TECNOLOGIA DEL

DNA
RECOMBINANTE

PROFESOR DR. BERNARDO PRADO

OBJETIVOS DE LA CLASE

• Conocer los fundamentos de la tecnología del DNA recombinante

• Describir las herramientas más importantes de esta tecnología.
• Conocer algunas de sus aplicaciones.
BIOTECNOLOGIA VEGETAL

• Preguntas Orientadoras
• 1. ¿Sabían ustedes que la insulina, hormona que regula los niveles de azúcar
en la sangre es producida a nivel industrial por una bacteria que vive en su
intes=no?
• 2. ¿Algún par=cipante puede decir que es la ingeniería gené=ca?
• 3. ¿Sabían ustedes que pequeños segmentos de DNA pueden ser aislados
secuencias modificados y transferidos de un organismo a otro.?
TECNOLOGIA DEL DNA
RECOMBINANTE
• La moderna era de la biotecnología comenzó
cuando se desarrollaron las técnicas de clonación
del DNA.
• Empezando en la década de los setenta del siglo
XX y conInuando durante las tres décadas
siguientes, las técnicas de laboratorio sobre
tecnología de DNA recombinante e ingeniería
gené4ca, sorprendentes y de rápido desarrollo,
han cambiado para siempre la biología molecular,
la ciencia básica y la invesIgación médica.
TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE
• Un grupo de inves.gadores estudió la estructura del DNA y su replicación en bacterias y
en bacteriófagos.
• Los bacteriófagos, a menudo simplemente denominados fagos, son virus que infectan las
células bacterianas.
• Gran parte de lo que conocemos sobre la replicación del DNA y sobre las enzimas que
sinte.zan DNA se ha aprendido mediante el estudio de las bacterias y los fagos.
• Por ejemplo, una enzima clave en la replicación del DNA se denomina DNA ligasa.
• Recuérdese que la ligasa une fragmentos adyacentes de DNA (fragmentos de Okazaki)
durante la replicación del DNA.
• La DNA ligasa es una enzima importante en la tecnología del DNA recombinante.
TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE
• Bacterias como la Escherichia coli, que están presentes de manera natural en los
intes.nos de los animales, incluyendo a los humanos, han desempeñado un papel
importante como organismos modelo para los estudios de gené.ca y biología molecular.
• E. coli sigue siendo un organismo favorito para muchos experimentos de laboratorio de
biotecnología.
• A finales de la década de los sesenta, muchos cienPficos estaban interesados en la
clonación de genes y especularon que seria posible clonar DNA cortando y pegando DNA
de diferentes orígenes (la tecnología del DNA recombinante).
• En cuanto comiences a saber más sobre biotecnología, te parecerá́ que clonación de
genes, tecnología del DNA recombinante e ingeniería gené;ca describen el mismo
proceso.
TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE

La palabra clon deriva de un termino griego que

hace referencia a un corte (a un esqueje) que se
u:liza para propagar o copiar una planta.
Una definición biológica moderna de un clon es
una molécula, célula u organismo que ha sido
producido a par:r de otra en:dad única.
ENZIMAS DE RESTRICCION Y PLASMIDOS O
VECTORES DE DNA

