Análisis de Proteínas

Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección

advansta

Análisis de Proteínas

Análisis de Proteínas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas. Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la proteína de interés. Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación, y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles de proteína entre muestras. Esta guía de laboratorio describe los pasos involucrados en la realización de un Western blot, incluyendo la preparación de muestras, la separación de proteínas, la transferencia y la detección.

Índice de Contenidos
1. Western Blot: Visión General 2. Preparación de las muestras 3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida 4. Transferencia Electroforética 5. Hibridación Anticuerpos 6. Detección 7. Solución de Problemas 8. Herramientas y Referencias Técnicas

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1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4. Página 1

bisacrilamida. Electroforesis en Acrilamida c. El dodecilsulfato de sodio (SDS) añadido al gel se une a las proteínas y confiere. Así. Western Blot: Visión General Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso. Electroforesis en gel de Acrilamida Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño mediante electroforesis. o bacterias. de forma proporcional a la masa de cada proteína. Los materiales de partida incluyen planta. Procesos adicionales logran el fraccionamiento subcelular Se usan tampones conteniendo detergentes para la lisis celular Figura 1. Se prepara un gel de acrilamida. Preparación de la muestra Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química. tejidos animales. La disrupción mecánica con un homogenizador disgrega los tejidos. a. células cultivadas. una carga negativa a cada una de ellas. Se aplica voltaje en el tanque de transferencia y las proteínas migran desde el gel a la membrana. Se añade un colorante de carga. dónde quedan inmovilizadas.Western Blot: Visión General 1. Figura 2. Un cartucho aplica presión y mantiene un estrecho contacto entre el gel y la membrana. Transferencia electroforética a una membrana Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana. la migración de la muestra se puede monitorizar. Transferencia de Proteínas a la Membrana Página 2 . Figura 3. Preparación de muestras b. Se utiliza una pipeta para cargar las muestras en los pocillos del gel Una fuente de alimentación proporciona el voltaje El gel se coloca dentro de un tanque de electroforesis lleno de tampón.. que conducirá la corriente. levadura. El gel y la membrana se coloca entre papel de filtro y almohadillas de esponja. La proteínas con carga negativa migran desde el ánodo.

Hibridación de Anticuerpo Figura 5. Detección quimioluminiscente de las bandas de proteínas Página 3 . Figura 4. tejidos animales. o de forma digital. Los materiales de partida incluyen tejidos vegetales. levadura. se utiliza un anticuerpo secundario conjugado con el enzima peroxidasa (HRP). o bacterias. Detección de las Bandas Después de un lavado de la membrana para eliminar el anticuerpo no unido. mediante un sistema de captación de imágenes.Análisis de Proteínas a. A continuación se incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana. se procede a detectar la localización de la banda en la membrana. Hibridación del Anticuerpo La membrana con las proteínas inmovilizadas debe tratarse para bloquear las zonas con ausencia de proteínas y así evitar la unión no específica de los anticuerpos. la adición de un sustrato de HRP provoca una reacción enzimática que da como resultado final la emisión de luz. e. La detección de fluorescencia se basa en la captación de luz emitid por sustancias fluoróforas conjugadas con el anticuerpo secundario. células en cultivo. Tras varios lavados de la membrana. se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma específica al anticuerpo primario. proporcionando una forma de detección. Para la detección de quimioluminiscencia. Dicha luz puede ser detectada en una película de rayos X.

Tejido animal o o riza utilizando un vegetal mortero y una almirez refrigerados La ruptura celular se Levaduras produce por agitación de las perlas de vidrio Pulverización en Nitrógeno líquido Perlas de vidrio Tabla 2. Soluciones Tampón y detergentes. las proteínas se extraen mediante procesos químicos y/o mecánicos. no iónicos si no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga negativa y positiva y la carga neta es 0. dentro de orgánulos celulares como el núcleo y las mitocondrias. Preparación de la muestra Una adecuada preparación de la muestra es esencial para tener éxito en un ensayo de Western Blot. Tipo de muestra Gran cantidad de tejido Células tisulares. unida a la membrana.NP-40. Métodos físicos para la dirupción de muestras Método Licuadora Descripción La muestra se tritura mediante cuchillas rotatorias Tubo de vidrio con pistón ajustado maja las células por acción de corte. frecuentemente.Preparación de la muestra 2. Las células en cultivo. de la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que requiera el anticuerpo para reconocer el epítopo proteico. A menudo. sonda para romper las membranas celulares La muestra se pulve. Tabla 1. RIPA drial o nuclear (multiples detergentes). En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampón y detergentes. se suelen lisar utilizando una solución tampón con detergente y sin la aplicación de métodos mecánicos. Deoxicolatos) Puede combinarse con métodos mecánicos. depende en parte de la localización.. El método elegido dependerá del tipo de muestra de partida. La estructura química de los detergentes permite romper las membranas celulares y solubilizar las proteínas. RIPA. Triton X-100 Lisado total de células NP-40. se requiere el uso de un proceso mecánico para la disrupción de la compleja matriz celular. tejidos. mediante el uso de solución tampón que contiene detergentes. Estas substancias tienen una parte polar y otra no polar y se pueden clasificar según las características del grupo polar: iónicos si el grupo polar tiene carga positiva o negativa. que va dirigida a enriquecer la proteína de interés dentro del extracto final.. afectando así a los procesos de fraccionamiento subcelular. dentro de la célula.Las proteínas citoplasmáticas se pueden unir a las proteínas del citoesqueleto. En la tabla 1 se resumen los métodos mecánicos que habitualmente se utilizan en la extracción de proteínas para inmunotransferencia. según el tipo de proteína y localización subcelular. útil para protocolos de enriquecimiento de proteínas mitocondriales o nucleares Homogenizador Dounce Homogenizador de ultrasonidos Ondas de sonido Células. etc. La elección de la substancia detergente. tales como el homogenizador Dounce Los detergentes Triton son suaves y no iónicos Para antígenos con niveles bajos de expresión pueden ser necesarios procesos de enriquecimiento Citoplasmático (unida a citoesqueleto) Tris-Triton Membrana mitocon. Disrupción mecánica que suele preceder a un proceso químico de lisis celular. bacemitidas por una terias. citoplasmática. En la mayoría de ensayos. según el tipo de proteína de interés y la localización subcelular Tipo/Localización Proteína de interés Nativa (no desnaturalizada) Citoplasmáticos (soluble) Detergente o Solución Tampón Detergente suave no iónico Tris-HCl TComentarios Evitar detergentes desnaturalizantes (SDS. Triton X-100 Página 4 . más utilizados habitualmente. de la proteína de interés. en muestras tisulares de plantas y animales.

