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Universidad de Guayaquil Facultad de Ciencias Químicas
Carrera: Química y Farmacia
Guía de Prácticas de Laboratorio
MICROBIOLOGÍA I
Practica
#6 Siembra y Métodos de Siembra
Alumno:
Docente:
Semestre: 5to G-2 Ciclo: II
Objetivos de la práctica de laboratorio
1- Conocer y realizar diferentes formas de siembra
2- Realizar la técnica de agotamiento
3- Utilizar diferentes medos de cultivo para el aislamiento de microorganismos
4- Practicar la transferencia de inóculos
Instrucciones o consideraciones previas
La identificación bacteriana se realiza tras el estudio de las características de tinción, morfológicas
y bioquímicas de los microorganismos.
Con este fin, existen en el mercado una enorme variedad de medios de cultivos diseñados no solo
para permitir el crecimiento y multiplicación de los microorganismos, sino también para inhibir los de
otros (medios selectivos) o resaltar determinadas características metabólicas (medios diferenciales)
que nos permitan establecer los fundamentos de algunas pruebas diferenciales.
Los ambientes microbianos solo en raras ocasiones albergan una cepa única. Para identificar los
microorganismos de un cierto hábitat, es preciso aislar cada especie en un cultivo puro, para lo cual es
necesario realizar aislamiento en medios especiales, selectivos y diferenciales, y poder obtener un solo
tipo de microorganismo identificándolo mediante pruebas bioquímicas o serológicas.
El primer paso para el diagnóstico de un microorganismo es sembrar las muestras en un medio de
cultivo adecuado para su desarrollo y utilizar una técnica de siembra para poder observar sus
características macroscópicas y microscópicas como son las morfológicas y tintoriales
Siembra
Concepto: Depositar un inoculo o semilla en n medio de cultivo adecuado para que se desarrolle.
Se necesita darle las condiciones físicas adecuadas como son temperatura, tiempo, oxigeno, pH,
dependiendo de lo que requiere el microorganismo que se desea cultivar
Métodos de siembra
Se pueden distinguir dos tipos de siembra:
En superficie: Corresponde a la modalidad más empleada.
En profundidad: Se utiliza en las pruebas de identificación bacteriana
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Las siembras se pueden realizar directamente desde una muestra clínica que contenga un
microorganismo, desde otro cultivo bacteriano o desde un inoculo.
Inóculo: Suspensión de bacterias en un volumen pequeño de medio líquido que generalmente es un
caldo nutritivo básico o agua destilada.
Forma correcta de sembrar en tubo
Las siembras se pueden realizar con diferentes elementos, entre ellos:
a) Siembra con asa:
Se puede realizar:
Tomando un inóculo a partir de una suspensión de bacterias o para sembrar muestras
biológicas líquidas (orinas, líquido cefalorraquídeo, etc.)
Para formar una estría de crecimiento a partir de un inóculo realizado con hisopo.
Para realizar traspaso de bacterias de un medio a otro, tomando directamente una porción de
una colonia.
b) Siembra con hisopo:
El hisopo está compuesto de algodón hidrófilo, lo que permite empapar este material con el
fluido en el que se desea estudiar una bacteria. Generalmente para que las bacterias
permanezcan viables se utilizan medios de cultivo denominados "de transporte", en el que se
sumerge el hisopo.
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La siembra se realiza depositando el hisopo sobre una sección de la placa y posteriormente se
realiza la estría de crecimiento con asa.
c) Siembra con pipeta Pasteur:
Se realiza para sembrar bacterias en suspensión.
Aislamiento
Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar
unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros.
Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un sólo tipo de microorganismo y que procede
generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio sólido, una masa de
células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia.
Técnicas Generales de aislamiento y cultivo de los microorganismos
1. Se aconseja que la siembra de todas las muestras a los medios de cultivos se realice bajo una
cabina de flujo de aire laminar o en un gabinete de seguridad biológica, con los protectores
de plástico o vidrio para el cuello y la cara, las muestras procesadas se las debe considerar
como potencialmente infecciosas y manipularlos adecuadamente.
2. Se debe contar con todos los medios de cultivos necesarios para realizar las siembras.
3. Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el material de
vidrio (en zonas estériles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de no
destruirlos por calor.
