El desarrollo de técnicas químicas para sintetizar polinucleó- mayoría de estas enzimas son de cuatro a seis nucleótidos y se ca- 723
tidos que tienen una secuencia de bases específica fue iniciado
por H. Gobind Khorana a principios de la década de 1960 como
parte de un intento de descifrar el código genético. Khorana y sus
colaboradores continuaron refinando sus técnicas, y una década
después de su trabajo inicial en el código, lograron sintetizar un
gen de tRNA de tirosina bacteriano completo, incluida la región
promotora no transcrita. El gen con un total de 126 pares de ba-
ses se agrupó en más de 20 segmentos, cada uno de los cuales se
sintetizó individualmente y luego se unió por enzimas. Este gen
artificial se introdujo luego en células bacterianas portadoras de
mutaciones para este tRNA, y el DNA sintético fue capaz de
reemplazar la función antes deficiente. El primer gen sintetizado
químicamente que codifica una proteína de tamaño promedio, el
interferón humano, se preparó en 1981, un esfuerzo que requirió
la síntesis y el ensamblaje de 67 fragmentos diferentes para pro-
ducir un dúplex único de 514 pares de bases que contiene señales
de iniciación y terminación reconocidas por la RNA polimerasa
bacteriana.
Las reacciones químicas que vinculan los nucleótidos se han
automatizado, y la síntesis de oligonucleótidos ahora se lleva a
cabo mediante máquinas controladas por computadora conecta-
das a los reservorios de reactivos. El operador ingresa la secuen-
cia de nucleótidos deseada en la computadora y mantiene el
instrumento provisto de materiales. El oligonucleótido es ensam-
blado un nucleótido a la vez desde el extremo 3 al 5 de la mo-
lécula, hasta un total de aproximadamente 200 nucleótidos.
Modificaciones tales como la biotina y los fluoróforos pueden
incorporarse en las moléculas. Si se necesita una molécula de
doble cadena, se sintetiza como dos cadenas simples comple-
mentarias que pueden hibridarse juntas. Las moléculas sintéti-
cas más largas se fabrican en los segmentos que se unen como se
ilustra en el experimento descrito en la página 22.
18.20 Tecnología del DNA
recombinante
En los últimos 30 años, se han logrado enormes avances en el aná-
lisis de los genomas eucarióticos. Este progreso comenzó cuando
los biólogos moleculares aprendieron a construir moléculas de
DNA recombinante, que son moléculas que contienen secuen-
cias de DNA derivadas de más de una fuente. Los DNA recombi-
nantes se pueden utilizar de muchas maneras. Comenzaremos
considerando una de las aplicaciones más importantes: el aisla-
miento desde el genoma de un segmento particular de DNA que
codifica un polipéptido particular. Primero, sin embargo, es nece-
sario considerar una clase de enzimas cuyo descubrimiento y uso
ha hecho posible la formación de las moléculas de DNA recombi-
nante.
Endonucleasas de restricción
Durante la década de 1970, se encontró que las bacterias conte-
nían nucleasas que reconocerían secuencias cortas de nucleótidos
dentro del DNA dúplex y escindirían el esqueleto del DNA en
sitios específicos en ambas cadenas del dúplex. Estas enzimas se
denominan endonucleasas de restricción de tipo II, o simple-
mente enzimas de restricción. Se les dio este nombre porque fun-
cionan en las bacterias para destruir los DNA virales que podrían
entrar en la célula, lo que restringe el crecimiento de los virus. La
bacteria protege su propio DNA del ataque nucleolítico mediante
la metilación de las bases en sitios susceptibles, una modificación
química que bloquea la acción de la enzima.
Se han aislado enzimas de varios cientos de diferentes organis-
mos procarióticos que, en conjunto, reconocen más de 100 secuen-
cias de nucleótidos diferentes. Las secuencias reconocidas por la
ERRNVPHGLFRVRUJ
racterizan por un tipo particular de simetría interna. Considere la
secuencia particular reconocida por la enzima EcoR1:
18.20 ӝ Tecnología del DNA recombinante
↓