Tabla 3. En la tabla 3 se muestran los inhibidores deproteasa y fosfatasa de uso más habitual. durate la preparación de la muestra.1—1 mM Proteasas de Serina Mg++/Mn++ Metaloproteasas Ca++ Metaloproteasas Proteasas de Serinas. Cisteinas Proteasas de Aspartico Proteasas de Serina 3. La siguiente estrategia ayuda a evitar la degradación de proteínas:  Evitar excesivos ciclos de congelación/ descongelación. Información para pedidos K-02101-025 Afyon ™ SDS-PAGE ssmple preparation kit Página 5 . es importante determinar la concentración de proteínas por las siguientes razones: 1. Asegurar la carga de la cantidad correcta de proteínas en el gel. En primer lugar. La cantidad de proteína óptima a cargar dependerá de la prevalencia de la proteína de interés y de la sensibilidad del anticuerpo primario.  Añadir inhibidores de la proteasa en el tampón de lisis. Por ejemplo. en particular en estudios de fosforilación. evitando la necesidad de determinar la concentración de proteína. Además de inhibir la actividad de la proteasa. Inhibidores Proteasas Aprotinina EDTA EGTA Leupeptin Pepstatina A PMSF Concentración en Enzimas diana el Tampón de lisis 1-2 µg/ml 1-10 mM 1-10 mM 1-2 µg/ml 1µg/ml (17-170 µg/ml) O. Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la extracción de proteínas. para determinar la carga de proteína apropiada. se revisten con carga negativa. es importante evitar. se liberan enzimas proteasas que pueden degradar la proteína de interés. Cisteinas Proteasas de Aspartico Proteasas de Serina Inhibidores Fosfatasas  . mediante la acción del detergente Dodecilsulfato Sódico (SDS). Medición de proteína total Previamente a la electroforesis.1—1 mM Concentración en el Tampón de lisis 1 mM 1-10 mM 1-10 mM 1-2 µg/ml 1µg/ml (17-170 µg/ml) O. se requiere hacer experimentos preliminares con cantidades seriadas de proteínas. para 5 µg de proteína se utilizan 20 µl de resina Afyon. Por tanto. A menudo.  Trabajar rápido y mantener las muestras en frío durante todo el proceso. Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un mayor ruido de fondo y unión no específica de los anticuerpos. puede ser interesante reducir la actividad de la fosfatasa alcalina. las proteínas.Glicerofosfato EDTA EGTA Enzimas diana Fosfatasas Serina/ Treonina Mg++/Mn++ Metaloproteasas Ca++ Metaloproteasas Proteasas de Serinas.Análisis de Proteínas Con la rotura celular. Leupeptin Pepstatina A PMSF Nota: con el kit Afyon ™ SDS-PAGE de preparación de muestra. Electroforesis en Acrilamida Las proteínas del extracto se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). así Las proteínas. se pueden separar en el gel según su tamaño (SDSPAGE). se puede controlar la cantidad de carga de la proteína mediante la cantidad de resina utilizada. cualquier actividad proteásica.

se debe realizar una curva estándar en cada ensayo. se pueden comparar los niveles relativos de la proteína de interés. En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva estándar.  Los reactivos del tampón de lisis . Si la cantidad de proteína cargada por carril es la misma. Se representa la absorvancia de las soluciones estándar que contienen la proteína conocida (línea roja). El estándar utilizado con mayor frecuencia es la albúmina de suero bovino (BSA). El tiempo de da en literatura ensayo puede ser mayor que en otros métodos  No es práctico para grupos grandes de muestras  Se pueden formar precipitados Hay muchos kits de determinación de proteínas disponibles comercialmente. Con el fin de determinar la concentración de proteínas totales en una muestra. Página 6 . el gentes  ComercialBCA se une a los iones de mente dispoCu1+ y forman nible en forun producto mato comcoloreado que patible con se puede meagentes dir espectroforeductores.Electroforesis en Acrilamida 2. Interferencia con agentes quelantes o reductores del Cobre BCA Reducción de  Compatible iones de Cu2+ con la mayo mediante interación con las ría de deterproteínas. lector de placas. de proteína pura. Ejemplo de la curva estándar de un ensayo de proteínas. Los más habituales son los métodos Lowry. metricamente  Menos varia(reacción de ción proteíBiuret) na-proteína que en el método Bradford.  La cantidad de muestra disponible. Descripción del método Existen diversos métodos para medir la proteína total de una muestra. Elección de un ensayo de proteínas Absorvancia Tabla 4. Bradford y Ácido Bincocinico (BCA) (Tabla 4).revisar el protocolo del fabricante para identificar sustancias interferentes. Esto se logra con la realización de un ensayo de concentración crecientes. La concentración de la proteína de interés se puede determinar extrapolando la absorvancia obtenida en la curva patrón o estándar (línea verde de puntos). Un experimento de Western Blot cuantitativo es útil para estudio de cambios de expresión de proteínas o de modificaciones proteicas como la fosforilación. Proteína (mg) Figura 6.  La facilidad/rapidez del ensayo. Los valores de absorvancia se trazan en función del contenido conocido de la proteína estándar utilizada. La elección depende de muchos factores:  El equipo de lectura disponible en el laboratorio (espectrofotómetro. Similar al BCA (reacción de Biuret) Lowry Muy bien cita.  Rango lineal pequeño. Realización de Western Blots cuantitativos o semi-cuantitativos. Métodos físicos para la dirupción de muestras Ensayo Bradford Descripción El colorante azul de Coomasie se une a las proteínas y sufre un cambio de absorvancia Ventajas La realización de los ensayos son generalmente rápidos y sencillos Inconvenientes  Interferencia de SDS o de otros detergentes a altas concentraciones . aunque se puede utilizar cualquier proteína producida en el laboratorio o disponible comercialmente. etc…). Estos ensayos colorimétricos se basan en las reacciones que se producen entre las proteínas de la muestra y los reactivos de detección. El contenido de la proteína de interés en la muestra (línea verde) se puede determinar mediante la extrapolación de la absorvancia obtenida a la cantidad o concentración de proteína correspondiente.

