MÓDULO: MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

HORAS: 168 h.

UNIDAD 4: Aplicación de técnicas de aislamiento y

recuento de microorganismos.
 Microbiología clínica.
4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

ÍNDICE DE CONTENIDOS

INTRODUCCIÓN 3

OBJETIVOS 4

DESARROLLO DE CONTENIDOS 5

1. CONSIDERACIONES PREVIAS 5

2. LA INCUBACIÓN 5

3. LA SIEMBRA 7

3.1. MATERIAL DE SIEMBRA 7

3.2. TÉCNICAS DE SIEMBRA 10
3.2.1. TÉCNICA DE INOCULACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO 11
3.2.2. TÉCNICAS DE SIEMBRA EN PLACA 12

4. DESCRIPCIÓN MACROSCÓPICA DE LOS CULTIVOS 16

5. TÉCNICAS DE DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO. 17

IDEAS CLAVE DE LA UNIDAD 21

BIBLIOGRAFÍA 22

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 Microbiología clínica.
4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

INTRODUCCIÓN

En general, para la determinación de la presencia de un microorganismo en una

muestra concreto debe realizarse su cultivo. De esta forma, se obtendrán un número
de células suficiente para ver si el microorganismo de estudio está presente o no en
la muestra y poder hacer su recuento. Como ya sabes, los medios de cultivo
estudiados en la unidad 3 se utilizan para el crecimiento de microorganismos. Sobre
estos se realiza la siembra de la muestra y se procede a su incubación. Para ello, es
muy importante que el medio esté esterilizado y bien almacenado.

¿SABÍAS QUÉ?

Aunque hay varios métodos de esterilización (horno

Pasteur, radiación ionizante, óxido de etileno, aldehídos,
etc.), el de uso más común en microbiología es la
autoclave. Si te interesa saber cómo funciona pincha en el
siguiente enlace:
https://www.tplaboratorioquimico.com/laboratorio-quimico/materiales-e-
instrumentos-de-un-laboratorio-quimico/autoclave-de-laboratorio.html

En el laboratorio de microbiología, se debe conocer el protocolo de trabajo y aplicarlo

de una manera estricta, puesto que existen muestras que para su extracción
necesitan de intervenciones quirúrgicas o aplicar técnicas invasivas, lo que hace más
complicado obtener una nueva muestra en caso de desechar la recibida con
anterioridad.
Para el estudio de los microorganismos presentes en los diferentes tipos de muestras,
se debe tener en cuenta que no se encuentran aislados de manera general. Las
poblaciones son mixtas, por lo que para el estudio e identificación es necesario
separarlos del resto para poder realizar cultivos puros.

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

OBJETIVOS
Los objetivos de aprendizaje de esta unidad son los siguientes:
● Identificar las diferentes técnicas de siembra.
● Conocer las técnicas existentes para inocular microorganismos.
● Saber cómo realizar un correcto aislamiento bacteriano.
● Utilizar las estufas de incubación.
● Reconocer las características macroscópicas de un cultivo.

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

DESARROLLO DE CONTENIDOS
1. Consideraciones previas
El procesamiento de una muestra comienza en el momento de llegada al laboratorio.
Se debe valorar si una muestra es aceptada o no, comprobando el volante de petición
que debe de traer consigo, si la calidad de la muestra es aceptable al igual que su
volumen y si la forma de recogida y de transporte son las adecuadas.
Es de vital importancia identificar la muestra de manera correcta, comprobando que
los datos contenidos en la hoja de petición correspondan con la etiqueta que
presenta la muestra.
También debemos de tener en cuenta los siguientes aspectos:
1. Las muestras deben ser trabajadas en el momento de la recepción. Si esto no
es posible se deben de conservar refrigeradas a 40 C y procesarse antes de 24
horas. Si las muestras están estériles no necesitan refrigeración, como el
líquido cefalorraquídeo o las biopsias.
2. Las muestras sólidas se deben homogeneizar con solución salina, teniendo en
cuenta que no debe diluirse en exceso.
3. Las muestras respiratorias (esputos) pueden diluirse con acetilcisteína, ya que
no interfiere en la calidad de los microorganismos presentes.
4. Los líquidos biológicos, de manera general están más diluidos, por lo que se
recomienda la centrifugación antes de su procesamiento.
5. Los medios de cultivo deben estar a temperatura ambiente antes de realizar
la siembra.

