados Consultar literatura para encontrar aditivos que puedan eliminar grupos químicos 8.: Leche. Conjugado/Substrato Inac. incluir un control positivo 9. Problema 1. Unión ineficiente del Anticuerpo primario Baja afinidad del anticuerpo por la proteí. sustituir si es muy delgada 3. disminuir do la concentración de sales el tampón de lavado Antígeno enmascarado por el agente bloqueante (ej. fosforilación. pulso intactos de centrífuga previo a la carga de la muestra Página 18 .Solución de Problemas A.puentes disulfuro Uso de DTT en tampón de muestra. o luminiscencia en oscuridad . Preparación Muestra Causa(s) Extracción ineficiente Baja expresión de la proteína en el tejido o las células La proteína se ha degradado durante la extracción 2. Proteína más larga de lo esperado y/o bandas múltiples Proteínas modificadas de forma natural (glicosilación.: BSA.Incrementar la concentración del Antina o el anticuerpo es antiguo/débil cuerpo. comprar un anticuerpo nuevo y almacenarlo de forma apropiada El Anticuerpo tiene reactividad cruzada débil con las especies de interés Probar con un Anticuerpo primario de diferente origen El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava. Unión ineficiente del Anticuerpo secundario Elección de especies errónea Utilizar un agente de bloqueo alternativo (ej. Transferencia indadecuada Solución Intentar métodos alternativos.conseguir un nuevo reactivo si no hay señal Evitar utilizar disoluciones conteniendo este agente conservante La disolución es antigua o está almacena.Comprar reactivo nuevo da de forma inapropiada Causa (s) Proteólisis. Problema 7.…) Usar Anticuerpos dirigidos contra la especie del Anticuerpo primario Concentración insuficiente del Anticuerpo Aumentar concentración o comprar uno o Anticuerpo antiguo Anticuerpo nuevo 5.Usar menor numero de lavados.

Bandas difusas Migración lenta Las muestras no se han calentado correctamente El SDS del tampón es antiguo 14. hacer rodar por encima del paquete gel/membrana para forzar la salida de las burbujas Incrementar voltaje. disminuir para proteínas de gran tamaño Solución Usando una pipeta. Bandas Incompletas Causa(s) Burbujas entre el gel y la membrana 13. Problema 12. asegurarse de la correcta preparación del tampón Asegurarse que las muestras se han incubado durante 2 min a 90ºC antes de cargarlas en el gel Preparar SDS nuevo para le tampón de muestra 11. Rayas en los carriles Alta concentración de sales en la muestra Disminuir la concentración de sal en el tampón de muestra Muestra muy concentrada o insuficiente SDS Incrementar concentración/usar más SDS Minimizar el tiempo de carga 15. La proteína aparece muy Porcentaje erróneo/no óptimo del gel alta o muy baja en la membrana C. Distorsión lateral de las bandas 16. El gel no polimeriza Causa (s) Fallo al añadir el TEMED y AP La disolución AP es estable durante dos o tres días a 4ºC El oxígeno inhibe la polimerización 18. Problema (continuación) 10. apretar hasta encontrar primera resistencia Usar guantes en la preparación de los geles Uso de Etanol y H2O desionizada en la limpieza de los cristales Burbujas introducidas en el gel por el dispositivo de llenado (jeringa o pipeta) Burbujas de aire atrapadas por el peine No expulsar totalmente el volumen de la mezcla del gel Insertar el peine en ángulo y antes que se polimerice el gel Solución Repetir con TEMED y AP Preparar AP fresco Aplicar isopropanol antes de verter el gel de apilamiento (stacking gel) Incrementar la cantidad de TEMED/AP Preparar disolución fresca de AP D.Análisis de Proteínas B. Bandas Extras Causa(s) Solución Unión no específica del Anticuerpo prima. Distorsión de las bandas Difusión de la muestra en los pocillos durante la carga Fallo en la completa polimerización de los Incrementar TEMED/AP pocillos Presión aplicada excesiva a la hora de montar el gel Burbujas en el gel debido al uso de cristales sucios No apretar en exceso los tornillos del sistema. intentar un rio o secundario experimento de bloqueo de péptido (eliminará la proteína de interés) Incrementar el porcentaje para proteínas de pequeño tamaño.Disminuir concentraciones. El gel polimeriza muy lento TEMED/AP Insuficiente La disolución de AP ha perdido su actividad Página 19 . Problema 17.