En condiciones no desnaturalizantes/no reductoras. Información para pedidos R– 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x) R-03019-B10 Reducing protein sample loading buffer (2x) Tampón Tris Pepstatina A Beta Mercaptoetanol o DTT Página 7 . En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanismo de desnaturalización del SDS. dependiendo de las condiciones deseadas.  Migra por delante de las proteínas. de modo que se puede hacer el seguimiento del movimiento de las muestras en el gel. para asegurar que la desnaturalización/ reducción es total. Tabla 5. La proteína se encuentra en su estado conformacional. Mantiene el pH adecuado Azul de Bromofenol SDS Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y garantizan que las muestras se separan de forma reproducible. Componentes del tampón de carga. beta mercaptoetanol o ditiotreitol. manteniendo su carga intrínseca SDS El SDS se une a la proteína y da lugar a una linearización y a una uniformidad de la carga negativa de ésta. Los ingredientes típicos de un tampón de carga para detectar proteínas bajo condiciones desnaturalizantes/reductoras se describen en la Tabla 5. Figura 7. combinándolas con un tampón de carga y cargar la muestra en un gel de electroforesis. Reactivo Glicero.  Evita las interacciones hidrofóbicas y rompe los enlaces de hidrógeno. esta incubación no es necesaria. carril a carril y gel a gel. teniendo cuidado en evitar ciclos repetitivos de congelación/ descongelación. se pueden conservar congeladas.Análisis de Proteínas Tampón de carga de muestras Una vez se tienen las muestras de proteína. Alternativamente. No se utilizarán ni SDS. Molécula colorante pequeña:  Da color a la muestra para ayudar a la carga. las muestras se someten a una incubación a 95ºC durante 5-10 minutos. Propósito Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar la muestra la fondo del pocillo y evitar que se extienda a los pocillos adyacentes. Advansta dispone de tampones de carga reductores y no reductores. Previamente a la carga del gel. Detergente desnaturalizante  Cola hidrofóbica que rodea la esqueleto peptídico. Agentes reductores  Evita la oxidación de cisteínas. aportando carga negativa de forma proporcional al tamaño de la proteína.  Completan la linearización de la proteína al romper los puentes disulfuro.  Unión a la proteína de forma regular. si se necesitan condiciones no desnaturalizantes /no reductoras. Los componentes del tampón de carga varían.  Destruye la estructura secundaria/ terciaria y lineariza la proteína. Mecanismo de desnaturalización por SDS de las proteínas. se pueden utilizar inmediatamente.

 Tabla 6. Los geles de SDS-PAGE están disponibles comercialmente o se pueden elaborar en el propio laboratorio. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis de proteínas Reactivos Acrilamida Bisacrilamida SDS Propósito Moléculas que polimerizan para formar cadenas. También se procesarán más lentamente y requieren tiempos de transferencia mas largos que los geles más delgados El porcentaje del gel. en la electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en el tampón de electroforesis. pueden aceptar mayor volumen de carga. Debido a que el SDS iguala la carga en todas las proteínas. Los geles con mayor espesor. también conocida como PAGE nativo. Elección del grosor del gel y del tamaño de poro El tipo de muestra y el peso molecular de la proteína de interés dictan el espesor y tamaño de poro del gel.Electroforesis en Acrilamida Gel de Electroforesis Si se requieren condiciones naturales para que el anticuerpo pueda detectar el epítopo. Aumenta la generación de radicales libres por el persulfato de amonio. se realizan en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes. Tampón Tris Persulfato de Amonio TEMED Los espaciadores de gel (ver Figura 8) controlan el espesor del gel. Tabla 7.5 10 12 15 20 Rango Peso Molecular (kDa) 25-500 15-300 10-200 10-45 5-40    Página 8 . la tasa de migración viene determinada por su peso molecular. las proteínas cargadas negativamente. migran al electrodo positivo. (tabla 7). determina el tamaño del poro. El tamaño de poro determina la ratio de separación de las proteínas. Los geles pre-fabricados son muy prácticos pero debido al coste. Están disponibles en diversos tamaños. no son tan rentables como los elaborados por el usuario. según la cantidad de acrilamida y bisacrilamida. A más porcentaje menos tamaño de poro. En la tabla 6. las proteínas mantienen su estructura tridimensional y la migración en el gel depende de su masa: relación de carga de la proteína por encima de su tamaño. Bajo estas condiciones desnaturalizantes y de reducción. Porcentaje 7. la mayoría de ensayos Western Blot. se describen los componentes químicos de un gel de SDS-PAGE. Generación de radicales libres que catalizan la reacción de polimerización. En esta situación. Mantiene la linearidad y la uniformidad de carga de las proteínas según la electroforesis. cuando se someten a un campo eléctrico. Forman uniones con las cadenas de acrilamida para formar un entramado. Mantiene el pH adecuado. Rango de separación de proteínas según el porcentaje de acrilamida. Sin embargo. Las moléculas más pequeñas migran más rápidamente que aquellas con pesos moleculares mayores.

así como teñidos o incoloros. Marcadores de Peso Molecular. Colocar el peine en la parte superior del gel. Tras fijación de los lados.  1.  Para verificar si el anticuerpo primario se une a la proteína correcta. espaciadores lateral. los distintos reactivos se mezclan y se vierte en el molde. La expresión cuantitativa de la proteína de interés puede normalizarse con la del control de carga para cada muestra. Estos estudios demuestran que el anticuerpo utilizado se une de forma específica a la proteína de interés.Análisis de Proteínas Elaboración del gel Si el gel de acrilamida esta elaborado en el laboratorio. Similar a los ―housekeeping genes‖ en Biología Molecular. Figura 8. formado por el conjunto de dos cristales. Preparación del gel de electroforesis para la separación de proteínas. así los niveles de proteínas se pueden comparar de forma cuantitativa. 2. verter el gel resolutivo y esperar que el gel se polimerice. Diseño Experimental.      2. Los tipos de estándares y controles utilizados incluyen: 1. El péptido de bloqueo se mezcla con el anticuerpo primario antes de la incubación con la membrana y evita la uníón del anticuerpo a la proteína diana. son una muestra de la proteína de interés purificada. Controles Positivos. Se utilizan para verificar si la proteína de interés está dentro del rango de tamaño apropiado. Puede ser una línea celular que sobreexprese la proteína de interés. Para mejorar la nitidez de la banda el gel resolutivo se corona con una acrilamida de menor porcentaje (stacking gel). El gel está listo para cargar las muestras y la electroforesis. peines y un sistema de sujeción (Figura 8). Generalmente. Algunos tratamientos pueden alterar la expresión de estas proteínas ―housekeeping‖. Puede ser una muestra de tejido del que se conozca que expresa altos niveles de la proteína de interés. Controles de carga   Como norma general se utilizan proteínas con niveles de expresión constante para todas las muestras. 4. Péptidos de bloqueo   Algunos proveedores ofrecen péptidos de bloqueo para sus anticuerpos. Verter el ―stacking gel‖ y quitar el peine una vez el gel haya polimerizado. Se pueden utilizar otras especies como tejido de control si el anticuerpo tiene reactividad cruzada apropiada. Disponible en diversos intervalos de pesos moleculares. es importante diseñar el experimento incorporando los controles y estándares necesarios para la validación de los resultados. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre los cristales.     Página 9 . dónde la acrilamida se polimeriza en aproximadamente 30 minutos. Controles y Estándares Antes de la carga del gel. Por tanto no se detectará ninguna banda. Pueden estar marcadas por la detección por fluorescencia o quimioluminiscencia. Son una mezcla de proteínas purificadas de peso molecular conocido. espaciador inferior. si está disponible. 3. Se utiliza para verificar que la carga de proteína por carril es más o menos igual. Las versiones preteñidas se utilizan para controlar el progreso de la electroforesis y comprobar la eficacia de la posterior transferencia. Lavar los pocillos con ddH20.