3\CTTAAG\5
5\GAATTC\3

↑
Se dice que este segmento de DNA tiene una simetría rotacional
doble porque puede rotarse 180 °C sin cambios en la secuencia de
bases. Por tanto, si uno lee la secuencia en la misma dirección (3
a 5 o 5 a 3) en cualquiera de las cadenas, se observa el mismo
orden de bases. Una secuencia con este tipo de simetría se llama
palíndromo. Cuando la enzima EcoR1 ataca este palíndromo, rom-
pe cada cadena en el mismo sitio en la secuencia, lo que se indica
mediante las flechas entre los residuos A y G. Los puntos rojos
indican las bases metiladas en esta secuencia que protegen el
DNA del huésped del ataque enzimático. Algunas enzimas de
restricción dividen los enlaces directamente opuestos entre sí en
las dos cadenas que producen extremos romos, mientras que
otras, como EcoR1, hacen cortes escalonados.
El descubrimiento y la purificación de las enzimas de restric-
ción han sido invaluables en los avances realizados por los biólo-
gos moleculares en los últimos años. Debido a que una secuencia
particular de cuatro a seis nucleótidos ocurre con bastante fre-
cuencia simplemente por casualidad, cualquier tipo de DNA es
susceptible a la fragmentación por estas enzimas. El uso de enzi-
mas de restricción permite que el DNA del genoma humano, o el
de cualquier otro organismo, se diseccione en un conjunto de
fragmentos específicos definidos con precisión. Una vez que el
DNA de un individuo en particular se digiere con una de estas
enzimas, los fragmentos generados se pueden fraccionar en base
a la longitud por electroforesis en gel (como en la FIGURA 18-40a).
Diferentes enzimas escinden la misma preparación de DNA en
diferentes conjuntos de fragmentos, y los sitios dentro del geno-
ma que se escinden por varias enzimas pueden identificarse y
ordenarse en un mapa de restricción como el que se muestra en
la figura 18-40b).
Formación de los DNA recombinantes
Los DNA recombinantes se pueden formar de varias maneras. En
el método que se muestra en la figura 18-41, las moléculas de
DNA de dos fuentes diferentes se tratan con una enzima de res-
tricción que hace cortes escalonados en el dúplex de DNA. Los
cortes escalonados dejan colas cortas de una sola fila que actúan
como “extremos pegajosos” que se pueden unir a una única cola
complementaria de otra molécula de DNA para restaurar una
molécula de doble cadena. En el ejemplo representado en la FI-
GURA 18-41, uno de los fragmentos de DNA que formarán la mo-
lécula recombinante es un plásmido bacteriano. Los plásmidos
son moléculas de DNA pequeñas, circulares y de doble cadena
que están separadas del cromosoma bacteriano principal. El otro
fragmento de DNA en la figura 18-41 se obtiene a partir de célu-
las humanas después del tratamiento con la misma enzima de
restricción utilizada para abrir el plásmido. Cuando los fragmen-
tos de DNA humano y el plásmido tratado se incuban juntos en
presencia de DNA ligasa, los dos tipos de DNA favorecen los en-
laces de hidrógeno entre sí por sus extremos pegajosos y luego se
ligan para formar recombinantes de DNA circular, como en la
figura 18-41. Las primeras moléculas de DNA recombinante se
formaron por este método básico en 1972 por Paul Berg, Herbert
Boyer, Annie Chang y Stanley Cohen de la Universidad de
Stanford y la Universidad de California en San Francisco, mar-
cando el nacimiento de la ingeniería genética moderna.
Al seguir el procedimiento que se acaba de describir, se produ-
ce un gran número de moléculas recombinantes diferentes, cada
 724 FIGURA 18-40 La construcción de un mapa ORIGEN ORIGEN
de restricción del pequeño genoma circular
del polioma del virus tumoral de DNA. a)
Autorradiografías de fragmentos de DNA
marcados con 32P que se han sometido a
CAPÍTULO 18 ӝ Técnicas en biología molecular y celular

