MANUAL DE LABORATORIO

DE MICROBIOLOGÍA I
Código – QFB 313

CENTRO UNIVERSITARIO
INTERAMERICANO

ESCUELA DE QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

DE MICROBIOLOGÍA I

ELABORÓ:
QFB. LIZETH HIDALGO REZA
QFB. CECILIA LUZ BALDERAS VÁZQUEZ
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PRÁCTICA N°1
IDENTIFICACIÓN DE CULTIVOS Y GRUPOS MICROBIANOS
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

Introducción:
La Microbiología estudia a los microorganismos desde el punto de vista de su
morfología, función relación con el ambiente y los métodos que nos llevan a su identificación.
Los estudios de cada grupo en particular corresponden a ramas específicas de la
microbiología como son:
● Bacteriología (bacterias)
● Micología (hongos)
● Ficología (algas)
● Protozología (protozoarios)
● Virología (virus)

En 1969 Whittaker propone un sistema de 5 reinos basándose en tres puntos

principales: complejidad celular (procariotas y eucariontes), complejidad tisular (unicelular,
multicelular-multinucleados) y nutrición (absorción, fotosíntesis, ingestión) los cuales son:
Monera, Protista, Fungi, Vegetal y Animal.
Protozoarios: Son clasificados dentro del reino protista siendo microorganismos
unicelulares y eucariontes. Son en tamaño mayores a las bacterias y sus estructuras internas
muchas veces fácilmente observables. Por su morfología se puede diagnosticar la especie.
Hongos: Son clasificados dentro del reino fungí, siendo organismos multinucleados y
eucariontes, sus nutrientes los obtienen por absorción. En cuanto a su tamaño es variable
presentan dos tipos de crecimiento: filamentoso y levaduriforme.
Los hongos filamentosos tienen una unidad funcional la HIFA el conjunto de hifas es
denominado MICELIO el cual puede estar en contacto con el medio y se le denomina
VEGETATIVO o bien por encima del sustrato denominándose MICELIO AEREO. Estos
hongos tienen aspecto algodonoso o aterciopelado con crecimiento radial.
El otro tipo de crecimiento es el levaduriforme el cual se caracteriza por su tipo de
multiplicación o división llamado GEMACIÓN. En tamaño son mayores a las bacterias son
unicelulares y no desarrollan filamentos o micelio. Algunos géneros forman el llamado
pseudomicelio, con tinciones apropiadas podemos observar el núcleo otros organelos como
mitocondrias o inclusiones como gránulos de volutina, están presentes en el citoplasma las
colonias de levaduras son de aspecto cremoso.
Bacterias: Se encuentran dentro del reino Monera son células procariotas y
unicelulares se reproducen por fisión binaria pueden ser móviles por la presencia de flagelos
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simples las formas fundamentales de las bacterias son esféricas (cocos), alargadas (bacilos),
helicoidales (espirilos) los cocos pueden agrupare en pares cadenas, racimos o tétradas
dependiendo del género.
Un grupo importante de microorganismos son las Archeas cuya forma fundamental es
diferente al de las bacterias, se pueden presentar en forma de estrella o en forma
cuadrangular, la característica principal de este grupo microbiano es su crecimiento
requieren condiciones especiales extremas como altas temperaturas o altas concentraciones
de sal.

Objetivo General:
Observar las principales características morfológicas macroscópicas y microscópicas
de los diferentes grupos microbianos.

Objetivos Específicos:
● Observar y manejar las diferentes características macroscópicas de los
microorganismos en su crecimiento en diferentes tipos de medios.
● Conocer los diferentes tipos de medios empleados en el cultivo microbiano.
● Observar sus características microscópicas de diferentes grupos microbianos
detectando forma y agrupación usando microscopia óptica.

Materiales:

● 1 Placa de Agar Soya Tripticasa

● 1 Placa de Agar Nutritivo
● 1 Placa de Agar Dextrosa Saboraud
● 4 Porta objetos y 4 cubre objetos
● 2 Pipetas Pasteur
● Algodón
● 1 Mechero Bunsen
● 1 Aguja de disección ó asa bacteriológica
● 1 Lupa
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Material Biológico:

● Preparaciones fijas de bacterias, hongos y protozoarios.