La glicina.Electroforesis en Acrilamida Inicio de Electroforesis Las muestras se cargan en los pocillos del gel mediante una pipeta. la glicina.8 y ralentiza su movimiento. para así evitar sobrecargas que pueden dar lugar a la pérdida de muestra o derrames en pocillos adyacentes. Con la aplicación de un campo eléctrico. en el Stacking Gel. El tampón utilizado durante la electroforesis. Una vez finalizada la carga. Página 10 . Las proteínas se separan según su peso molecular por el   Figura 9. Los iones de cloruro avanzan por delante de la Gly. Glicina (conductor electricidad) y SDS (mantiene las proteínas cargadas negativamente).8) Gly Proteinas CL- Stacking Gel pH 6. Muestra (pH 6. del electrodo negativo. Concentración de bandas de proteínas por el flujo iónico en el sistema discontinuo de Laemmli.3. el gel se somete a un campo eléctrico generado por una fuente de alimentación. de forma apilada. se aleja del electrodo negativo. obliga a las proteínas a alejarse. los valores de pH de la capa de gel de apilamiento o concentración (Stacking Gel) y el gel de resolución (Resolving Gel) son diferentes. Normalmente se cargan de 20 a 40 µg de proteína total por carril.8 Tampón de Electroforesis (pH 8.3)    La glicina tiene carga negativa en el tampón de electroforesis a pH 8. aumenta su carga negativa y se mueve por delante de las proteínas. La técnica de electroforesis más habitualmente utilizada es la de Laemmli.8 Gly Proteinas Resolving Gel pH 8. el volumen que se puede cargar por pocillo. La figura 9 ilustra el flujo de iones durante la electroforesis. El progreso en el gel se monitoriza observando el frente coloreado por el colorante presente en el tampón de carga y la posición de los marcadores de tamaño siempre que estos estén teñidos. En este método. El aumento de la resistencia. Es importante conocer de antemano. La glicina empieza a perder su carga a pH 6. debido a un mayor pH del ―Resolving Gel‖. contiene Tris (mantiene el pH).

Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre -cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamaño de minigel. con el objetivo de reducir el ruido de fondo al utilizar métodos de detección de fluorescencia.22 µm 8x10 cm Página 11 . las diferencias en sus características puden influir a la hora de la elección. La membrana de nitrocelulosa tiene la ventajas de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol. resistencia la SDS y una mayor unión que la nitrocelulosa. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiempo y elimina la contaminación accidental de las membranas con guantes o tijeras contamindas. Los sistemas semisecos son más rápidos y requeiren menor cantidad de volumen de Tampón que los sistemas húmedos. Aunque ambas funcionan bien en experimentos de inmunotransferencia.45 µm 8x10 cm Membrana Nitrocelulosa 0. La figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la membrana en un transferencia semiseca o húmeda. sin embargo no son apropiados para transferencia de proteínas de gran tamaño (>70 kDa) y pueden causar. un mayor ruido de fondo. Previamente a la transferencia. un estrecho contacto entre el gel y la membrana. las proteínas se transfieren a una membrana. Típicamente. Transferencia a una Membrana Una vez la electroforesis del gel ha terminado. tanto el gel como la membrana se equilibran en una solución tampón pre-enfriada. Figura 8. La mayoría de los sistemas de transferencia utilizan la generación de un campo eléctrico para conducir a las proteínas desde el electrodo negativo al positivo. según el sistema de detección. Recientemente se han desarrollado. Los sistemas de transferencia están disponibles en formato semiseco o húmedo. membranas PVDF de baja autofluorescencia.Análisis de Proteínas 4. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las proteínas. SDS (opcional) y metanos (para membranas de nitrocelulosa). La membrana de PVDF. permitiendo así que la hibridación de un anticuerpo las pueda detectar. Glicina. Información para pedidos L-08001-010 L-08002-010 L-08003-010 Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm Membrana Nitrocelulosa 0. ofrece una mayor resistencai mecánica. el tampón de transferencia contiene Tris. para una transferencia efectiva de las proteínas. Ambos métodos requieren. Transferencia de proteínas a una membrana.