electroforesis en gel. El gel de la izquierda

muestra el patrón de los fragmentos de DNA Hpa ll - 1
obtenidos después de una digestión comple- Hpa ll - 2
ta del genoma del polioma con la enzima
HpaII. Para determinar cómo estos ocho frag- Hpa ll - 3
mentos se juntan para formar el genoma in-
tacto, es necesario tratar el DNA de tal ma- Hpa ll - 4
nera que se generen fragmentos superpues-
tos. Los fragmentos superpuestos se pueden B
producir tratando el genoma intacto con una A
segunda enzima que escinde la molécula en
Hpa ll - 5
diferentes sitios, o tratando el genoma con la C
Hpa ll - 6
misma enzima en condiciones en las que el
DNA no está completamente digerido como
lo estaba en el gel izquierdo. Los dos geles D
de la derecha representan los ejemplos de Hpa ll - 7 Hpa ll - 1+F
las digestiones parciales del genoma de po- E
Hpa ll - 1+ G
lioma con HpaII. El gel intermedio muestra
los fragmentos generados por la digestión H
I
parcial del DNA circular superhélico, y el gel K
Hpa ll - 2
de la derecha muestra los fragmentos HpaII
formados después de que el genoma circular
se convierte en una molécula lineal por Hpa ll - 3 J
EcoR1 (una enzima que hace sólo un corte en Hpa ll - 8
el círculo). b) El mapa de restricción del ge-
noma de polioma linealizado basado en la Hpa ll - 4
escisión por HpaII. Los ocho fragmentos del
resumen completo se muestran a lo largo del
AZUL
DNA en la parte superior. Los fragmentos su-
perpuestos del resumen parcial se muestran
en su disposición ordenada debajo del ma-
pa. (Los fragmentos L y M migran a la parte
inferior del gel en la parte a, lado derecho).
a)
FUENTE: De Beverly E. Griffin, Mike Fried, y
Allison Cowie, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
71:2078, 1974. EcoR I 25 50 75

HpaII HpaII HpaII

HpaII –2 –6 HpaII –1 HpaII –3 –5 HpaII –4 –8 –7

C L
D I M
F H
B J
A A
E E
G G

b)

una de las cuales contiene un plásmido bacteriano con un seg-
mento de DNA humano incorporado en su estructura circular
(véase figura 18-42). Supongamos que estaba interesado en aislar
un solo gen del genoma humano, por ejemplo, el gen que codifica
la insulina. Debido a que su objetivo es obtener una preparación
purificada de un tipo de DNA recombinante que contiene el frag-
mento de codificación de la insulina, debe separar este fragmento
de todos los demás. Esto se hace mediante un proceso llamado
clonación de DNA. Volveremos a la búsqueda del gen de la insu-
lina después de describir la metodología básica detrás de la clona-
ción del DNA.
Clonación del DNA
La clonación del DNA es una técnica para producir grandes can-
tidades de un segmento de DNA específico. El segmento de DNA
que se va a clonar se vincula primero a un vector de DNA, que es
un vehículo para transportar el DNA extraño en una célula hués-
ped adecuada, como la bacteria E. coli. El vector contiene secuen-
cias que le permiten replicarse dentro de la célula huésped. Dos
tipos de vectores se usan comúnmente para clonar el DNA dentro
de los huéspedes bacterianos. En un enfoque, el segmento de
DNA que se va a clonar se introduce en la célula bacteriana
uniéndolo a un plásmido, como se describe anteriormente, y lue-
go hace que las células bacterianas tomen el plásmido del medio.
En un enfoque alternativo, el segmento de DNA se une a una
porción del genoma del virus bacteriano lambda (l), y luego se le
permite infectar un cultivo de células bacterianas, produciendo
grandes cantidades de progenie viral, cada una de las cuales con-
tiene el segmento extraño de DNA. De cualquier manera, una vez
que el segmento de DNA está dentro de una bacteria, se replica
junto con el DNA bacteriano (o viral) y se reparte en las células
hijas (o partículas virales de la progenie). Por tanto, el número de
moléculas de DNA recombinante aumenta en proporción al nú-
mero de células bacterianas (o progenie viral) que se forma. A
partir de un único plásmido recombinante o genoma viral dentro

ERRNVPHGLFRVRUJ
 los antibióticos permite a los investigadores seleccionar aquellas 725
células que contienen el plásmido recombinante.
Como lo demostraron por primera vez Avery, Macleod y
Plásmido Cromosoma McCarty (página 379), las células bacterianas pueden absorber el

18.20 ӝ Tecnología del DNArecombinante

bacteriano humano DNA de su medio. Este fenómeno forma la base para la clonación
de los plásmidos en las células bacterianas (FIGURA 18-42). En la