2. La incubación
En la naturaleza, las aves incuban los huevos calentándolos con su cuerpo ¿verdad?
De la misma forma, se dice que estamos incubando una enfermedad cuando el
microorganismo en cuestión está en nuestro interior reproduciéndose. Como podrás
deducir, en ambos casos es fundamental la temperatura. En el laboratorio de
microbiología es igual o más importante si cabe, ya que, sin la temperatura adecuada,
difícilmente podrán crecer los microorganismos de interés. En la unidad 2 se
estudiaron los tipos de microorganismos en base al rango de temperatura en el que
pueden desarrollarse, siendo la temperatura óptima los 37ºC, en la mayor parte de
los casos.
Igualmente hay otras condiciones de incubación a tener en cuenta, como la
humedad, el uso de agitación, la luz o la presencia/ausencia de oxígeno.

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

IMPORTANTE
La incubación es el periodo de tiempo comprendido entre la siembra del
microorganismo y la lectura de los resultados. La siembra es el paso de las bacterias
que contiene una muestra a un medio de cultivo, permitiendo el crecimiento y la
multiplicación de los microorganismos.

Los tipos de atmósferas y las condiciones que necesitan los microorganismos para
crecer no son para todos los mismos. La incubación en base a los requerimientos de
oxígenos puede ser aeróbica o anaeróbica.
La incubación aeróbica necesita presencia de oxígeno. En este tipo de estufas es
necesario generar un ambiente húmedo, puesto que ayuda en el proceso de
crecimiento. Así pues, se coloca una bandeja con agua en una zona de la estufa donde
no esté en contacto directo con las placas. La humedad puede generar también la
formación de otros microorganismos, como hongos, los cuales pueden contaminar
los cultivos. Por ello, es imprescindible limpiar y mantener la estufa en condiciones
óptimas.
La atmósfera de algunas estufas aerobias puede estar enriquecida con un porcentaje
de dióxido de carbono (5-7%).
En cuanto a la incubación anaeróbica, es necesaria la ausencia de oxígeno. Las placas
se introducen dentro de jarras (ver imagen 1) o bolsas de plástico y se introduce un
sobre que produce hidrógeno y dióxido de carbono y debido a ciertas reacciones
químicas consigue eliminar el oxígeno y producir agua.

Imagen 1: Jarra de anaerobiosis. Fuente:

http://www.laboquimia.es/catalogo/producto.php?codigo=2004AG0025A

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

La temperatura de las estufas es de 370 C, pudiendo oscilar entre los 35 y los 370 C.
Sin embargo, algunos microorganismos concretos, necesitan otra temperatura para
su crecimiento óptimo, como el Campylobacter spp. que necesita una temperatura
de 420C, la Yersinia enterocolitica que necesita una temperatura de 200 C y la Listeria
spp. que necesita una temperatura entre 25 y 350 C. Los hongos también se incuban
en estufas que necesitan una temperatura de 300 C.
Para realizar una buena técnica se debe conocer los medios de cultivo, estudiados en
la unidad didáctica anterior, el material utilizado para la siembra y los diferentes
métodos de siembra.

3. La siembra
Para la siembra se debe asegurar la esterilidad del material, adoptar los dispositivos
de protección individual pertinentes (guantes, mascarilla, bata, etc.) y hacerse
preferentemente en cabina. La siembra se puede realizar depositando la muestra
mediante un hisopo, una pipeta o un asa, que se introducen en el tubo de medio
líquido, semisólido o placa de Petri.