son soluciones a base de proteínas. Ajustar las condiciones de transferencia al tamaño de la proteína. La tinción con Coomassie puede usarse para la tinción del gel una vez realziada la transferencia y comprobar los residuos de proteína en el gel. Disminuir el voltaje o el tiempo si fuera necesario. WesternBright. Incrementar la cantidad de SDS y disminuir la concentración de Metanol pueden facilitar la transferencia de proteínas de gran tamaño. es la utilización de la leche descremada en polvo. 500 ml AdvanBlockTM-PF. Las proteínas y aceites de la piel pueden adherirse a la membrana y pueden dar lugar a manchas no deseadas en la membrana.que facilitan una rápida y fácil preparación Información para pedidos R-03024-D50 R-03023-D20 R-01038-020 R-01039-020 AdvanWashTM. Si los niveles del ruido de fondo son demasiados altos. se puede añadir también detergente Tween 20. un sistema de refrigeración o hacer la transferencia en una cámara fría. La aparición de marcadores de tamaño preteñidos en la membrana es indicación que se ha completado la transferencia. Las burbujas de aire entre el gel y la membrana pueden causar transferencia defectuosa y desigual. 200 ml AvantTM Buffer Pouches . La primera elección. No permitir un sobrecalentamiento durante la transferencia.. Es preferible. Reducir o eliminar el SDS o utilizar una membrana con un tamaño de poro menor puede ayudar a una mayor retención de la proteína.    El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampón Tris salino) o en PBS (Tampón Fosfato salino). El colorante Ponceau S puede utilizarse para teñir la membrana y asegurarse de la eficacia de la transferencia. TBS. como la leche descremada en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA). Las proteínas más pequeñas se transferirán más rápidamente y pueden atravesar la membrana. puede que no sea la mejor elección cuando se van a utilizar anticuerpos fosfoespecíficos o en métodos de detección de biotina. para estas y otras situaciones. se pueden seleccionar otras soluciones de bloqueo alternativas.   Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo y de lavado para su línea de reactivos de detección. cuando se inicia un nuevo protocolo.PBS AvantTM Buffer Pouches . Es aconsejable utilizar tampón frio.Electroforesis en Acrilamida A continuación se describen algunas sugerencias para la consecución exitosa de una transferencia:  Bloqueo El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incubando con una solución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo. ya que es más rentable que el BSA. Se pueden eliminar haciendo rodar suavemente una pipeta Pasteur por encima del ―sándwich‖ formado por el gel/ membrana/papel de filtro. A menudo. así como soluciones tampón en polvo de PCS.TBS Página 12 . La membrana debe ser desteñida antes del proceso de transferencia. Una incubación durante una hora (temperatura ambiente o a 4ºC) suele ser suficiente para un bloqueo de los lugares de unión no específicos del anticuerpo.  Evitar la manipulación de las membranas con las manos desnudas. el uso de agentes bloqueantes no proteicos. .. sin embargo y debido a la presencia de biotina en las fosfoproteínas.

Variabilidad Tolerancia a condiciones variables Poca tolerancia Más tolerante a conpuede dejar de diciones variables. Los geles nativos se pueden utilizar cuando los anticuerpos requieren de la proteína plegada para el reconocimiento del antígeno. Anticuerpos Monoclonales Reconocimiento epitopo y sensibilidad  Reconocimiento de un único epítopo  Menos sensibilidad debido a que sólo un anticuerpo se une a cada proteína Anticuerpos Policlonales  Reconocimiento múltiples epítopos en una proteína  Más sensible debido a los multiples lugares de unión de anticuerpo en cada proteína. cabra. los anticuerpos reconocen una secuencia de aminoácidos pequeña (epítopo) que queda expuesta al eliminar la estructura tridimensional de la proteína en condiciones desnaturalizantes y reductoras.  Reactividad cruzada con otras especies más probable. comúnmente conejo. o por modificaciones químicas (glicosilación fosforilación) o por diferencias en la secuencia peptídica debido a la presencia de polimorfismos. Para la síntesis de un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epítopos del antígeno y en cambio los monoclonales reconocen un único epítopo de la proteína. Hibridación del Anticuerpo. Algunas características de los anticuerpos monoclonales y policlonales se describen en la Tabla 8. Tiempo requerido para su producción Coste de Preparación Largo Mayor coste . Los hibridomas con secreción más estable se seleccionan y pueden ser cultivados indefinidamente.  Bueno para proteínas poco abundantes. Los dos tipos tienen distintas ventajas y desventajas y se diferencian según la forma en la que se sintetizan. Después del proceso de bloqueo. Reactividad cruzada potencial  Reactividad cruzada menos probable. El primer paso en la producción de ambos anticuerpos.  Reactividad cruzada más probable.reMenor coste quiere personal capacitado y equipamiento especializado. Los lotes de un mismo hibridoma son muy estables. Más corto Anticuerpos Primarios: Monoclonal vs Policlonal. para provocar una respuesta inmune. es la inyección de un antígeno en un animal. la membrana se incuba con el anticuerpo primario. Página 13 .  Potencial para reconocer otras proteínas que contengan el epítopo.Análisis de Proteínas 5. En general. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales. Propenso a cierta variabilidad entre lotes.  Mayor ruido de fondo potencial debido al reconocimiento de multiples epítopos. reconocer al antígeno en condiciones de desnaturalización/reducción de la proteína. En la transferencia Western se pueden utilizar. Tabla 8. burro u oveja y son finalmente purificados y probados. tanto anticuerpos primarios monoclonales como policlonales. las células que sintetizan anticuerpos se aíslan del bazo del animal y se fusionan con células del mieloma. Lo hibridomas resultantes secretan anticuerpos al medio de cultivo. Los anticuerpos policlonales se obtienen directamente a partir del suero del animal. el cual se analiza y determina la afinidad al antígeno.

Un anticuerpo con amplia especificidad inmunoglobulínica debería ser suficiente. IgG2a. o sea. A continuación se describen las consideraciones a tener en cuenta a la hora de la elección de un anticuerpo secundario:  Las especie del primer Ac dicta la elección del Ac secundario. la disolución con el anticuerpo. 500 µl Anticuerpo Secundario conjugado APC cabra-anti-conejo. el segundo Ac debe ser anti-conejo.Hibridación Anticuerpos Incubación de los anticuerpos El anticuerpo primario se diluye en tampón de bloqueo. es necesario un anticuerpo secundario apropiado.  Página 14 . IgE) y posiblemente la subclase (IgG1. ya que los anticuerpos específicos para sub-clases se utilian mayoritariamente. ya que puede eliminar la actividad de la peroxidasa e interferir en los métodos de detección. Si se utiliza acida sódica como conservante. TBST o en un tampón de disolución de anticuerpo comercial. 50 µl IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón. En algunos casos.  Nota: Advansta ofrece una línea completa de anticuerpos secundarios marcados para detección mediante quimioluminscencia o fluorecencia. PBS. IgA. También es posible una incubación a 4ºC durante toda la noche. El fabricante puede recomendar una cantidad inicial. se procede a la eliminación del excedente mediante tampones de lavado (TBS. Si el primer Ac es de conejo. e incubar en un agitador de vaivén. 500 µl Después de la incubación con el anticuerpo primario. IgD. Para anticuerpos monoclonales se debe considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG. la membrana debe someterse a agitación suave y sumergida en la disolución. Un menor volumen puede utilizarse si la membrana se sella dentro de una bolsa e incuba en un agitador orbital. IgM. pero a menudo la concentración óptima de anticuerpo debe determinarse empíricamente. 250 µl Anticuerpo Secundario conjugado HRP cabra-anti-ratón. debe ser totalmente lavada de la membrana. un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente suele ser suficiente. deber ser producido en otra especie distinta a conejo.  Información para pedidos R-05051-050 R-05051-250 R-05052-050 R-05051-250 R-05071-500 R-05072-500 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo. en experimentos de doble etiquetado u otras aplicaciones.…). TBST o PBST). Durante la incubación. la abundancia de la proteína en la muestra y la sensibilidad del sistema de detección afectarán a la cantidad de anticuerpo a utilizar. La afinidad del anticuerpo.  Generalmente. 250 µl IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón. puede reutilizarse. 50 µl IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo. En métodos de detección indirectos (sección 6).