● Agua estancada
● Placas de Cepario

Reactivos:

● Benzal
● Azul de algodón
● Medio de cultivos y agares

Equipo:
● Microscopio óptico

Procedimiento:
Morfología macroscópica y microscópica:
1. Realizar la morfología colonial de los cultivos proporcionados, así como la
identificación del medio.
2. Examinar los diferentes cultivos proporcionados utilizando los diagramas anexos y
seleccionar las características del cultivo en placa y tubo inclinado.
3. Hacer la observación microscópica de cada preparación proporcionada anotando el
aumento al que se observó.
4. Llenar la tabla que aparece en los resultados y observaciones, si se reconocen otras
características además de las previamente indicadas anotarlas en la tabla.

Preparación de hongos y protozoarios:

5. Hacer una preparación en fresco del agua de estanque.

6. Examinar cada preparación con objetivo seco débil y seco fuerte.
7. Con la ayuda del libro de texto y anexos, tratar de identificar los microrganismos
presentes.

Aislamiento del medio ambiente:

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8. Seleccionar un lugar de su hogar, escuela, etc. y colocar las placas proporcionadas

en distintos lugares con la tapa abierta por 24hrs posteriormente sellarla con cinta.
9. Marcar la base de la caja de Petrí indicando la ubicación donde se realizó el muestreo.
10. Incubar la placa a temperatura ambiente una semana antes.
11. Separar una parte de cultivo de hongos con la ayuda de agujas de disección y preparar
un montaje húmedo utilizando la solución de azul algodón Lactofenol como solución
de suspensión que tenga la precaución de no arrastrar el agar y disgregar el cultivo
con la ayuda de las agujas y colocar el cubreobjetos.
12. Observar a objetivos de seco débil y seco fuerte.

Resultados y Observaciones:
Cuadro 1
Descripción morfológica de microorganismos en diferentes medios de cultivo

Microorganism
Propiedad Medio
os Pigmentaci Forma
Borde Elevación es de la de
(género y ón colonial
estría Cultivo
especie)

Cuestionario:
1. ¿Quién apoyo la clasificación de Whittaker en 5 reinos y bajo que fundamento?
2. ¿Qué características microscópicas diferencian a los hongos de las bacterias?
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3. Menciona 5 beneficios y consecuencias perjudiciales de los microorganismos para la

humanidad.
4. ¿Por qué es importante la morfología colonial?
5. ¿Cuáles de las características de cultivo están sujetas a sufrir mutaciones?
6. ¿Qué indica el vire de indicador en los medios empleados?
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PRÁCTICA N°2
PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y MATERIALES

Introducción:
Un medio de cultivo es un sustrato que proporciona los nutrientes necesarios para
el desarrollo del microorganismo a probar. Los microorganismos presentan diferencias en
sus requerimientos nutricionales que son reflejo de la extrema diversidad bioquímica y
fisiológica. El agua, sales inorgánicas, fuentes de carbono fuentes de nitrógeno y metales
son necesarios a todos los microorganismos. Existen bacterias que necesitan la presencia
de determinado nutriente, sin el cual no puede desarrollarse este nutriente se denomina
factor de crecimiento y las bacterias que necesitan de ellos se llaman auxótrofos.
Los medios de cultivo con base en su contenido de material gelificante pueden ser
líquidos, semisólidos y sólidos (los líquidos carecen de material gelificante. En
microbiología el material gelificante más utilizado es el agar, químicamente es un
polisacárido a partir de algas marina presentando en sus desventajas que la mayoría de los
microorganismos no utilizan como nutriente. La presencia y cantidad de este permite
diferenciar los medios semisólidos y sólidos, de 0.5-1.5 % y una concentración mayor o igual
al 2 % respectivamente.
Los medios de cultivo para microbiología se fabrican bien en forma granulada o de polvo
ambas presentas son higroscópicas por lo que deben mantenerse perfectamente cerradas y
en ambientes secos.
La mayoría de los medios de cultivo de laboratorio se preparan ya sea en forma líquida caldos
o sólida. Es preciso ejercer cuidado meticuloso para proporcionar la concentración adecuada
de nutrientes, el pH y otros factores requeridos para el cultivo de los microorganismos.
Puesto que los ingredientes y los utensilios de vidrio que se usan en la preparación de los
medios pueden contener microorganismos indeseables, los medios recién preparados se
deben esterilizar rápidamente.