3.1. Material de siembra

En cuanto al material de siembra, encontramos diferentes formatos:
● Asas en argolla o anillo: Se utilizan para sembrar el microorganismo problema
en un medio de cultivo. Las asas tradicionales son de metal y reutilizables (ver
imagen 2), las cuales se deben esterilizar con la llama del mechero (flameado),
antes y después de su uso, sujetándose en posición vertical. También existen
asas de un solo uso, las cuales se encuentran esterilizadas y son de plástico.
Asimismo, las asas pueden estar calibradas o no. En el caso de que estén
calibradas, las más usadas son las de 1 y 10 µL (ver imagen 3).

Imagen 2: Asas de alambre reutilizable sin calibrar. Fuente:

https://es.vwr.com/store/product/547870/asas-de-siembra-combo-loops

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

Imagen 3: Asas de siembra desechables de 1 y 10 µL. Fuente: www.pidiscat.cat

● Asa recta: Llamada también hijo de siembra o aguja. Se utiliza para sembrar
una sola colonia (ver imagen 4).

Imagen 4: Asa en hilo. Fuente:

http://elblogsbuts.blogspot.com/2014/10/clases-de-asas-
1.html

● Asa Drigalsky: ideal para sembrar muestras líquidas. Se trata de una varilla,
generalmente de vidrio, la cual posee una rama horizontal con forma de
espátula, con la que se arrastra el inóculo por la superficie del medio de
cultivo. Son reutilizables y se esterilizan en autoclave o por calor seco (ver
imagen 5).

Imagen 5: Asa Drigalsky. Fuente: https://comerciallabor

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

● Pipetas: Se utilizan para sembrar muestras líquidas de microorganismo

problema en un medio de cultivo. Pueden ser pipetas Pasteur (ver imagen 6),
que inoculan un volumen variable, o pipetas calibradas, para un volumen
concreto.

Imagen 6: Pipeta Pasteur. Fuente:

www.pidiscat.cat

● Hisopos: Se utiliza para la toma de muestras de origen biológico. Son

desechables y estériles (ver imagen 7).

Imagen 7: Pipeta Pasteur. Fuente:

http://rcostoya.com/uploads/contenidos_usrs/originales/21
_fungible_microbiologia_20160711091951.pdf

.
El siguiente paso es seleccionar los medios de cultivo necesarios para cada una de las
muestras, lo cual se encuentra recogido en el protocolo de cada laboratorio.
La identificación de los medios de cultivo, indicando el tipo de muestra, el número de
identificación y los datos del paciente, se realiza a través de las etiquetas de códigos
de barras que genera el programa informático cuando se recibe la muestra en el
laboratorio. Por lo que cada medio, deberá llevar la etiqueta y si es necesario algún
dato adicional (se puede escribir en la parte exterior de la placa de cultivo con un
rotulador).

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

3.2. Técnicas de siembra

Sembrar o inocular es el acto de colocar la muestra microbiana en el medio de cultivo
para promover su desarrollo y multiplicación.

IMPORTANTE
En microbiología llamaremos inóculo a la pequeña cantidad de muestra que
vayamos a sembrar.

Las siembras pueden ser primarias (cuando el material es inoculado en los medios
por primera vez) o secundarias (cuando el material a inocular procede de una siembra
primaria). Un ejemplo de ello sería la siembra por dilución, en la cual tenemos una
solución madre, a partir de la cual se harían diluciones seriadas. Cada dilución se
sembrará con asa Drigalsky en una placa Petri (ver imagen 8). Esta técnica es utilizada
para aislar colonias.

Imagen 8: Siembra por dilución. Fuente:

https://bio.libretexts.org/Bookshelves/Microbiology/Microbiology_(OpenStax)/09%3A_Microbial_Gr
owth/9.01%3A_How_Microbes_Grow

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

La siembra puede realizarse por diferentes métodos atendiendo a si realiza en medio

sólido, líquido o semisólido; así como las características que queremos observar.