Westernbright Quantum y WesternBright Sirius.  Versátil . biotina o molécula fluorescente. sólo un color de reacción) Figura 11 . fácil de documentar. La figura 11. Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan comúnmente anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (HRP). 20x25 cm. cada uno con sus ventajas e inconvenientes. Los anticuerpos se pueden marcar mediante kits disponibles en le mercado u obtenerlos ya marcados.  Mayor posibilidad de unión no inespecífica. En la detección indirecta.  Puede ser más costoso. Detección directa e indirecta de proteínas Tabla 9. como un enzima. un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario contra la especie del primer anticuerpo. semicuantitativa . Fluorescencia y 3. que puede ser detectada mediante la exposición de la membrana a una película de rayos X o captada de forma digital utilizando una cámara CCD. la película tiene un rango dinámico limitado. Inconvenientes: requiere una habitación oscura (película rayos X) o sistemas de imagen caros. señal debido a la  Menos posibilidaunión de múltides de unión no ples Ac secundaespecífica. Ventajas: muy sensible. rios a cada Ac primario. la intensidad de la señal puede variar con la incubación o el tiempo de exposición. incluyedo WesternBrightTM ECL.Análisis de Proteínas 6.ilustra los métodos de detección directos e indirectos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e inconvenientes de los dos métodos. la membrana puede tratarse para re-utilizarse. Detección. Inconvenientes Nota: LucentBlueTM es una película que ha sido optimizada para Información para pedidos L07014-100 L07013-100 Película Rayos X LucentBlueTM . Colorimetría. 2. Los métodos más comúnmente utilizados para detectar proteínas son: 1. no son posibles detecciones multiplex (detección de mas de una proteína. 100 uds la detección de señales de quimioluminiscencia en experimentos realizados con los substratos WesternBright HRP. Quimioluminiscencia.el mismo Ac secundario puede utilizarse para diversos anticuerpos de la misma especie. Métodos de detección. La reacción entre el encima y el substrato produce luz.porque se basa en una reacción enzimática. 100 uds Película Rayos X LucentBlueTM .  La inmunorreactividad del Anticuerpo puede estar afectada por el marcaje. Ventajas e Inconvenientes de los métodos de detección Indirecto Ventajas Directo  Amplificación de  Menos pasos. Quimioluminiscencia. Lo métodos indirectos utilizan dos anticuerpos. La detección de la proteína se puede hacer mediante métodos directos o indirectos. es el anticuerpo secundario el que está conjugado con un marcaje detectable.  Más pasos. Página 15 . Los métodos directos utilizan un anticuerpo primario conjugado con un marcaje detectable. se pueden hacer multiples exposiciones en películas de rayos X. 13x18 cm. 1.

Con la detección multiplex de fluorescencia. es ideal para comparar la proteína de interés con un control de carga. Inconvenientes: no es tan sensible como los otros dos métodos. mediante la detección fluorescente multicolor. de dos proteínas en una sola membrana. Ventajas: sencilla de realizar. aporta datas cuantificables. se pueden detectar múltiples proteínas de forma simultanea. Nota: WesternBright TM MCF permite la detección. la membrana puede ser tratada para volver a ser utilizada para la detección de otra proteína. apto para ensayos multiplex con múltiples colorantes. La luz emitida. Colorimetría. las membranas se pueden documentar fácilmente mediante fotografía. La cantidad de colorante convertido es proporcional al cantidad en la muestra. Información para pedidos K-12042-D10 K-12042-D10 K-12045-D20 K-12042-D10 WesternBrightTM Quantum Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) WesternBrightTM Sirius Western Blotting HRP Substrate (para 1000 cm2 de membrana) WesternBrightTM ECL Western Blotting HRP Substrate (para 2000 cm2 de membrana) WesternBrightTM ECL Spray Página 16 . se detecta mediante un dispositivo capaz de medir la fluorescencia o mediante una cámara CCD provista con los filtros de longitud de onda apropiada. La intensidad de la tinción puede ser medida por espectrofotometría o por un densitómetro. el color se desvanece con el tiempo. Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento pueden ser costosos. Información para pedidos K-12021-010 WesternBrightTM fluorescent Western blotting kit Nota: Advansta suministra una línea completa de reactivos de detección de quimioluminiscencia optimizados para los diferenentes métodos. fácil documentación de resultados. o diferentes isoformas de la proteína. no requiere cámara oscura. que cuando es ―excitado‖ emite luz. no se requiere el uso de una cámara oscura. pero consume mucho tiempo. Este procedimiento puede conservar las muestras. Re-utilización de la membrana Después de captar la imagen. El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo. El enzima convierte el colorante en un producto insoluble que es visible en la membrana. pueden usarse Ac primarios marcados (para proteínas abundantes) y eliminar pasos. Perfecto para aquellos experimentos en los que se necesite comparar la proteína de interés con un control de carga. Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incrementarse utilizando el sistema streptavidina/ biotina). amplio rango dinámico.Detección 2. Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secundario que ha sido conjugado previamente a un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). La imagen se digitaliza para su análisis. Fluorescencia. no es tan sensible como la quimioluminiscencia (puede no ser apropiado para proteínas poco abundantes). Las membranas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en protocolos de lavados para reutilización. concentración de muestra y tipos experimentales. 3.