Objetivo General:
Preparar diferentes medios de cultivo sólido y aplicar deferentes métodos de
esterilización de mayor utilización en el laboratorio de Microbiología.

Objetivos Específicos:
● Conocer los componentes importantes que están presentes en el medio de cultivo.
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● Conocer los principios generales de esterilización de materiales de vidrio y medios de

cultivo de uso común en microbiología.
● Observar el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación
microbiana en el laboratorio.

Material:
● Cajas Petri estériles
● Balanza
● Matraz erlenmeyer
● Espátula
● Pipetas de 10 ml
● Parilla de calentamiento
● Mechero Bunsen
● Guantes para calor
● Autoclave
● Medios de Cultivo en polvo
● Probeta

Reactivos:
● Agar de soya tripticasa
● Agar nutritivo
● Agar Saboraud

Procedimiento:
A.- Preparación de material de vidrio y medios de cultivo:

1. Una vez limpio el material de vidrio a esterilizar se procederá a envolver (cajas petrí y
pipetas) con papel estraza. Para los tubos y matraces se elaboran tapones de algodón
y gasa, procurando que ajuste con holgura sobre los que finalmente se les colocara
un capuchón de papel. La forma en la cual se preparan los medios de cultivo viene
indicada en cada etiqueta y depende del fabricante. Se recomienda lo siguiente:
Utilizar un recipiente de 2,5 veces mayor al que se va a preparar.
Al medio se le agrega aproximadamente la mitad de agua a utilizar dejándolo reposar
15 minutos. Si es necesario calentar, el calentamiento debe ser paulatino y agitando
continuamente evitando el calentamiento prolongado.
2. Preparar 20 ml de caldo nutritivo en un matraz Erlenmeyer de 125ml.
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3. Preparar 120 ml de Agar nutritivo, calentar la mezcla en una parrilla con agitación
constante hasta ebullición durante 1 minuto y vaciar 5ml del medio en 4 tubos de
cultivo con tapón de baquelita que deberán cerrar sin llegar al tope.
4. Preparar 120ml del medio de cultivo mínimo en sales con un matraz Erlenmeyer de
250ml.
5. Preparar 120 ml del Agar McConkey en un matraz Erlenmyer de 250ml.

B.-Esterilización de materiales y medios de cultivo:

1. Las cajas Petri y pipetas envueltas se colocarán en horno a 150°C durante 2 hrs,
después de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes únicamente en un área
limpia.
2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las siguientes
instrucciones:

Proceso de esterilización:

a) Verificar el nivel del agua de la autoclave.

b) Introducir a la autoclave los medios de cultivo perfectamente cubiertos, (en el caso de
esterilizar medios de cultivo en tubos con tapón de rosca estos deben estar tapados
flojamente y cerrados perfectamente después de esterilizar)
c) Cerrar la tapa de la autoclave y esperar a que se sature de aire caliente antes de
poner la válvula de presión.
d) Dejar que el equipo caliente hasta alcanzar los 121°c revisando la escala del
manómetro. Si aumenta la presión retirar el mechero Fisher y colocarlo nuevamente
en caso de disminuir.
e) Dejar que baje la presión ya pasado los 15 minutos, quitar la válvula y con los guantes
abrir la tapa de adelante hacía atrás para evitar quemaduras por salida de vapor.
f) Compuestos termolábiles no deben de ser autoclaveados. Verificar la etiqueta de cada
uno de los medios que el profesor proporcione, anotar los componentes que contienen
y sus cantidades.

Cuestionario:

1. Define los términos de esterilización, desinfección, sepsis y antisepsis. ¿Cómo se

relacionan estos procedimientos con la pasteurización?
2. Menciona los métodos existentes para esterilizar y en qué tipo de materiales se
aplican.
3. Menciona que es un medio enriquecido, selectivo y diferencial.
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4. Menciona las formas de cultivar antes de la existencia del agar