• Las enzimas de restricción son enzimas cortadoras de DNA y el plásmido de DNA es una forma
circular de DNA autorreplicante que los cien:ficos pueden manipular para transportar y clonar
otros trozos de DNA.
• En 1970, trabajando con bacterias Haemophilus influenzae, el invesFgador Hamilton Smith, de la
Universidad Johns Hopkins, aisló HindIII, la primera enzima de restricción que pudo ser bien
descrita y uFlizada para la clonación del DNA.
• Las enzimas de restricción se denominan también endonucleasas de restricción (endo = «dentro
de», nucleasa = «enzima cortadora de ácido nucleico») ya que cortan dentro de las secuencias de
DNA en oposición a las enzimas que cortan a parFr de los extremos de las secuencias de DNA
(exonucleasas).
• Smith demostró́ que HindIII se podría uFlizar para cortar o digerir DNA en fragmentos menores.
ENZIMAS DE RESTRICCION Y PLASMIDOS O
VECTORES DE DNA
• Las enzimas de restricción se encuentran sobre todo en las bacterias y se les da nombres
abreviados basados en los nombres del género y especie de las bacterias a par.r de las
que se aíslan.
• Por ejemplo, una de las primeras enzimas de restricción en ser aislada, EcoRI, se
denomina así ́ porque se descubrió́ en una cadena de E. coli llamada RY13.
• Las enzimas de restricción cortan el DNA rompiendo el enlace fosfodiéster (en el eje
azúcar fosfato) que une los nucleó.dos adyacentes en una cadena de DNA.
• Sin embargo, las enzimas de restricción no cortan el DNA al azar, ni todas las enzimas de
restricción cortan el DNA en los mismos si.os.
• Como las demás enzimas, las enzimas de restricción muestran ser específicas de
determinados sustratos.
ENZIMAS DE RESTRICCION Y PLASMIDOS O
VECTORES DE DNA
• Para estas enzimas, el sustrato es el DNA. Como se muestra en la Figura
3.1a, las enzimas de restricción se unen al DNA, reconocen y cortan
(digieren) en secuencias especificas de bases denominadas secuencias de
reconocimiento o posición de restricción.
• A las enzimas de restricción se las conoce normalmente como cortadoras
de cuatro o de seis pares de bases porque reconocen Cpicamente
posiciones con una secuencia de cuatro o seis nucleóDdos.
• También se han idenDficado cortadoras de ocho pares de bases.
• Estas secuencias de reconocimiento son palíndromos: la disposición de los
nucleóDdos se lee del mismo modo hacia delante y hacia atrás de las
hebras opuestas de una molécula de DNA.
ENZIMAS DE RESTRICCION Y PLASMIDOS O
VECTORES DE DNA
• Algunas enzimas de restricción como la EcoRI cortan el DNA para construir fragmentos
de DNA con extremos sobresalientes de una sola hebra denominados extremos
cohesivos o «pegajosos» (ver Fi- gura 3.1a); otras enzimas construyen fragmentos con
extremos no sobresalientes de doble hélice denominados extremos romos.
• La Tabla 3.1 muestra algunas enzimas de restricción comunes, sus microorganismos de
origen y sus secuencias de reconocimiento.
• Hay que tener en cuenta que las tres primeras enzimas de la tabla son cortadoras de seis
pares de bases que producen moléculas de DNA con extremos cohesivos.
• La cuarta enzima (TaqI) es una cortadora de cuatro pares de bases que produce
extremos cohesivos, y las tres ul.mas enzimas producen fragmentos de DNA con
extremos romos.
• Las enzimas que producen extremos cohesivos a menudo se prefieren a las cortado- ras
de extremos romos en muchos experimentos de clonación porque los fragmentos de
DNA con extremos cohesivos se pueden unir más fácilmente entre sí.
ENZIMAS DE RESTRICCION Y PLASMIDOS O
VECTORES DE DNA
• El DNA de cualquier fuente, como bacterias, humanos, perros, gatos, ranas, dinosaurios o
anFguos restos humanos se puede digerir por una enzima de restricción parFcular siempre que el
DNA tenga una posición de restricción para esa enzima.
• En el senFdo más simple, el descubrimiento de las enzimas de restricción dotó a los biólogos
moleculares de las «Fjeras» necesarias para realizar la clonación de genes.
• Se puede encontrar plásmidos de DNA principalmente en bacterias.
• Los plásmidos se consideran DNA extracromosómico porque están presentes en el citoplasma
bacteriano a parte del cromosoma bacteriano.
• Los plásmidos son pequeños y autoreplicantes (se duplican con independencia del cromosoma
bacteriano).
• Cohen estudió la replicación de los plásmidos, la transferencia de plásmidos entre bacterias y los
mecanismos de la resistencia bacteriana a los anFbióFcos.
ENZIMAS DE RESTRICCION Y PLASMIDOS O
VECTORES DE DNA
• Cohen postulaba que se podía u1lizar a los plásmidos como vectores, partes de DNA que pueden
aceptar, transportar y replicar (clonar) otras partes de DNA.
• Cohen y Boyer trabajaron con dos plásmidos bacterianos para clonar DNA con éxito
• U1lizando EcoRI, una enzima de restricción previamente aislada por Herbert Boyer, cortaron ambos
plásmidos y después unieron frag- mentos de cada plásmido u1lizando DNA ligasa para crear nuevos
plásmidos híbridos (recombinantes).
• Recuerda que la DNA ligasa cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre nucleó1dos.
• La ligasa puede unir el DNA con extremos cohesivos así ́ como fragmentos de extremos romos.
• Como resultado de este y de otros experimentos, Cohen y Boyer produjeron el primer vector plásmido
para fines de clonación, denominado pSC101 y bau1zado como «SC» por Stanley Cohen.
• pSC101 contenía un gen de resistencia a las tetraciclinas y si1os de restricción para varias enzimas
incluyendo EcoRI y Hin-dIII.
ENZIMAS DE RESTRICCION Y
PLASMIDOS O VECTORES DE
DNA