3.2.1. Técnica de inoculación en medio líquido

Es útil para fomentar el crecimiento de los microorganismos, puesto que en estos
medios tienen mayor acceso a los nutrientes que necesitan para desarrollarse.
La técnica se realiza de la siguiente forma:
1. Abrir el tubo con la misma mano con la que se sujeta el asa de siembra,
quedando este sujeto entre el dedo el meñique y la mano; o entre el dedo
meñique y el dedo anular.
2. Mantener en posición ligeramente ladeada, para que no puedan entrar
contaminantes.
3. Introducir el hisopo o el asa de siembra que contiene la muestra. Para
muestras sólidas se tomará el inóculo con el asa de siembra y para muestras
líquidas se puede verter unas gotas con una pipeta Pasteur o usar un hisopo.
4. Flamear la boca del tubo y cerrarlo.

¿SABÍAS QUÉ?

El cultivo en medio líquido habitualmente se realiza en tubos, frascos o Erlenmeyer.

En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto, no sirven
como técnica de aislamiento. Los medios líquidos permiten obtener un elevado
número de microorganismos, para ser utilizados posteriormente (por ejemplo, para
sembrar en placa, como puede observarse en la imagen 8). En los cultivos en medio
líquido lo que se puede analizar es la existencia de enturbiamiento, la formación de
una película sobre la superficie y la aparición de sedimento en el fondo del tubo, entre
otras cosas.

VÍDEO RECOMENDADO:
El siguiente vídeo abarca el cultivo en medio líquido con distintos tipos
de materiales de siembra:
https://www.youtube.com/watch?v=VO6XAd56AuM

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

3.2.2. Técnicas de siembra en placa

Estas técnicas se realizan en medios de cultivo sólidos y se plantea con dos objetivos:
el aislamiento de colonias y el recuento de microorganismos. Existen diferentes tipos:

• Siembra en estría por agotamiento: técnica de aislamiento de

microorganismos en una placa Petri. Es la técnica más utilizada en
microbiología, puesto que con esta se observa el crecimiento de las colonias
de una muestra, pudiendo ser homogénea (un solo tipo de colonia) o
heterogénea (varios tipos).
Se deposita el inóculo en la parte superior de la placa, denominándose
impronta, y se siembra realizando estrías de lado a lado sin llegar hasta el
centro de la placa, creando el primer campo de siembra. De la última estría
del primer campo y girando la placa 900, se repite la operación. Se realiza esta
operación un par de veces más, tal y como se muestra en la placa izquierda
de la imagen 9. Hay otros patrones por estría, como se puede observar en los
otros ejemplos de la misma imagen.
Tras la siembra, se incuba la placa y las células comienzan a dividirse y a
formar colonias. Con esta técnica conseguimos aislar las colonias de los
microorganismos existentes en la muestra. La siembra se puede realizar
utilizando la muestra original o a partir de una colonia aislada obtenida en una
siembra anterior.

Imagen 9: Patrones de siembra por estría. Fuente: https://theory.labster.com/streaking-es/

VÍDEO RECOMENDADO:
Siembra por estría:
https://www.youtube.com/watch?v=6NckVGCobwY&t=61s

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• Siembra por estría en agar inclinado: Se siembra el material en la superficie

del agar inclinado en tubo de ensayo (ver imagen 10). Allí se extiende por toda
la superficie con el asa bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con
el material a sembrar, haciendo estrías no muy amplias, pero tampoco muy
estrechas. Se inicia por la parte más profunda de la superficie inclinada y se
termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo.

Imagen 10. Siembra por estría en agar inclinado, con asa recta. Fuente:
https://mediateca.educa.madrid.org/reproducir.php?id_imagen=376z2nfjrrswn9hl

• Siembra en picadura: También llamada siembra por punción. Con un hilo de

siembra se toma el material que se quiere sembrar y se introduce en el tubo,
con medio semisólido. Introducir la aguja hasta el fondo, formando un canal
de punción, el cual utilizaremos para retirar el asa (ver imagen 11). Este
método se utiliza para estudiar la movilidad de las bacterias.