5. ¿Qué ventajas presenta el agar?
6. ¿Qué alteraciones se presentan en los medios por exceso de esterilización?
7. ¿Qué tipo de medios son y que indicador tienen los siguientes medios?
● Agar McConkey
● TCBS
● Agar sal y manitol
● Verde brillante
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PRÁCTICA N°3
MÉTODOS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Introducción:
Definición de Aislamiento: Es la separación de un microorganismo determinado de
las poblaciones mixtas que existen en la naturaleza; el cultivo, es el crecimiento de las
poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios de cultivo) en condiciones de
laboratorio. El proceso mediante el cual se separa los microorganismos se denomina
“Aislamiento” y el microorganismo separado “aislado”.
La manera de inocular (sembrar) una muestra depende del tipo de medio de cultivo.
Medio Líquido: La inoculación se efectúa mediante el asa bacteriológica, pipeta o hisopo.
Medios semigelificado (Semisólido): Con ayuda del asa bacteriológica recta.
Medio Gelificado (sólido): En caja Petri o en tubos de agar inclinado, la inoculación se
realiza por estría o picadura.
Un cultivo en el que se desarrolla solamente un tipo de población bacteriana se conoce como
cultivo Puro o Axénico. Un cultivo que tiene más de una población bacteriana se conoce
como cultivo mixto: en el caso especial de que contenga solo dos clases de microorganismos,
deliberadamente mantenidos en mutua asociación se denomina cultivo bimembre.

Objetivo General:
Conocer las diferentes técnicas de aislamiento en diferentes medios de cultivo.

Objetivos Específicos:
● El alumno reforzará su aprendizaje en la preparación de medios de cultivo
enriquecidos, selectivos y diferenciales para el cultivo de diferentes especies.
● Realizar el aislamiento de microorganismos con el asa bacteriológica por el método
de estría cruzada utilizando las placas de medio de cultivo.
● Conocer y aprender las técnicas de transferencia y selección de colonias en diferentes
medios de cultivo.
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Material:
● 4 placas con agar nutritivo
● 1 Tubo de ensaye 16x150mm
● 4 Tubos con agar nutritivo
● 8 Tubos con caldo nutritivo
● Mechero Bunsen
● Asa bacteriológica redonda
● Cepa bacteriológica Escherichia Coli
● Benzal
● Algodón

Procedimiento:
1. Limpiar el área de trabajo con benzal y algodón
2. Flamear el asa bacteriológica hasta llevarla al rojo vivo
3. Dejar enfriar el asa
4. Destapar el tubo o placa que contiene la cepa problema
5. Tomar la muestra con el asa bacteriológica y volver a tapar el tubo
6. Hacer las estrías sobre la superficie del medio de cultivo, como se indica en el
esquema de trabajo teniendo cuidado de flamear el asa antes de cada serie de estrías
y enfriarla en una orilla de la placa. Con la última serie de estrías no volver a tocar la
primera serie de estría.

1ª Serie 2ª Serie 3ª Serie 4ª Serie

7. Rotular las placas con su nombre, fecha de ingreso y salida del material que se va a
meter a incubar.
8. Colocar las placas en la estufa bacteriológica y dejarlas durante 24 hrs a 37 °C.
9. Limpiar nuevamente el área de trabajo con Benzal y algodón.
10. Evaluar el crecimiento a las 24 hrs, identificando la presencia de colonias aisladas y
determinar si hubo cultivo puro o mixto.
11. Colocar el material sucio donde lo indica el profesor.
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Otras formas para la siembra de cepas para el asa bacteriológica empleadas en

microbiología son:

CUESTIONARIO

Observaciones morfológicas de las técnicas de aislamiento

Microorganismos Parte B Parte C Parte E

Película

Turbidez

Sedimento

Pigmento

Olor

Microorganismo Parte D

Cantidad de crecimiento

Pigmento

Consistencia

Otros

Cuestionario:

1. ¿Por qué se incuban las cajas con las tapas hacia abajo?
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2. ¿Qué ventajas e inconvenientes ofrece el método de estría cruzada?

3. ¿Con que propósito se emplea las otras técnicas de siembra diferentes a la estría
cruzada?
4. ¿Qué es un cultivo puro?
5. ¿Cuál es la composición de caldo nutritivo?
6. ¿Qué componentes están presentes en medio de cultivo?
7. ¿Qué es la técnica aséptica?
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PRÁCTICA N°4
METODOS DE CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