• En trabajos posteriores u.lizaron

experimentos similares para clonar
DNA de la rana sudafricana de uñas
Xenopus laevis (otro organismo
modelo importante en gené.ca y en
biología del desarrollo) en el si.o
EcoRI de pSC101.
• La Figura 3.2 ilustra como se puede
formar DNA recombinante en un
proceso similar al u.lizado en los
experimentos de Cohen y de Boyer.
ENZIMAS DE RESTRICCION Y PLASMIDOS O
VECTORES DE DNA

• En 1974, como resultado directo de los experimentos de Berg, Cohen y Boyer,

los pioneros de la clonación de genes y los crí.cos de la clonación expresaron
su inquietud por la seguridad de los organismos modificados gené.camente.
• A los cienPficos les preocupaba lo que podría ocurrir si las bacterias
recombinantes abandonaran el laboratorio o si esas bacterias pudieran
transferir sus genes a otras células o sobrevivir en otros organismos in-
cluyendo a los seres humanos.
• En 1975, un grupo invitado de conocidos biólogos moleculares, virólogos,
microbiólogos, abogados y periodistas se reunió́ en el Centro de Conferencias
Asilomar en Pacific Grove, California, para discu.r los beneficios y los peligros
potenciales que entraña la tecnología del DNA recombinante.
ENZIMAS DE RESTRICCION Y PLASMIDOS O
VECTORES DE DNA

• Como resultado de la histórica reunión en Asilomar, los InsItutos

Nacionales de Salud (Na4onal Ins4tutes of Health, o NIH) crearon el
Comité́ Asesor del DNA Recombinante (Recombinant DNA Advisory
CommiBee, o RAC), encargado de la evaluación de los riesgos de la
tecnología del DNA recombinante y del establecimiento de directrices
para su invesIgación.
• En 1976, el RAC publicó un conjunto de directrices para trabajar con
organismos recombinantes.
• El RAC conInúa supervisando la invesIgación en el campo de la
clonación de genes y el cumplimiento de sus directrices es obligatorio
para los cienSficos que trabajan con organismos recombinantes.
Tecnología del DNA recombinante

• Hay cuatro áreas principales en las cuales la tecnología del DNA

recombinante es de gran uIlidad:

• InvesIgación básica de la estructura y función de los genes.

• IdenIficación y mapeo de genes
• Nuevos métodos de producción de proteínas úIles.
• Producción de plantas y animales transgénicos.
Introducción a la clonación de genes humanos

• Las enzimas de restricción, la DNA ligasa y los plásmidos son las

herramientas principales que Ienen los biólogos moleculares para
manipular y clonar genes provenientes de casi cualquier fuente.
• Con el descubrimiento de la transformación, los cienSficos encontraron
un modo de introducir DNA recombinante en las células bacterianas.
• La tecnología del DNA recombinante hizo posible cortar y unir casi
cualquier fragmento de DNA con otros, insertar DNA en un plásmido (se
suele llamar al DNA clonado en un plásmido DNA «insertado») y
producir grandes canIdades del DNA insertado haciendo que las
bacterias se conviertan en las besIas de carga de la replicación del DNA
recombinante.
Introducción a la clonación de genes humanos
• Si el fragmento de DNA clonado es un gen que codifica un producto proteico, se podrían
u.lizar las células bacterianas para sinte.zar el producto proteico del gen clonado.
• A esto lo llamamos «expresar» una proteína.
• Los biólogos moleculares reconocieron que si se pudieran clonar y expresar los genes
humanos, la tecnología del DNA recombinante se conver.ría en una herramienta muy
valiosa con poderosas y emocionantes aplicaciones en inves.gación y medicina.
• Como se puede hacer crecer a las bacterias en preparaciones a gran escala, los cienPficos
pueden producir grandes can.dades del DNA clonado y aislar can.dades de proteínas
que normalmente sería muy digcil o caro purificar sin clonarlas.
• Como resultado de la tecnología del DNA recombinante, se puede producir un gran
abanico de valiosas proteínas a par.r de genes clonados que, de otro modo, seria muy
digcil obtener
Introducción a la clonación de genes humanos