Imagen 11: Siembra por picadura. Fuente:

https://espanol.libretexts.org/Biologia/Microbiolog%C3%ADa/Manual_de_microbiolog%C3%A
Da_general/04%3A_Metodos_de_siembra_y_cultivo_de_microorganismos/4.02%3A_Cultivos_
en_medios_solidos

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

INFORMACIÓN DE INTERÉS:

La siembra por picadura y estría se pueden combinar. Lo podemos utilizar para el

medio TSI (Triple Sugar Iron), el cual contiene glucosa, sacarosa y lactosa, hierro y
rojo de fenol (para identificación de enterobacterias). En este medio sembraremos
por picadura y estría en superficie para estudiar los cambios que ocurrirán en
superficie y profundidad. A lo largo del canal se desarrollan los microorganismos,
y según lo hagan en la parte superior o inferior del tubo, estarán indicando su
comportamiento frente a los azucares. Los microorganismos podrán hacer que el
medio cambie de color y/o produzca gas.

VÍDEO RECOMENDADO
Siembra por picadura y estría:
https://www.youtube.com/watch?v=vWGjs9TDawM

• Siembra por extensión en placa: Para este tipo de siembra se utilizan

muestras líquidas. Por lo tanto, las suspensiones de células microbianas se
diluyen antes de su siembra en placa, mediante diluciones seriadas.
Posteriormente, las muestras se pipetean en una placa Petri y se siembran
directamente en la superficie del agar, con la ayuda de un asa de Drigalsky
(ver imagen 12). Se usa para el recuento de colonias y antibiograma.

• Siembra por vertido en placa: Como en el caso anterior, también partimos de

diluciones seriadas. En esta ocasión, las muestras diluidas se mezclan con agar
fundido. Primero se pipetea la muestra en la placa, luego se vierte el medio y
por último, se mezcla mediante movimientos rotatorios. Algunas colonias
quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias
superficiales se extenderán y serán más grandes (ver imagen 12).

VÍDEO RECOMENDADO.
Siembra por vertido en placa:
https://www.youtube.com/watch?v=fg8oY300cvk

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

Imagen 12: Siembra por extensión (arriba) y por vertido en placa (abajo). Fuente:
https://docplayer.es/79686424-4-crecimiento-microbiano-y-control.html

• Siembra por recuento: Se deposita el inóculo en el centro de la placa y se

realiza una cruz con un asa de siembra o un hisopo, formando cuatro campos.
A continuación, realiza una siembra en estría, desde el centro de la cruz hasta
el extremo de la placa. Después, se gira 90º y se repite la operación hasta que
todos los campos estén cubiertos (imagen 13). Se utiliza para realizar
recuento de colonias.

900

1 2

4 3

Inóculo en Trazar una Recorrer la Repetir el Crecimiento de

el centro de cruz placa desde el paso colonias.
la placa repartiendo el centro hasta el anterior El número de
inóculo por extremo hasta colonias se
toda la placa realizando recorrer los contabiliza en
movimientos de cuatro Unidades
lado a lado campos Formadoras de
Colonias (UFC)

Imagen 13: Siembra por recuento. Fuente: Elaboración propia.

• Método de los cuatro cuadrantes: Imaginamos la placa dividida en 4

cuadrantes (pueden dibujarse por la parte de atrás de la placa). Se inocula la
muestra en el primer cuadrante y se hace una estría. Luego, sin coger

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

muestra, pasamos al segundo cuadrante y así hasta finalizar con todos. El asa
sólo deberá coger muestra 1 vez. Útil para el aislamiento de colonias.
• Por inundación: Se deposita el inóculo de la muestra líquida y se mueve la
placa con movimientos lentos y circulares para que se extienda por la
superficie. Antes de llevarla a incubar es preferible dejar que el medio absorba
parte de la muestra.
• Por goteo: Se deposita una gota de muestra líquida y se espera a que el medio
absorba la muestra antes de llevar a incubación.
• Por rodamiento: Esta técnica se utiliza para la siembra de catéteres. Se corta
el catéter dejando una longitud de 5 cm aproximadamente, y se rueda
empujando la muestra con un asa de siembra por el agar, cubriendo toda la
superficie de la placa.