Introducción:
Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa) de las células
microbianas en un cultivo pueden cuantificarse por métodos directos e indirectos.
Métodos directos:
Determinación de peso seco es un método de cuantificación muy utilizado en cultivos de gran
densidad sobre todo para hongos y levaduras. Como los cultivos se someten a varios
procesos (filtración, lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de biomasa y
errores de cuantificación.
Métodos de cuenta directa en cámara de Neubauer:
Tiene la ventad de ser muy rápido y económico, aunque no pueden distinguir las
células viables y no viables, se puede calcular el número de microorganismos en una muestra
a partir del volumen de la cámara y de las disoluciones de la muestra que sean necesarias,
la desventaja es que la observación y cuantificación se dificulten en células muy pequeñas o
en poblaciones de baja densidad debido al pequeño volumen de la muestra que se utiliza.
Métodos indirectos:
Medición de la turbidez: este método consiste en medir la turbidez de los cultivos en un
espectrofotómetro que es relativamente rápida y que se basa en la capacidad de las células
microbianas de dispersar la luz que incide sobre estas. Como el tamaño de las células en
una población es casi constante, el grado de dispersión es proporcional a la concentración
de células presentes, pero no se pueden diferenciar la viabilidad.
La cuantificación de células viables es a través de la realización de diluciones y cuenta en
placa con medios de cultivo específicos para la población de interés. Esta tecnica se basa
en la suposición de que los microorganismos cultivados crecerán en el medio de cultivo
multiplicado y produciendo una colonia visible en consecuencia el número de colonias que
se observarán a simple vista será igual número de bacterias viables o unidades formadoras
de colonias (UFC) inoculadas en el agar multiplicadas por la dilución.
Esta tecnica aplicada en muestras complejas dará una estimación aproximada del número
total de microorganismos, dependiendo del medio de cultivo utilizado, ya que no hay un
medio y condiciones de incubación que favorezcan el crecimiento de todos los
microorganismos.
También pueden presentarse problemas relacionados con falta de homogeneidad de las
diluciones y en la inoculación de las muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores si
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es que las células no se separan bien y valores elevados si las tomas de muestra se hacen
del fondo de tubo donde se han concentrado por gravedad los microorganismos.

Objetivo General:
Manejar las técnicas de cuantificación directa e indirecta de microorganismos más utilizadas
en los laboratorios microbiológicos.

Objetivos Específicos:
● Cuantificar el número de células totales por cuenta directa en la cámara de Neubauer
y determinar el número de UFC (unidad formadora de colonias) en placa.
● Comparar las ventajas y desventajas de cada una en función de la información que
se obtiene, del tiempo invertido y de los recursos necesarios.

Material:
● 3 Cajas petrí on agar nutritivo
● 10 Pipetas de 1-2 ml estériles
● 1 Matraz Erlenmeyer 125 ml
● 10 Tubos de ensaye de 15 ml
● 2 Vasos de precipitado de 250 ml
● 1 Cámara de Neubauer
● 1 Pipeta Pasteur
● 1 Varilla d vidrio doblada en L

Equipo:
● 1 Parrilla de agitación
● 1 Espectrofotómetro
● 1 Microscopio compuesto
● 1 Vórtex
● 1 Contador de colonias

Reactivos:
● 90 ml de ssl (0.89%NaCl)
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● 100 ml ssl
● Fenol 2%
● Safranina
● Cultivos de Saccharomyeces cerevisiae y E. coli

Procedimiento:
Técnica turbidimétrica:
1. Inocular el matraz que contiene el medio de cultivo con los microorganismos
proporcionados.
2. Medir la D.O. a 560 nm y comprobaremos que esta D.O. inicial (to) (D.O. es aprox.
De 0.05).
3. Seguir la evolución de la turbidez del cultivo midiendo la D.O. a diferentes tiempos
durante 24 horas.
4. Tomar muestras cada dos horas y en algunos de estos puntos tendremos que hacer
diluciones para medir la D.O.
5. Representar en una gráfica los valores de D.O. obtenidos a lo largo del tiempo. La
curva obtenida será la curva de crecimiento del cultivo.
6. Testigo (blanco) es un medio de cultivo estéril (sin inocular).