La misma enzima de restricción

divide ambos tipos de DNA Cromosoma
de E. coli

Plásmido

Gen de resistencia
a antibióticos

A AATT
A A

T T A A
A

TT
TT

Purificar el Purificar el
DNA humano DNA plasmídico

El fragmento de DNA humano se une con el plásmido por lo

extremos pegajosos; las muescas están selladas por enzimas

Tratar con EcoR1 para

dividir el DNA humano y
bacteriano en fragmentos

Plásmido

Unir los fragmentos

en DNA recombinantes
con DNA ligasa

FIGURA 18-41 Formación de una molécula de DNA recombinante. En

este ejemplo, una preparación de plásmidos bacterianos se trata con una Población de plásmidos
enzima de restricción que realiza un único corte dentro de cada plásmido que contienen diferentes
bacteriano. Esta misma enzima de restricción se usa para fragmentar una segmentos de DNA humano
preparación de DNA genómico humano en pequeños fragmentos. Debido
a que se han tratado con la misma enzima de restricción, el DNA del plás-
mido escindido y los fragmentos de DNA humano tendrán extremos pega- Incubar las células de E. coli
josos. Cuando estas dos poblaciones se incuban juntas, las dos moléculas en condiciones en las que
de DNA se unen no covalentemente entre sí y luego se sellan covalente- absorberán los plásmidos
mente por la DNA ligasa, formando una molécula recombinante de DNA. del medio. Cultivar células E. coli libre de plásmidos
en un medio que seleccione
para aquellas que contienen
de una célula bacteriana, se pueden formar millones de copias del un plásmido recombinante
DNA en un corto periodo. Una vez que la cantidad de DNA se ha
amplificado lo suficiente, el DNA recombinante se puede purifi-
car y usar en otros procedimientos. Además de proporcionar un
medio para amplificar la cantidad de una secuencia de DNA par-
ticular, la clonación también se puede utilizar como una técnica
para aislar una forma pura de cualquier fragmento de DNA espe-
cífico entre una gran población heterogénea de moléculas de
DNA. Comenzaremos discutiendo la clonación del DNA utilizan- Gen de la insulina ? ? ? Gen del RNA ?
do los plásmidos bacterianos. ribosomal

FIGURA 18-42 Un ejemplo de clonación de DNA utilizando plásmidos

CLONACIÓN DEL DNA EUCARIÓTICO EN LOS
PLÁSMIDOS BACTERIANOS El DNA extraño que se
va a clonar se inserta primero en el plásmido para formar una
molécula de DNA recombinante. Los plásmidos utilizados para la
clonación del DNA son versiones modificadas de las que se en-
cuentran en las células bacterianas. Al igual que las contrapartes
naturales de las que se derivan, estos plásmidos contienen un
origen de replicación y uno o más genes que hacen que la célula
receptora sea resistente a uno o más antibióticos. La resistencia a
bacterianos. El DNA se extrae de células humanas, se fragmenta con Eco
R1 y los fragmentos se insertan en una población de plásmidos bacteria-
nos. Existen técnicas disponibles para prevenir la formación de los plásmi-
dos que carecen de un inserto de DNA extraño. Una vez que una célula
bacteriana ha recogido un plásmido recombinante del medio, la célula da
lugar a una colonia de células que contienen la molécula de DNA recom-
binante. En este ejemplo, la mayoría de las bacterias contienen DNA eu-
carióticos de función desconocida (marcados como ?), mientras que una
contiene una parte del DNA que codifica el RNA ribosomal y otra contiene
el DNA que codifica la insulina.

ERRNVPHGLFRVRUJ
 726 técnica más empleada, los plásmidos recombinantes se agregan a
Mutante cuyo
un cultivo bacteriano tratado previamente con iones de calcio.
DNA contiene
Cuando se somete a un breve choque térmico, estas bacterias se dos sitios EcoR1
estimulan para captar el DNA de su medio circundante. Por lo
CAPÍTULO 18 ӝ Técnicas en biología molecular y celular