4. Descripción macroscópica de los cultivos

Tras sembrar la muestra problema en el medio de cultivo e incubar durante un
tiempo prudente (pueden verse a partir de las 18-24 horas), las colonias se observan
como pequeñas masas producidas por el crecimiento de las bacterias. Es importante
tener en cuenta que los microorganismos pueden formar diferentes colonias en
función del medio de cultivo. El aislamiento de las colonias se realiza en medios de
cultivo sólidos para poder tener en cuenta las características de las colonias. Por ello,
se realizará en placas Petri, o en agar inclinado.
Las principales características de las bacterias son:
● Tamaño de las colonias:
■ Pequeñas (puntiformes): ≤ 0,5 mm.
■ Medianas: 1-2 mm de diámetro.
■ Grandes: hasta 4 mm de diámetro.
■ En forma de velo (extendidas por la placa).
• Forma: suele ser redondeada y de apariencia lisa, pero también pueden
mostrarse con aspecto con contorno irregular. En la imagen 14 podemos
observar algunas formas, atendiendo también a su relieve (elevación) y tipo
de borde.

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

Imagen 14: Forma, elevación y borde de las colonias. Fuente:

http://morfologiabacteriana8.blogspot.com/2015/09/superficies-bordes-formas.html

● Consistencia de las colonias: La consistencia y la textura otorgan a la colonia

un aspecto seco (de apariencia rugosa) o húmedo. Pueden aparecer lisas,
viscosas o mucosas, mates o brillantes; pueden ser friables, es decir, que se
rompen fácilmente al tocarlas con el asa; también pueden deslizarse cuando
se empujan con el asa o adherirse firmemente al medio.
• Color y transparencia: el color es debido a los pigmentos, sustancias que
forman las bacterias o sustratos que contengan los medios de cultivo.
También puede indicar pH. En cuanto a la transparencia, puede ser total
(colonias translúcidas), semitransparentes u opacas.
● Halos de transparencia: consecuencia de la hemólisis, tal y como se estudió
en la unidad anterior (imagen 8 de la unidad 3).

5. Técnicas de determinación del crecimiento.

Tras la siembra y la incubación de las placas de cultivo, se comprueba el crecimiento
de estas, pudiéndose medir de las siguientes formas:
● Recuento de viables en placa: En muchos casos conviene contar las células
vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. El
método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones
adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio sólido. Cada
célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado
de incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución
de la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácil deducir el
número de células viables en la suspensión original.

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

Para evitar errores de muestreo es conveniente sembrar 5 placas, de 5

diluciones distintas. Además, deben contarse las placas en las que existan
entre 50 y 300 colonias.

¿SABÍAS QUÉ?
Una célula se define como viable cuando, colocada en un medio adecuado, es capaz
de dividirse y multiplicarse.
Como no se puede garantizar que cada colonia no proceda de más de un individuo
(especialmente en bacterias que forman agrupaciones de 2 o más células), el
recuento no se refiere a células sino a Unidades Formadoras de Colonia (UFC).

● Método Coulter: Es un método automático utilizado principalmente en

hematología, pero también se puede utilizar para contar el número de
bacterias existentes en un volumen determinado.
● Cámara de Neubauer: Se utiliza para contar los microorganismos en un medio
líquido a través del microscopio óptico. Está formada por 9 cuadrados
grandes de 1mm2. El cuadrado grande central está formado por 25 cuadrados
medianos que se observan usando el objetivo de 10 aumentos (10x), cada uno
de ellos formados a su vez por 16 cuadrados pequeños que se observan
usando el objetivo de 40 aumentos (40x). El recuento se realiza en el cuadrado
central o en las esquinas. Está casi en desuso para la microbiología porque las
bacterias vivas no se pueden distinguir de las muertas.