Técnica de dilución y siembra en placa:

1. Hacer diluciones decimales del cultivo de 10-5 hasta 10-9 en condiciones estériles.
2. Se colocarán en cajas Petri con agar nutritivo por duplicado 0.1ml de las últimas tres
diluciones.
3. Distribuir cuidadosamente el inoculo en toda la caja con ayuda de una varilla de
vidrio doblada en L previamente esterilizada a la flama de mechero y enfriada.
4. Dejar absorber el líquido durante 10 minutos.
5. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas para bacterias y
levaduras y de 5-7 días para hongos filamentosos.
6. Hacer la cuenta de las colonias de las placas seleccionando la dilución donde el
número de colonias sea entre 30-300.
7. Se calcula el número promedio de colonias por dilución para obtener el número total
de unidades formadoras de colonias (UFC/ml).
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Reportar:
1. Reportar los resultados de cuantificación de los cultivos aplicando las técnicas
descritas, indicar los cálculos hechos para cada metodología.
2. Recopilar sus resultados en el cuadro, indicando la muestra analizada.
3. Discutir en cada caso cuales fueron las ventajas y desventajas de las metodologías
de cuantificación.
4. Para el conteo en cámara de Neubauer realizar ambos cálculos y realizar
comparaciones de resultados y discutan.
Cuantificación de microorganismos por técnicas directas e indirectas
Cuenta en cámara
Cuenta viable en
Microorganismos Turbidez (D.O.) de Neubauer (#
placa (# UFC/ml)
células totales/ml)

Cuestionario:
1. Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta directa en cámara
de Neubauer para la cuantificación de microorganismos ¿En qué casos conviene
usar cada uno?
2. Explique cuáles son las ventajas y desventajas del método turbidimétrico de
cuantificación de células.
3. Mencione dos aplicaciones concretas en las que utilicen cada una de las técnicas de
cuantificación realizadas.
4. Algunos autores sugieren la medición de actividad biológica y la determinación de
constituyentes celulares para la cuantificación de poblaciones microbianas. Comente
sus ventajas y desventajas.
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PRÁCTICA N°5
CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO DE ESCHERICHIA COLI

Introducción:
El crecimiento y la viabilidad de los microorganismos está determinada por factores
nutricionales y ambientales, y en condiciones de laboratorio óptimas es posible predecir una
curva de crecimiento característica de cada especie microbiana.
Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo líquido fresco, experimentará un
periodo de adaptación al medio y en condiciones de cultivo y posteriormente se dividirá en
forma exponencial dando lugar a una curva del tipo sigmoidal que se acostumbra dividir en
4 partes.
A. Fase de retardo, de adaptación o fase Lag; periodo de adaptación de un
microorganismo a un nuevo cultivo.
B. Fase de crecimiento exponencial o fase Log; aumento regular de la población que se
duplica a intervalos regulares de tiempo (td).
C. Fase estacionaria; cese del crecimiento por agotamiento de nutrientes por
acumulación de muchos tóxicos, etc.
D. Fase de declinación o muerte; el número de células que mueren es mayor que el
número de células que se dividen.
La forma de cada porción de la curva y el tiempo de duración de cada fase dependerá de: la
especie de microorganismos la preparación del inoculo, la composición química del medio
de cultivo y las condiciones ambientales de incubación.
En general las bacterias crecen con mayor rapidez que los microorganismos eucarióticos, el
metabolismo energético también influye sobre la velocidad de crecimiento debido a la
ganancia energética que se obtiene de cada vía catabólica de obtención de energía. Así los
microorganismos fermentadores crecerán más lentamente que los respiradores.
Con la cuantificación de microorganismos a través del tiempo es posible el representar
gráficamente el crecimiento microbiano.

Objetivo General:
Cuantificar y representar gráficamente el crecimiento de un microorganismo aplicando los
métodos de cuantificación directos e indirectos.
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Objetivos Específicos:
● Conocer las fases de crecimiento en un cultivo bacteriano.
● Aprender a calcular estadísticamente el crecimiento microbiano.
● Elaborar una curva de crecimiento.