refrigerar Aguantar el gel en ángulo. colocar una esquina en el tanque inferior del sistema de electroforesis. Bloqueo insuficiente Causa(s) La presencia de Biotina en la leche es incompatible con el uso de Estreptavidina. manteniendo la relación entre ambos Revisar protocolo. Contaminación de los reactivos Crecimiento bacteriano o fúngico en los tampones Revisar la turbidez de los tampones. El polimeriza demasiado rápido 20. Elección de tipo de mem.Solución de Problemas D. Condiciones de lavado inapropiadas Número insuficiente de lavados Concentración insuficiente de detergente Incrementar la concentración de detergente o usar detergentes más fuertes (SDS. Sobreexposición de la imagen El tiempo excesivo de exposición a la pelí. intentar con Anticuerpo monoclonal o purificado por afinidad Disminuir la cantidad de proteína 27. Tiempo de carrera inusualmente largo Causa(s) Cantidad excesiva de TEMED/AP Buffer de electroforesis demasiado concentrado Voltaje insuficiente 21. Problema 24.Las membranas PVDF pueden tener más brana ruido de fondo que las de Nitrocelulosa Algunas membranas tienen alta autofluorescencia Membrana seca 28. algún Anticuerpo primario puede requerir un bloqueante proteico La disolución está demasiado diluida Tiempo de bloqueo muy corto Algunos detergentes no son efectivos a bajas temperaturas Incluir BSA o leche en la disolución AdvanBlock-PF utilizada en la dilución del Anticuerpo primario Incrementar con un 5% la disolución Incrementar el tiempo de incubación Incubar a temperatura ambiente en vez de toda la noche a 4ºC Incrementar el número de lavados o la duración de cada uno de ellos 25. o la leche contiene el antígeno de interés Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright MCF. Unión no específica del Anticuerpo primario o secundario Concentración muy alta del Anticuerpo o no purificado por afinidad Mucha cantidad de proteína en el gel 29. lentamente volver a posición vertical Solución Usar BSA E. diluir el tampón en caso necesario Incrementar voltaje Revisar el protocolo. NP-40) 26.Reducir los tiempos de exposición. Frente curvado (smiling) Tampón demasiado diluido Migración demasiado rápida Generación de calor 23. reemplazar tampón en caso necesario Disminuir voltaje Disminuir voltaje. Tiempo de carrera inusualmente corto 22. preparar nuevos Elegir membranas de Nitrocelulosa Utilizar únicamente membranas PVDF con baja autofluorescencia con Western Blots fluorescentes Estar seguro que la membrana esta húmeda durante todo el proceso Disminuir la concentración de Anticuerpo. Problema (continuación) 19. si no es cula o al CCD posible incrementar la dilución de los Anticuerpos o cargar menor cantidad de muestra Página 20 . Frente inclinado Burbuja atrapada entre los cristales en la parte inferior del gel Solución Reducir la cantidad de TEMED/AP.

7 10 pmol o 6x1012 moléculas 6. L) UCU UCC UCA UCG C Serina (Ser. G) Tabla 11. M) Valina (Val. P) Isoleucina (Ile. A) Glicina (Gly. Herramientas y Referencias Técnicas g de Soluto Molaridad de una disolución = [Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolución) Tabla 10.Análisis de Proteínas 8. Aspártico (Asp. I) Metionina (Met.000 1 µg 100 pmol o 6x1013 moléculas 20 pmol o 1. S) Arginina (Arg.17 1. R) Primera posición C Leucina (Leu.4 0.35 1. F) Leucina (Leu. L) Prolina (Pro.2 1. N) Lisina (Lys.2x1013 moléculas 1 nmol 10 µg 50 µg 100 µg 150 µg Tabla 12.7 pmol o 4x1012 moléculas Página 21 . T) AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG Histidina (His.5 3. D) A. Glutámico (Glu.000 100. Código genético y abreviaciones de los aminoácidos Segunda Posición U UUU UUC U UUA UUG Fenilalanina (Phe. C) STOP Triptófano (Trp. E) CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG G Cisteina (Cys. Q) Asparagina (Asn.3 0.000 20. S) UAU UAC UAA UAG A Tirosina (Tyr. K) A. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale Proteina IgG IgM IgA Proteina A Avidina Estreptavidina Albumina suero bovino A280 Uds por 1 mg&ml 1. V) Serina (Ser. T) STOP UGU UGC UGA UGG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG CAU CAC CAA CAG Treonina (Thr.000 150. R) A G GCU GCC GCA GCG Alanina (Ala. W) Arginina (Arg. Conversión entre masa y moles de proteína Peso molecular (Da) 10. H) Glutamina (Gln.

2 Copyright © 2011 Advansta.730 años 60 días 14.. 1.2 114. Masa molecular media de los aminoácidos Códigos Aminoácidos A C D E Tabla 14. service marks and tradenames appearing in this brochure a re the property of their respective owners.4 días 12.2 128. unidad de masa molecular mol molaridad.2 131.12 128.4 años R S T V W Y Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Peo Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Masa molecular media 71. Abreviaciones ds ss bp kb Da mol M doble cadena ( como en dsDNA) cadena sencilla (como en ssDNA) pares de base kilobase.1 115.2 57.08 101. Adva nWash™.Herramientas y Referencias Tabla 13. AdvanBlock™. Vida media de los Radioisótopos más habituales Radioisótopo Carbono-14 (14C) Iodo-125 (125I) Fósforo-32 (32P) Azufre-35 (35S) Tritio (3H) Vida media 5.3 días 87. All rights reserved.05 137.08 103.07 186.1 99. LucentBlue™ and WesternBright™ are trademarks of the Company.2 87.1 91. moles de soluto por litro de disolución F G H I K L M N P Q Tabla 15.1 129. Afyon™.1 147.1 113. The Advansta logo is a registered trademark of the Company.2 163. All other trademarks. Página 22 . Prefijos métricos M K m µ mega Kilo mili micro 106 103 10-3 10-6 n K f a nano pico femto atto 10-9 10-12 10-15 10-18 Tabla 16. Avant™.1 156.000 bases o pares de base Dalton.2 113.

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