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

Imagen 15: Recuento en cámara de Neubauer Fuente:

http://insilico.ehu.eus/counting_chamber/neubauer_improved.php

● Recuento por filtración de membrana: Se usa para suspensiones diluidas

cuando la cantidad de bacterias es muy baja. Se hace pasar un gran volumen
de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon
estériles, con un diámetro de poro que retiene las bacterias. Posteriormente,
el filtro se deposita sobre la superficie de un medio sólido y se cultiva. Las
colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas (ver imagen
16).
● Turbidimetría: Se utiliza un turbidímetro para medir la transmitancia que hay
en una suspensión bacteriana. Depende de la turbidez del tubo. Cuanto más
turbio esté el líquido, mayor concentración bacteriana habrá. Mide la
capacidad que presentan las bacterias para absorber o reflejar la luz.

Imagen 15: Recuento por filtración Fuente:

http://coli.usal.es/web/demos/demo_fundacua/RtoFiltracion/RtoFiltracion.htm

● Técnica del número más probable (NMP): consiste en preparar diluciones

seriadas a partir de una muestra problema y una posterior incubación. Tras la
incubación se selecciona el tubo de ensayo de menor concentración que
presente microorganismos y se realiza el conteo a partir del mismo, teniendo
en cuenta la concentración de ese tubo. Se puede contabilizar en medio
líquido o realizando una siembra en placa Petri. Es una técnica poco precisa y

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con alta probabilidad de errores, pero se sigue utilizando por ser rápida y
económica.

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IDEAS CLAVE DE LA UNIDAD

La identificación bacteriana es posible si se aplica una técnica de siembra adecuada.
Por ello, es imprescindible conocer los tipos de siembra que podemos aplicar para
trabajar las muestras microbiológicas.
✓ La incubación es el periodo de tiempo comprendido entre la siembra del
microorganismo y la lectura de los resultados.
✓ La siembra es el paso de las bacterias que contiene una muestra a un medio
de cultivo, permitiendo el crecimiento y la multiplicación de los
microorganismos.
✓ Tenemos distintos tipos de material de siembra, dependiendo la siembra que
queramos realizar. Por ejemplo, para la extensión en placa utilizaremos el asa
Drigalsky y para la siembra por picadura el asa recta.
✓ Es importante determinar el objetivo de nuestra siembra. Por ejemplo, si
queremos realizar un recuento total podemos hacer una siembra por
extensión o una siembra por recuento. Si queremos aislar colonias
utilizaremos la siembra por estría como método de preferencia.
✓ Los microorganismos pueden describirse por la formación de colonias,
atendiendo a su tamaño, forma, relieve, consistencia y color, entre otros.
✓ El recuento de viables en placa es de los más utilizados en microbiología,
aunque también hay preferencia por la filtración en membrana si hay poca
carga microbiana en medio líquido.
✓ Pese a que hoy en día la identificación bacteriana está automatizada en
algunos laboratorios, es necesario conocer métodos con el NMP, ya que es
una técnica sencilla.

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4. Aplicación de técnicas de aislamiento y de recuento de microorganismos

BIBLIOGRAFÍA

• de la Torre, F. J. M., & Campoy, E. E. M. (2014). Manual para Técnico Superior

de Laboratorio Clínico y Biomédico (1.a ed.). Editorial Médica Panamericana.
• Granados Pérez, R., & Villaverde Peris, C. (2002). Microbiología. Tomo 1.
Paraninfo.
• Cámara de Neubauer: Anexo 2: Cámara de Neubauer. (2018). Blog del Manual
del Laboratorio. Recuperado 7 de febrero de 2022, de
https://blogceta.zaragoza.unam.mx/manualbct2/anexo-2-camara-de-
neubauer/
• Porres Osante N., Ruiz Ruiz, E. (2008). Microbiología clínica. Ediciones
Paraninfo, S.A.

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