general, sólo un pequeño porcentaje de células son competentes

para recoger y retener una de las moléculas plasmídicas recombi-
nantes. Una vez que se adquiere, el plásmido se replica de forma Extraer DNA,
tratar con
autónoma dentro del receptor y se transmite a la progenie duran-
EcoR1
te la división celular. Aquellas bacterias que contienen un plásmi-
do recombinante pueden seleccionarse entre las demás haciendo
crecer las células en presencia del antibiótico al que uno o más
genes confieren resistencia en el plásmido.
Comenzamos esta discusión con el objetivo de aislar un pe-
queño fragmento de DNA que contiene la secuencia del gen de la 1 2 3
insulina. Hasta este punto, hemos formado una población de bac-
terias que contienen muchos plásmidos recombinantes diferen- Separar los
tes, muy pocos de los cuales contienen el gen que se está buscan- fragmentos,
do (como en la figura 18-42). Uno de los grandes beneficios de la descartar la
sección media
clonación del DNA es que, además de producir grandes cantida-
des de DNA particulares, permite separar diferentes DNA de una
mezcla. Se señaló anteriormente que las bacterias que contienen 1 3
plásmidos pueden seleccionarse de aquellas sin plásmidos me-
Empalme con
diante el tratamiento con antibióticos. Una vez hecho esto, las
fragmento
células portadoras de plásmidos pueden crecer en baja densidad eucariótico
en las placas Petri, de modo que toda la progenie de cada célula
(un clon de células) permanezca físicamente separada de la pro- ( )
genie de otras células. Debido a que un gran número de plásmi-
dos recombinantes diferentes estaban presentes inicialmente en DNA recombinante
el medio, las diferentes células colocadas en la placa contienen
diferentes fragmentos de DNA extraño. Una vez que las células Empaquetado
que contienen los diversos plásmidos han crecido en colonias se- el DNA
paradas, el investigador puede buscar en las colonias las pocas recombinante en
que contienen el gen que se busca, en este caso, el gen de la in- la cabeza del fago
sulina. La detección se realiza seleccionando colonias individua-
les y expandiendo la población de cada una en tubos de ensayo
que contienen medios. Luego se aísla el DNA plasmídico de las
bacterias en cada tubo de ensayo (a menudo utilizando un “kit”
de purificación preempacado fácil de usar) y se envía para la se-
cuenciación del DNA.
Bacterias huésped
infectadas
CLONACIÓN DE DNA EUCARIÓTICOS EN LOS Placa clara
Césped
GENOMAS DE LOS FAGOS Un vector de clonación bacteriano del fago
menos común es el bacteriófago lambda, que se muestra en la
FIGURA 18-43. El genoma lambda es una molécula de DNA lineal
de doble cadena de aproximadamente 50 kb de longitud. La cepa
modificada utilizada en la mayoría de los experimentos de clona-
ción contiene dos sitios de escisión para la enzima EcoR1, que Placa de cultivo
fragmenta el genoma en tres segmentos grandes. Conveniente- FIGURA 18-43 Protocolo para la clonación de los fragmentos de DNA
mente, toda la información esencial para la infección y la lisis eucarióticos en el fago lambda. Los pasos se describen en el texto.
celular está contenida en los dos segmentos externos, de modo
que el fragmento intermedio prescindible se puede reemplazar
por un pedazo de DNA eucariótico de hasta aproximadamente 25
kb. Las moléculas de DNA recombinante se pueden empaquetar
in vitro en las cabezas de los fagos, y estas partículas de fagos di-
señadas genéticamente se pueden usar para infectar las bacterias 18.21 Amplificación enzimática
huésped. (Las moléculas de DNA de fago que carecen del inserto del DNA por PCR
son demasiado cortas para ser empaquetadas.) Una vez en una
bacteria, el segmento de DNA eucariótico se amplifica junto con En 1983, Kary Mullis de Cetus Corporation concibió una nueva
el DNA viral y luego se empaqueta en una nueva generación de técnica que se ha utilizado con frecuencia para amplificar frag-
partículas del virus, que se liberan cuando la célula se lisa. Las mentos de DNA específicos sin la necesidad de células bacteria-
partículas liberadas infectan las células nuevas, y pronto se ve un nas. Esta técnica se conoce como reacción en cadena de la po-
punto claro (o placa) en el “césped” bacteriano en el sitio de la limerasa (PCR, polymerase chain reaction). Hay muchos protocolos
infección. Cada placa contiene millones de partículas de fagos, de PCR diferentes utilizados para una multitud de aplicaciones
cada una de las cuales posee una única copia del mismo fragmen- en las que se puede amplificar una gran población de DNA rela-
to de DNA eucariótico. cionados. La amplificación por PCR se adapta fácilmente a las
La clonación del DNA de mayor tamaño en bacterias (como plantillas de RNA convirtiéndolas primero en DNA complemen-
BAC) o levaduras (como YAC) se describe en la página 731. tarios utilizando transcriptasa inversa.

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