4) Rayas Verticales (ver 14) Bandas Múltiples (ver 10) Distorsión Lateral (ver 15) Las bandas aparecen muy altas o muy bajas en el gel (ver 11) Contaminación Reactivos (ver 26) Problemas con los reactivos (ver 5. Tamaño incorrecto de la banda C. Problemas en la electroforesis E. Solución de Problemas Solución de problemas con Western Blot A. 9) Bandas Difusas (ver 13) El gel corre demasiado rápido o demasiado lento (ver 20. Ruido de fondo excesivo Preparación Muestra (ver 1) La proteína es menor de lo esperado (ver 7) Bandas Incompletas (ver 12) El gel polimeriza demasiado rápido o demasiado lento (ver 17. 6) Frente corre curvado ―smiling‖ (ver 22) Elección de Membrana (ver 27) Bandas distorsionadas (ver 16) Frente corre inclinado (ver 23) Unión no específica del Anticuerpo (ver 28) Revelado de la película (ver 29) Página 17 .19) Bloqueo Insuficiente (ver 24) Transferencia Inadecuada (ver 2) La proteína es mayor a lo esperado (ver 8.18.21) Lavado inapropiado (ver 25) Unión ineficiente del Anticuerpo (ver 3. No se puede ver la proteína de interés B. Bandas artefactuales D.Análisis de Proteínas 7.

fosforilación. Transferencia indadecuada Solución Intentar métodos alternativos. incluir un control positivo 9.Solución de Problemas A.Reactivos viejos o inestables tivo Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sódica 6. Problema 7. Problema 1. Unión ineficiente del Anticuerpo primario Baja afinidad del anticuerpo por la proteí. juntar múltiples muestras Usar inhibidores de proteasa en le tampón de lisis Tampón de transferencia preparado inco. Proteína más pequeña de lo esperado Mezclar conjugado + substrato en un tubo.conseguir un nuevo reactivo si no hay señal Evitar utilizar disoluciones conteniendo este agente conservante La disolución es antigua o está almacena. Reactivo de detección (ECL) B. disminuir do la concentración de sales el tampón de lavado Antígeno enmascarado por el agente bloqueante (ej. Proteína más larga de lo esperado y/o bandas múltiples Proteínas modificadas de forma natural (glicosilación. pulso intactos de centrífuga previo a la carga de la muestra Página 18 . Congelación/descongelación de la muestra Proteína variante (Splicing) Solución Uso de inhibidores de proteasa/muestras frescas Consultar literatura/utilizar controles apropiados Consultar literatura para encontrar aditivos que puedan eliminar grupos químicos 8. incluir control positivo en el gel Cargar más cantidad de proteína total en el gel.: BSA. concentrar utilizando Afyon. sustituir si es muy delgada 3. acetilación. Unión ineficiente del Anticuerpo secundario Elección de especies errónea Utilizar un agente de bloqueo alternativo (ej. Preparación Muestra Causa(s) Extracción ineficiente Baja expresión de la proteína en el tejido o las células La proteína se ha degradado durante la extracción 2.…) Usar Anticuerpos dirigidos contra la especie del Anticuerpo primario Concentración insuficiente del Anticuerpo Aumentar concentración o comprar uno o Anticuerpo antiguo Anticuerpo nuevo 5.…) 4.Comprar reactivo nuevo da de forma inapropiada Causa (s) Proteólisis. comprar un anticuerpo nuevo y almacenarlo de forma apropiada El Anticuerpo tiene reactividad cruzada débil con las especies de interés Probar con un Anticuerpo primario de diferente origen El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava.puentes disulfuro Uso de DTT en tampón de muestra. Proteína más larga de lo esperado Agregado de proteínas . etc…) Cambio de la expresión de la proteína en la línea celular Utilizar cultivos anteriores. Conjugado/Substrato Inac. o luminiscencia en oscuridad .Incrementar la concentración del Antina o el anticuerpo es antiguo/débil cuerpo.Usar menor numero de lavados.Revisar el protocolo/disminuir metanol rrectamente/demasiado metanol en el tampón Proteínas de mayor tamaño necesitan mas tiempo/voltaje Contacto insuficiente entre el gel y la membrana Repetir con un tiempo mayor/mayor voltaje Revisar la almohadilla de fibra.: Leche.

asegurarse de la correcta preparación del tampón Asegurarse que las muestras se han incubado durante 2 min a 90ºC antes de cargarlas en el gel Preparar SDS nuevo para le tampón de muestra 11. Problema 12. apretar hasta encontrar primera resistencia Usar guantes en la preparación de los geles Uso de Etanol y H2O desionizada en la limpieza de los cristales Burbujas introducidas en el gel por el dispositivo de llenado (jeringa o pipeta) Burbujas de aire atrapadas por el peine No expulsar totalmente el volumen de la mezcla del gel Insertar el peine en ángulo y antes que se polimerice el gel Solución Repetir con TEMED y AP Preparar AP fresco Aplicar isopropanol antes de verter el gel de apilamiento (stacking gel) Incrementar la cantidad de TEMED/AP Preparar disolución fresca de AP D. Rayas en los carriles Alta concentración de sales en la muestra Disminuir la concentración de sal en el tampón de muestra Muestra muy concentrada o insuficiente SDS Incrementar concentración/usar más SDS Minimizar el tiempo de carga 15. Bandas Extras Causa(s) Solución Unión no específica del Anticuerpo prima. Distorsión de las bandas Difusión de la muestra en los pocillos durante la carga Fallo en la completa polimerización de los Incrementar TEMED/AP pocillos Presión aplicada excesiva a la hora de montar el gel Burbujas en el gel debido al uso de cristales sucios No apretar en exceso los tornillos del sistema. El gel polimeriza muy lento TEMED/AP Insuficiente La disolución de AP ha perdido su actividad Página 19 . Bandas difusas Migración lenta Las muestras no se han calentado correctamente El SDS del tampón es antiguo 14. Problema (continuación) 10. hacer rodar por encima del paquete gel/membrana para forzar la salida de las burbujas Incrementar voltaje. Bandas Incompletas Causa(s) Burbujas entre el gel y la membrana 13.Análisis de Proteínas B. La proteína aparece muy Porcentaje erróneo/no óptimo del gel alta o muy baja en la membrana C. El gel no polimeriza Causa (s) Fallo al añadir el TEMED y AP La disolución AP es estable durante dos o tres días a 4ºC El oxígeno inhibe la polimerización 18. Distorsión lateral de las bandas 16. intentar un rio o secundario experimento de bloqueo de péptido (eliminará la proteína de interés) Incrementar el porcentaje para proteínas de pequeño tamaño. Problema 17. disminuir para proteínas de gran tamaño Solución Usando una pipeta.Disminuir concentraciones.