• Los genes humanos se pueden clonar en plásmidos de DNA y replicarlos

en bacterias uIlizando la tecnología del DNA recombinante.
• El primer producto genéIco humano de esta tecnología disponible
comercialmente fue la insulina humana, una hormona pepSdica
producida por células del páncreas llamadas células beta.
• Cuando suben los niveles de glucosa en sangre, por ejemplo, tras haber
ingerido una comida rica en azúcares, la insulina baja el nivel de glucosa
en sangre esImulando el almacenamiento de glucosa en el hígado y en
las células musculares en forma de largas cadenas de glucosa llamadas
glicógeno.
Introducción a la clonación de genes humanos

• Poco después de que la insulina se pusiera a disposición, se clonó la hormona de

crecimiento (u1lizada para tratar niños que sufren de una variedad de enanismo) y, debido
a la tecnología del DNA recombinante, una gran variedad de otras proteínas de importancia
médica que en su día habían sido diWciles de obtener en can1dades adecuadas, se
pudieron poner a disposición.
• Antes de la tecnología del DNA recombinante, hormonas importantes como la insulina y la
hormona de crecimiento se tuvieron que aislar de los tejidos.
• La hormona de crecimiento se aisló́ de las glándulas pituitarias de los cadáveres humanos.
• Este proceso no sólo era caro e ineficaz, sino que estos aislamientos también conllevaban el
riesgo de contaminar con virus desconocidos y otros patógenos a las personas que recibían
la hormona.
• Ahora hay varios cientos de productos de tecnología de DNA recombinante en el mercado
con muchas aplicaciones en inves1gación básica, medicina y agricultura.
Vectores de clonación

• Los plásmidos siguen siendo los vectores de clonación más uIli- zados.
• Son populares porque permiten la clonación y manipulación ruInaria de
trozos pequeños de DNA que forman la base de muchas técnicas
uIlizadas a diario en un laboratorio de biología molecular.
• Además, es bastante sencillo transformar células bacterianas con DNA
plasmídico y relaIvamente sencillo aislar DNA plasmídico de cé- lulas
bacterianas.
• Uno de los primeros vectores de DNA plasmídico, denominado pBR322,
se diseñó́ para tener genes de resistencia a la ampicilina y a la
tetraciclina y varios siIos de restricción úIles.
CaracterísCcas prácCcas de los vectores de
clonación del DNA

• Los modernos vectores de clonación del DNA

plasmídico suelen incluir la mayoría de las siguientes
caracterísIcas deseables y pracIcas:
• Tamaño
• Origen de replicación
• SiIo de clonación múlIple
• Genes marcadores que se puedan seleccionar
• Secuencias del promotor de RNA polimerasa
• Secuencias de cebadores (primers u
oligonucleóIdos)
 • Muchas estrategias de clonación comienzan
BIBLIOTECAS preparando una biblioteca de DNA.
• Las bibliotecas son colecciones de fragmentos de
DE DNA: DNA clonados de un organismo par.cular
contenidos dentro de bacterias o virus como
hospedadores.
construir una • Las bibliotecas pueden almacenarse durante
períodos rela.vamente largos de .empo y
colección de «rastrearse» para elegir diversos genes de interés.
• Se suelen u.lizar dos .pos de bibliotecas para la
genes clonación: las bibliotecas de DNA genómico y las
bibliotecas de DNA complementario (bibliotecas

clonados
de cDNA).
• La Figura 3.5 muestra cómo se construyen ambos
.pos de bibliotecas.
REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA PCR
PCR

• Aunque las bibliotecas son muy efecIvas y muy

uIlizadas para clonar e idenIficar un gen de interés, la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un
enfoque mucho más rápido para clonar que construir y
rastrear una biblioteca.
• La PCR es, a menudo, la técnica elegida.
• Desarrollada a mediados de la década de los ochenta
del siglo XX por Kary Mullis, la PCR resultó ser una
técnica revolucionaria que ha tenido gran impacto en
muchas áreas de la biología molecular.
• Mullis ganó el Premio Nobel de Química por su invento.
PCR