Después de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar en todo su perímetro
4. Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapadas,
antes y después de la inoculación.
5. Durante la inoculación, los tapones se mantienen en la mano sujetándolos por la parte que
no entra en contacto con tubos y matraces.
6. Los tubos abiertos deben mantenerse en posición inclinada hacia el frente para que el riesgo
de contaminación sea mínimo.
7. Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de trabajo boca arriba
trabajando con bacterias.
Resiembra periódica a medios nuevos
Los cultivos de bacterias se pueden mantener en tubos en los que han sido cultivados mediante pasos
periódicos a medios nuevos.
Cuando se va a utilizar este procedimiento para mantener una colección de cepas controles o para
un estudio posterior, se deben considerar 3 parámetros antes de realizar la resiembra:
1. El medio de cultivo
2. Tiempo de incubación
3. Temperatura de incubación
ANTIBIOGRAMA
Para conocer la sensibilidad de una bacteria a distintos antibióticos se siembra una muestra del
cultivo puro en un medio en el que conocemos la capacidad de difusión de cada una de las
sustancias a testar. Este es el medio de Mueller Hinton.
Reactivos de laboratorio
- Alcohol
Medios de cultivo / Cepas
Caldo nutritivo Cepas varias Agar Mac Conkey
Agar nutritivo Discos de antibioticos
Materiales de laboratorio
1- Algodón 2- Fósforos 3- Lápiz
graso 4 - Hilo de inoculación 5- Asa de Inoculación 6 – Gradilla
7 -Hisopos estériles
Equipos de laboratorio
- Mechero de Bunsen
- Incubadora
- Refrigeradora
Actividades por desarrollar/ técnica operatoria
1.- Prender el mechero bunsen para crear un área estéril y aplicar la técnica aséptica 2.- Coloca
las placas en posición invertida sobre la mesa de trabajo para que se facilite manipularlas
mejor.
Técnica de siembra por estrías en placa
1.- Desinfectar el área de trabajo,
ordenar el material de trabajo
2.- Esteriliza el filamento del asa de
siembra y toma la parte de la caja
de Petri que contiene el medio de
cultivo sembrado. Cerca del
mechero espera que se enfríe el asa
y toma una colonia de la placa.
Tape la caja de Petri.
3.- Ahora, toma una placa con agar estéril (donde vayas a sembrar) y con cuidado de no romper el
agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posición ligeramente horizontal
realiza las estrías (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porción
pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca.
4.- Esteriliza el asa de nuevo y déjala enfriar. Rozar una vez con el asa de siembra las estrías
sembradas la primera vez y realiza sobre una porción virgen del agar una segunda tanda de estrías
que
no toque la primera.
5.- Repetir exactamente la operación descrita en el punto anterior, pero rozando al empezar la
segunda tanda de estrías, hasta completar 3 o 4.
No hagas más presión sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su mango. Es importante
emplear un asa de siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgará el agar.
6.- Lleva a la incubadora y deja en posición invertida 24 horas al término de las cuales se puede
observar ya el desarrollo de colonias aisladas.
Sembrado por estrías en tubo inclinado
1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de Petri que contiene el
medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la
placa. Regresa la caja a su tapadera.
2.- Ahora toma el tubo de agar en pico de flauta (agar inclinado) y cerca del mechero retira el tapón
de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular y flamea la boca del tubo.
3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y empezando en el
área del fondo del agar realiza una estría hacia fuera hasta terminar en la punta del agar. Retira el
asa.
4.- Flamea la boca del tubo de nuevo y coloca el tapón de algodón bien firme. Esteriliza
el asa y déjala enfriar.
5.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra.
Sembrado por agitación en caldo
1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de Petri que contiene el
medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la
placa. Regresa la caja a su tapadera.
2.- Ahora toma el tubo con el caldo estéril y cerca del mechero retira el tapón de algodón
ayudándote con los dedos meñique y anular, flamea la boca del tubo.
3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y por agitación
dentro del caldo, siembra el inóculo. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el
tapón de algodón firmemente. Esteriliza el asa y déjala enfriar.
4.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas después de la
siembra.