Bloqueo insuficiente Causa(s) La presencia de Biotina en la leche es incompatible con el uso de Estreptavidina. El polimeriza demasiado rápido 20. NP-40) 26. o la leche contiene el antígeno de interés Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright MCF. Contaminación de los reactivos Crecimiento bacteriano o fúngico en los tampones Revisar la turbidez de los tampones. lentamente volver a posición vertical Solución Usar BSA E. Tiempo de carrera inusualmente largo Causa(s) Cantidad excesiva de TEMED/AP Buffer de electroforesis demasiado concentrado Voltaje insuficiente 21. Problema 24. Frente curvado (smiling) Tampón demasiado diluido Migración demasiado rápida Generación de calor 23.Solución de Problemas D.Reducir los tiempos de exposición. Condiciones de lavado inapropiadas Número insuficiente de lavados Concentración insuficiente de detergente Incrementar la concentración de detergente o usar detergentes más fuertes (SDS. intentar con Anticuerpo monoclonal o purificado por afinidad Disminuir la cantidad de proteína 27. diluir el tampón en caso necesario Incrementar voltaje Revisar el protocolo. manteniendo la relación entre ambos Revisar protocolo. Tiempo de carrera inusualmente corto 22. refrigerar Aguantar el gel en ángulo. preparar nuevos Elegir membranas de Nitrocelulosa Utilizar únicamente membranas PVDF con baja autofluorescencia con Western Blots fluorescentes Estar seguro que la membrana esta húmeda durante todo el proceso Disminuir la concentración de Anticuerpo. algún Anticuerpo primario puede requerir un bloqueante proteico La disolución está demasiado diluida Tiempo de bloqueo muy corto Algunos detergentes no son efectivos a bajas temperaturas Incluir BSA o leche en la disolución AdvanBlock-PF utilizada en la dilución del Anticuerpo primario Incrementar con un 5% la disolución Incrementar el tiempo de incubación Incubar a temperatura ambiente en vez de toda la noche a 4ºC Incrementar el número de lavados o la duración de cada uno de ellos 25. colocar una esquina en el tanque inferior del sistema de electroforesis. Frente inclinado Burbuja atrapada entre los cristales en la parte inferior del gel Solución Reducir la cantidad de TEMED/AP.Las membranas PVDF pueden tener más brana ruido de fondo que las de Nitrocelulosa Algunas membranas tienen alta autofluorescencia Membrana seca 28. Unión no específica del Anticuerpo primario o secundario Concentración muy alta del Anticuerpo o no purificado por afinidad Mucha cantidad de proteína en el gel 29. Elección de tipo de mem. reemplazar tampón en caso necesario Disminuir voltaje Disminuir voltaje. Problema (continuación) 19. si no es cula o al CCD posible incrementar la dilución de los Anticuerpos o cargar menor cantidad de muestra Página 20 . Sobreexposición de la imagen El tiempo excesivo de exposición a la pelí.

7 10 pmol o 6x1012 moléculas 6.Análisis de Proteínas 8.2 1.7 pmol o 4x1012 moléculas Página 21 . Código genético y abreviaciones de los aminoácidos Segunda Posición U UUU UUC U UUA UUG Fenilalanina (Phe. Conversión entre masa y moles de proteína Peso molecular (Da) 10. P) Isoleucina (Ile. I) Metionina (Met.000 150. C) STOP Triptófano (Trp. Q) Asparagina (Asn. Aspártico (Asp. T) STOP UGU UGC UGA UGG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG CAU CAC CAA CAG Treonina (Thr. H) Glutamina (Gln. N) Lisina (Lys. Glutámico (Glu. V) Serina (Ser. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale Proteina IgG IgM IgA Proteina A Avidina Estreptavidina Albumina suero bovino A280 Uds por 1 mg&ml 1. G) Tabla 11. M) Valina (Val. D) A. Herramientas y Referencias Técnicas g de Soluto Molaridad de una disolución = [Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolución) Tabla 10.35 1. L) Prolina (Pro. A) Glicina (Gly. E) CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG G Cisteina (Cys.000 100. K) A.000 1 µg 100 pmol o 6x1013 moléculas 20 pmol o 1. F) Leucina (Leu.2x1013 moléculas 1 nmol 10 µg 50 µg 100 µg 150 µg Tabla 12.17 1.3 0.4 0. T) AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG Histidina (His. L) UCU UCC UCA UCG C Serina (Ser. R) Primera posición C Leucina (Leu. W) Arginina (Arg. S) UAU UAC UAA UAG A Tirosina (Tyr.000 20.5 3. S) Arginina (Arg. R) A G GCU GCC GCA GCG Alanina (Ala.

2 Copyright © 2011 Advansta. Afyon™.07 186. unidad de masa molecular mol molaridad.2 114. All other trademarks.2 57.. Abreviaciones ds ss bp kb Da mol M doble cadena ( como en dsDNA) cadena sencilla (como en ssDNA) pares de base kilobase.1 156. Vida media de los Radioisótopos más habituales Radioisótopo Carbono-14 (14C) Iodo-125 (125I) Fósforo-32 (32P) Azufre-35 (35S) Tritio (3H) Vida media 5.3 días 87. moles de soluto por litro de disolución F G H I K L M N P Q Tabla 15.000 bases o pares de base Dalton. The Advansta logo is a registered trademark of the Company.08 103.2 113.1 147. LucentBlue™ and WesternBright™ are trademarks of the Company.05 137. AdvanBlock™.2 87.4 días 12.730 años 60 días 14.12 128.2 163. Masa molecular media de los aminoácidos Códigos Aminoácidos A C D E Tabla 14. service marks and tradenames appearing in this brochure a re the property of their respective owners.1 129.2 131.Herramientas y Referencias Tabla 13. Página 22 .1 115. Avant™. All rights reserved.1 113.4 años R S T V W Y Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Peo Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr Masa molecular media 71.2 128. 1.1 91.08 101. Prefijos métricos M K m µ mega Kilo mili micro 106 103 10-3 10-6 n K f a nano pico femto atto 10-9 10-12 10-15 10-18 Tabla 16.1 99. Adva nWash™.

325. 9-11 Tel.com www. Hermenegildo.ecogen. 16 Tel. Dos de Maig./Fax: 94 450 26 01 08041 BARCELONA ecogen@ecogen.com Ptge.1904 | Email: sales@advansta. Ste.com . 1160 | Menlo Park.advansta. CA 94025 Tel: 650.1980 | Fax: 650.325. Fax: 91 594 02 28015 MADRID ecogenm@ecogen.com C/ S.: 91 444 06 62.Importador www.com DISTRIBUIDOR LOCAL Sevilla · Granada · Oviedo · Vigo · Zaragoza · Pamplona · Murcia · Valencia · Islas Canarias Advansta Corporation 1455 Adams Drive.

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