Materiales:
● 1 Matraz Erlenmeyer de 250ml con 100ml de caldo nutritivo
● 2 Matraz Erlenmeyer de 125ml con 99ml de solución isotónica estéril
● 6 Pipetas 10ml estériles
● 16 Pipetas de 1ml estériles
● 1 Mechero Fisher
● 1 Gradilla
● 16 Tubos con 9ml SSL estéril
● 1 Varilla doblada en L
● 3 Cajas Petri con agar nutritivo

Equipo:
● 1 Potenciómetro
● 1 Espectrofotómetro
● 1 Contador de colonias

Procedimiento:
A. Inoculación e incubación de cultivo:
1. Inocular en condiciones estériles un matraz un matraz de Erlenmeyer de 250ml con
100ml de cultivo complejo con 10ml de un cultivo de E.coli 12 horas antes de iniciar la
práctica que se utilizaran como inoculo para los demás cultivos en tubos.
2. Homogeneizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una
muestra de 5ml con una pipeta estéril y vaciarle en una celda del espectrofotómetro,
esta corresponderá al tiempo cero (to), de la misma manera se tomarán muestras a
los 15, 30, 60, 90 y 120 minutos.
3. Colocar los cultivos en la incubadora con agitación continua a 35°C.

B. Tratamiento de las muestras:

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1. Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotómetro a 560nm. Leer el valor

de la densidad óptica.
2. En la muestra de 120 minutos además de evaluar la turbidez se deberá poner 1ml del
cultivo en un matraz Erlenmeyer con 99ml SSL.
3. Realizar diluciones hasta 10-8. Cuidando de homogeneizar las muestras cada vez que
se haga una nueva dilución.
4. Enseguida inocular 0.1ml de las últimas tres diluciones en una caja de Petri con agar
nutritivo y distribuir la muestra con una varilla de vidrio doblada en L.
5. Dejar que se absorba el líquido en las cjas y posteriormente incubarlas en forma
invertida durante 24-48hrs.
6. Cuantificar el número de UFC/ml de E.coli con el contador de colonias.

Resultados:
1. Se registran los resultados de cuantificación del crecimiento de E.coli.
2. El alumno reporta también en forma gráfica la relación entre dos variables, la variable
independiente siempre será el tiempo que se colocará en el eje X por cada
concentración de glucosa.
a) Una gráfica de D.O. vs tiempo.
b) En la gráfica identificar las fases de crecimiento y duración.
c) Determinar la tasa de crecimiento promedio (k) de la formula.
K=(LogN-LogNo)/log2(t), donde No=# de UFC al final del experimento.
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PRÁCTICA N° 6
TINCIÓN DE GRAM

Introducción:
Los organismos vivos son incoloros y presentan pobre contraste cuando se observan
al microscopio. Cuando los organismos son teñidos antes de observarlos, aumenta en gran
medida el contraste de las células y su medio. Antes de teñir es necesario hacer un frote y
fijarlo. Un frote es una delgada capa de células que cubre un área de portaobjetos, este frote
debe ser secado al aire y fijado por calor o químicamente con alcohol. Así los frotes no fijados
son lavados en el proceso de tinción. Existen varias técnicas de tinción ocupadas por
microbiología, por ejemplo:
⮚ Tinción simple o directa
⮚ Tinción diferencial
⮚ Tinción de estructuras
⮚ Tinción negativa
⮚ Tinción de material de reserva, etc.

La tinción más empleada en microbiología es la de GRAM, que es una tinción diferencial.

Los microorganismos difieren entre sí, desde el punto de vista químico y físico por lo que
reaccionan de manera diferente a los colorantes. Las tinciones diferenciales ocupan dos
colorantes uno primario y otro de contraste o secundario. Para la tinción de gram el colorante
primario es cristal violeta mientras la safranina corresponde al de contraste. La tinción de
Gram clasifica a los microorganismos según su capacidad de retener el colorante primario
(gram positiva) o el colorante de contraste (gram negativa).

Objetivo General:
Aprender el fundamento y la técnica de tinción de gram para determinar la morfología
microscópica de diferentes cepas.

Objetivos Específicos:
● Observar las estructuras bacterianas y describir las características microscópicas
como forma, color, tamaño y agrupación.
● Que el alumno clasifique algunas especies en gram positivas o gram negativas de
acuerdo a la tinción de gram.
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DE MICROBIOLOGÍA I
Código – QFB 313

● Comprender la importancia que tienen las tinciones para la caracterización e

identificación de bacterias.
Material:
● Mechero bunsen
● Microscopio
● Asa bacteriológica redonda
● Equipo de Gram
● Placas sembradas con diferentes microorganismos
● Aceite de inmersión
● Portaobjetos
● Cubreobjetos

