PRÁCTICA NO 4: PROTEINAS I: EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEINAS

MARCO TEORICO

La célula, como unidad mínima funcional y estructural de un organismo, tiene un rol o

función específica en el mismo, determinado por la composición y proporción de las
proteinas que la conforman, las proteinas son las moléculas orgánicas más abundantes en
una célula y tienen el extraordinario potencial de producir una gran cantidad de variantes
en su conformación. Esta variedad permite a las proteínas funciones tan específicas como
la regulación del metabolismo celular, transporte a través de la membrana, comunicación
intra e intercelular, así como ser una fuente de energía para la célula.

Esta composición depende del conjunto de genes que se activan como respuesta a
diferentes señales que recibe una célula, de su micro ambiente y de las características
funcionales de la misma. Es decir que el patrón proteico de una célula vegetal será distinto
al de una célula animal y a su vez una célula hepática de un ratón será distinta de una célula
hepática de un humano.

La mayor parte de las investigaciones bioquímicas en campo de la proteómica, requieren la

purificación total o parcial de estas moléculas mediante la aplicación de diferentes técnicas
biológicas, físicas o químicas, así como su posterior caracterización, para ello se describen
a continuación conceptos y técnicas básicas para su extracción y cuantificación.

Métodos de lisis celular y extracción de proteínas

El primer paso en el aislamiento de una proteína es la lisis celular, para posteriormente
poder extraer la proteína total con un buffer adecuado. El método de lisis a seleccionar
depende de las características mecánicas del tejido, las células, así como de su localización.
Entre los distintos métodos están la lisis celular por agentes químicos como detergentes o
soluciones hipotónicas (útil para células sin pared celular como las células de tejidos
animales), la destrucción mecánica de tejidos en un mortero con arena y sonicación
(someter las células a vibraciones de ultrasonido) y por choque térmico con nitrógeno
líquido (-196 °C ) y pasándolas rápidamente a temperatura ambiente (25 °C).

Métodos de cuantificación de proteina

Los ensayos colorimétricos más utilizados son:

Ensayo de Lowry (750 nm): se trata de una reacción de redox con los enlaces peptídicos y
con los los aminoácidos Tyr, Trp y Cys. Es rápido, sencillo y relativamente sensible. Como
desventaja, es afectado por un amplio rango de compuestos no proteicos como EDTA,
sulfato de amonio, Tritón X-100.
Ensayo BCA (Bicinchoninine acid assay) (562nm): es más sensible que Lowry y puede
realizarse en un amplio rango de temperaturas. También es sencillo, pero requiere de
tiempos de incubación un poco más largos. Los complejos coloreados son muy estables.
Aunque es altamente susceptible a interferencias, no interfiere con detergentes y lípidos.

Ensayo de Bradford (595nm): es el doble de sensible que los dos anteriores. Es un método
rápido y muy sencillo y además no presenta interferencia con sustancias reductoras como
el DTT y el b-mercaptoetanol, que sí interfieren con los anteriormente mencionados. La
desventaja es que es altamente sensible a detergentes y lípidos.

OBJETIVOS
• Comparar métodos de extracción de proteínas a partir de diferentes fuentes.
• Cuantificar las proteínas resultantes de cada extracto.
• Preparar la curva patrón empleando una BSA como patrón.
• Cuantificar las proteínas mediante el método de Bradford.

REACTIVOS

• Buffer RIPA
• Arena Lavada
• PBS (buffer fosfato salino)
• Espinaca
• 2 gramos de hígado
• Cultivo de bacteriano en caldo
• BSA 1 mg/mL

MATERIALES

• Mortero
• Espátulas
• Papel filtro
• Embudo
• Vidrio reloj
• Micropipetas
• Cristalizador
• Tubos de ensayo
• Visturí o cuchillas
• Pipeta graduada de 5 mL
• Tubos para centrífuga
• Espectrofotómetro
• Centrífuga
Preparación de buffer RIPA: preparar una solución al 1 % Triton X-100, 1 % SDS, 1 mM EDTA
y 1 mM PMSF empleando como disolvente una solución 25 mM Tris – HCl y 140 mM NaCl
con un pH ajustado a 7.5.

PROCEDIMIENTO

1. Proteina a partir de material vegetal

a) Pesar 1.0 g de espinaca, picarla en pequeños trozos y macerarla en un mortero con

5 mL de buffer de extracción y 0,5 g de arena, filtrar y realizar un lavado al mortero
2 mL de buffer para limpiarlo.
b) Centrifugar el filtrado a 10000 rpm por 10 min. Recuperar el sobrenadante en un
tubo y contenerlo sobre hielo bien rotulado hasta su cuantificación.

2. Proteína a partir de tejido animal (hígado)

a) Colocar un 0,5 g de tejido animal en el mortero sobre el hielo.

b) Adicionar 200 μl buffer RIPA.
c) Homogenizar con el vástago hasta disgregar el tejido.
d) Centrifugar por 15 minutos a 10.000 rpm.
e) Colectar el sobrenadante en un tubo y contenerlo sobre hielo hasta su
cuentificación.

3. Proteína a partir de cultivo de bacterias

a) Colectar 1,5 ml de bacterias de un cultivo líquido por centrifugación a 5000 rpm por
3 minutos y descartar el sobrenadante
b) Repetir el paso a) en el mismo tubo para duplicar la cantidad de material de partida
c) Resuspender en aproximadamente 500 µl de buffer RIPA.
d) Sonicar la muestra. (3 ciclos de 10-20 segundos cada uno, intercalando con 2
minutos de incubación en hielo)
e) Centrifugar 15 minutos a 10000 rpm.
f) Colectar el sobrenadante en un tubo hasta su cuantificación.

CUANTIFICACIÓN POR EL MÉTODO DE BRADFORD

1. Preparar el reactivo diluyendo una parte del concentrado en 4 partes de agua

desionizada.
2. Preparar 5 diluciones de la proteína estandar (BSA) entre 0,03; 0,06; 0,01; 0,13; 0,16
y 0,2 mg/ml.
 3. Para cada muestra y estándar, pipetar 1 mL del reactivo y adicionar 20 µl de
muestra. (Use PBS en caso de ser necesaria la dilución de la muestra)
4. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos pero no más de una hora.
5. Medir la absorbancia a 595 nm. (tener presente la lectura del blanco fotométrico
para cada muestra, así como el blanco analítico)

Nota: Almacenar el extracto proteico correctamente rotulado a una temperatura de -20

°C para el desarrollo de la práctica de siguiente laboratorio.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son los principales métodos que se utilizan para purificar proteínas a nivel
industrial?
2. Describa el procedimiento que aplicaría para purificar las proteinas de la espinaca
teniendo en cuenta los elementos que dispone en la escuela de química.