• La PCR es una técnica para hacer copias o amplificar una secuencia

específica del DNA en un corto período de 1empo.
• El concepto que hay detrás de una reacción de PCR es increíblemente
sencillo.
• Aquí, se añade el DNA diana que se desea amplificar a un tubo de
paredes finas y se mezcla con desoxirribonucleó1dos (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP), solución tampón (o buffer) y DNA polimerasa.
• Se añade a la mezcla una pareja de primers.
• Los primers son oligonucleó1dos cortos de DNA de cadena simple que
suelen tener una longitud de 20 a 30 nucleó1dos.
• Estos primers, u oligonucleó1dos, son complementarios de los que
flan- quean los extremos opuestos de la secuencia del DNA diana que
se desea amplificar (ver Figura 3.7).
PCR
• el tubo de reacción se coloca en un instrumento llamado termociclador.
• En esencia, un termociclador es un sofisFcado bloque de calentamiento capaz de cambiar la
temperatura muy rápidamente en intervalos de Fempo muy breves.
• El termociclador toma la muestra mediante una serie de reacciones llamadas ciclo de PCR (Figura
3.7).
• Cada ciclo consiste en tres fases.
• En la primera, llamada desnaturalización, se calienta el tubo de reacción hasta entre 94 oC y 96 oC
aproximadamente, causando la separación del DNA diana en cadenas sim- ples.
• En la segunda fase, llamada hibridación (o anillamiento), se enfría ligeramente el tubo hasta entre
50 oC y 65 oC, lo que permite que los primers (u oligonucleóFdos) creen enlaces de hidrogeno
con las bases complementarias situadas a extremos opuestos de la secuencia diana
 • Durante el alargamiento, la úl.ma fase del ciclo de
PCR, la temperatura se suele elevar un poco (a
unos 70 oC o 75 oC) y la DNA polimerasa copia el
DNA diana uniéndose a los extremos 3’ de cada
cebador (también llamado primer u
oligonucleó.do) u.lizando éstos como moldes.
• La DNA polimerasa añade nucleó.dos al extremo
PCR 3’ de cada oligonucleó.do para sinte.zar una
cadena complementaria.
• Al final de cada ciclo, la can.dad de DNA diana se
ha duplicado.
• El termociclador repite estas tres fases de nuevo
según el número total de ciclos determinado por el
inves.gador, que suele ser de 20 o 30 ciclos.
PCR
• Una clave del ciclo es el .po de DNA polimerasa que se u.liza en la reacción.
• Los calentamientos y enfriamientos repe.dos necesarios para la PCR desnaturalizarían y
destruirían la mayoría de las DNA polimerasas después de unos pocos ciclos.
• Disponemos de varias fuentes de DNA polimerasas adecuadas para el ciclo de PCR.
• Una de las primeras y más populares enzimas para la PCR es conocida como la Taq DNA
polimerasa.
• Taq se aísla de la arquea denominada Thermus aqua;cus, una especie que prospera en
manan.ales de agua caliente.
• Debido a este hábitat al que T. aqua;cus está, su DNA polimerasa ha evolucionado hasta
poder aguantar altas temperaturas (ese .po de microbios recibe el nombre de termófilos
por su capacidad para sobrevivir a altas temperaturas.
PCR

• Como Taq es estable a altas temperaturas, puede aguantar los cambios

de temperatura necesarios para el ciclo de PCR sin desnaturalizarse.
• En 1989, la revista Science nombró a la polimerasa de Taq Molécula del
Año.
• La gran ventaja de la PCR es su capacidad para amplificar millones de
copias del DNA diana a parIr de una canIdad muy pequeña de material
inicial en un corto período de Iempo.
• Como el DNA diana se duplica después de cada ciclo de PCR, después de
unos 20 ciclos se han producido aproximadamente 1 millón de copias
(220) del DNA diana a parIr de una sola molécula.
PCR

• La PCR Iene aplicaciones muy amplias en invesIgación

y medicina, como en la fabricación de sondas de DNA,
el estudio de la expresión génica, la amplificación de
diminutas canIdades de DNA para detectar patógenos
virales e infecciones bacterianas, la amplificación del
DNA para diagnosIcar enfermedades genéIcas, la
detección de canIdades traza de DNA en tejidos para
resolver un crimen e incluso la amplificación de DNA
anIguo a parIr de tejido fosilizado de dinosaurios
(Figura 3.8).