Procedimiento:
1. Hacer un frotis de las colonias caracterizadas tomando con el asa bacteriológica una
pequeña muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua, sobre un
portaobjetos. Extender esta suspensión y dejar secar.
2. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero
3. Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el colorante y
lavar con chorro suave de agua corriente.
4. Cubrir el frote con lugol dejarlo actuar por un minuto. Escurrir y Lavar.
5. Decolorar el frote con alcohol-cetona, de 5 a 30 seg. Escurrir y Lavar
6. Cubrir el frote con safranina y dejarlo actuar por 30 seg. Escurrir y Lavar
7. Dejar secar al aire
8. Observar el frotis con objetivo seco débil, seco fuerte y de inmersión.
9. Determinar la morfología microscópica y la respuesta a la Tinción de Gram de cada
cepa empleada.

Cuestionario:
1. ¿Qué importancia tiene la tinción de gram?
2. ¿Cómo explicas la tinción de gram?
3. Explique 4 ejemplos de bacterias de gram positivos y 4 de gram negativos
4. ¿Por qué es importante fijar el frote?
5. Definir un colorante y las partes que lo conforman
6. Dibuja tus observaciones.
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PRÁCTICA N°7
EFECTO DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO DE LOS
MICROORGANISMOS

Introducción:
Para el control del crecimiento microbiano o la eliminación total de las poblaciones
microbianas podemos emplear sustancias químicas conocidas como desinfectantes o
antisépticos, que actúan sobre el microorganismo por los siguientes mecanismos:
Ruptura de Pared alterando la naturaleza coloidal del protoplasma
Alterando la permeabilidad.
Inactivando enzimas
Desnaturalizando Proteínas
Disminuyendo la tensión superficial

Entre los agentes químicos empleados tenemos: Ácidos, Bases, Jabones, Detergentes,
Alcoholes, Metales pesados y Colorantes.
El termino desinfectante está restringido a la sustancia que son aplicadas sobre superficies.
La acción desinfectante se ve aumentada por la temperatura y la concentración.

Objetivo General:
Comprender el efecto de diversos agentes químicos sobre el crecimiento de los
microorganismos y los mecanismos de adaptación que han desarrollado los
microorganismos.

Objetivos Específicos:
● Determinar la susceptibilidad de los microorganismos.
● Observar los efectos de agentes químicos en el cultivo de microorganismos.
● Conocer la respuesta de crecimiento de los microorganismos con presencia de
agentes químicos.

Material:

● Placas con agar nutritivo

● Hisopos estériles
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● Discos de papel filtro impregnados con los siguientes agentes:

● Agentes Surfactantes: Benzal, Jabón, Detergente, Sales Biliares
● Metales Pesados: Merthiolate
● Desinfectantes: Cloro, Yodo
● Colorantes: Cristal violeta, Safranina
● Antibióticos.
● Cepas las que proporcione el profesor
● Pinzas

Procedimiento:
1. Sembrar las placas con agar nutritivo en forma masiva, empelando hisopos estériles
con cada uno de los microorganismos proporcionados, en la siguiente forma:

2. Empleando pinzas flameadas en el mechero, colocar adecuadamente discos de papel

filtro impregnado con el agente químico a probar. La distancia entre cada disco no
debe ser menor a 2 cm.
3. Incubar todas las placas a 37°C durante 18 a 24 hrs.
4. Hacer lectura midiendo en mm el diámetro de los halos de inhibición alrededor de los
discos de papel filtro impregnados con el agente químico.

Papel filtro
impregnado con Crecimiento
agente Químico microbiano

Halo de inhibición del

crecimiento bacteriano
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INFORME:
5. Llenar el cuadro registrando los resultados de cada cepa:
Cepa:
Agente Químico Tamaño de halo de Respuesta
inhibición
Sensible (s) o
Resistente (R)

Cuestionario:
1. Menciona la diferencia entre desinfectante y esterilizar
2. Menciona si crecieron igual los diferentes microorganismos frente a los diferentes
agentes químicos.
3. Explique a que crees que se deban las diferencias si las hay.
4. Menciona el mecanismo de inhibición de algún agente químico sobre el crecimiento
de un microorganismo.
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5. ¿Cuál es la importancia del control de microrganismos?

BIBLIOGRAFÍA

Lopardo H. A.. Introducción a la microbiología Clínica, 2019

Macias Salvia A., Microbiología y salud, 2019
Musto A. Manual de Microbiología y Parasitología, 2017