Sembrado en picadura en tubo vertical
1.- Esteriliza el filamento de la aguja de inoculación y toma la parte de la caja de petri que contiene
el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe la aguja de inoculación y
toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera.
2.- Ahora toma el tubo con el medio de cultivo y cerca del mechero retira el tapón de algodón
ayudándote con los dedos meñique y anular, flamea la boca del tubo.
3.- Introduce la aguja con el inóculo y sin tocar las paredes del tubo, inocula en el centro del medio
de cultivo sin llegar hasta el fondo del tubo. Retira la aguja de inoculación en la misma dirección de
la siembra. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapón de algodón
firmemente. Esteriliza el asa y déjala enfriar.
4.- Lleva a incubar y observa las características del desarrollo a las 24 o 48 horas después de la
siembra.
Procedimiento No 2 Aislamiento en medios Selectivos e Inhibidores
Siembre por agotamiento por estrías múltiples combinada:
Agar Manitol sal Agar Mac Conkey
Luego de realizar estas siembras (placas y suspensiones) incube en estufa a 37º C durante 24 horas,
tras las cuales debe evaluar el crecimiento bacteriano.
Procedimiento N.º 3: Siembra de muestras biológicas
1. Realice una toma de muestra de secreción nasal de alguno de los integrantes del grupo.
2. Siembre la muestra en las mitades restantes de las placas de agar sangre y Mac Conkey e incube
durante 24 horas a 37º C.
PROCEDIMIENTO DE ANTIBIOGRAMA
Para la realización de la prueba en primer lugar hay que sembrar el medio con una gran carga
bacteriana que nos permita obtener un crecimiento en tapiz o césped. La
siembra se realiza mediante un hisopo estéril que se empapa con el cultivo
líquido o se impregna en un cultivo sólido.
Se descarga el hisopo realizando una estrella en el centro de la placa y
extendiéndola posteriormente por toda la superficie procurando que no
queden espacios sin cubrir. Una vez sembrada la placa se eligen los
antibióticos a testar.
Los antibióticos vienen en impregnados en discos de papel absorbente que se
sacan con pinzas metálicas esterilizadas mediante su flameo tras inmersión
en alcohol (LEFAZOLINA, OXACILINA, CEFALEXINA, NAFCILINA).
Los discos se depositan en la superficie del medio de cultivo inoculado,
realizando una ligera presión para que queden adheridos al mismo. Hay que
procurar que queden suficientemente separados unos de otros para que la
lectura de resultados sea clara y no haya interferencias entre la acción de unas sustancias y otras.
La placa preparada con el inóculo y los antibióticos se invierte y se lleva a incubar durante 24 horas
a 37ºC. Tras este tiempo, se leen los resultados midiendo el diámetro de los halos de inhibición del
crecimiento que aparecen alrededor de los discos de papel. Se valora la efectividad de los mismos
consultando la tabla correspondiente en la que, según el antibiótico, tenemos la capacidad de
difusión en el medio y por tanto, la medida de halo que corresponderá a una bacteria sensible,
moderadamente sensible/de sensibilidad intermedia, o resistente.
Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figuras, fotos)
RESULTADO DESPUES DE LA INCUBACION
Conclusiones
Aplicamos los diferentes medios de cultivo, utilizando los métodos aprendidos en la manipulación
de los instrumentos, inóculos, y material contenedor de la fuente nutricional con el cual se dará el
crecimiento correcto de los diferentes tipos de microorganismos considerando así las condiciones
óptimas en el proceso de incubado.
Realizamos el antibiograma para conocer la sensibilidad de bacterias ante antibióticos formando
halos de diferentes tamaños.
Recomendaciones
Al momento de tomar la cepa y realizar el sembrado ya sea con el asa o con el hisopo, aplicar y
mantener un ambiente estéril en cada una de las etapas previas a la aplicación de estriado en los
diferentes medios de cultivo
Bibliografía
Pierson M. & Smoot L. (2001) Indicator Microorganisms and Microbiological Criteria. In:
Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T.
(Eds.) ASM Press. USA. 71-87.
Hocking A. (2001) Toxigenic Aspergillus Species. In: Food Microbiology. Fundamentals and
Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 451-465.
Pitt J. (2001) Toxigenic Penicillium Species. In: Food Microbiology. Fundamentals and
Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 467-480.
