Práctica 6

Aislamiento de ADN de un plásmido bacteriano

Objetivo: extraer ADN de plásmido de una bacteria mediante el método de lisis

alcalina y conocer la importancia biológica de los plásmidos así como la de los
vectores moleculares como herramientas para el clonaje de genes.

Fundamento
Un plásmido es una molécula de ADN circular, extracromosómico,
bicatenario, superenrrollado, que se replica de forma independiente del genoma
y que puede ser propagado en una población. Los plásmidos han sido descritos
en varios organismos como bacterias y hongos. Aunque la función de la mayoría
de los plásmidos descritos hasta ahora se desconoce, existen algunos que
pueden conferir ventajas selectivas al organismo que lo posee, como por
ejemplo la resistencia a agentes antimicrobianos. La presión selectiva que se
induce al aplicar un antibiótico no específico para el tratamiento de una infección
en particular genera en algunos casos un resultado contraproducente: al aplicar
por ejemplo un antibiótico para el cual las bacterias poseen un plásmido que les
confiere resistencia al mismo, se está seleccionando precisamente por una
población bacteriana que sobrevive al tratamiento y que eventualmente puede
contraatacar causando una infección más difícil de controlar. A su vez, al ser los
plásmidos transmisibles entre poblaciones, las bacterias resistentes pueden
transmitir esta información genética a su progenie o a bacterias vecinas las
cuales también se tornan resistentes. El fenómeno de resistencia a los
antibióticos es un problema causado por el mal uso de los mismos tanto en el
campo de la salud humana y la veterinaria. Esto a su vez se traduce en un reto
más exigente para la industria farmacológica, la cual debe generar antibióticos
con formulaciones novedosas en períodos de tiempo cada vez más cortos.

Debido a algunas características como lo son bajo peso molecular (en

comparación con un genoma) replicación independiente y rastreabilidad, los
plásmidos han sido modificados en el laboratorio para su uso como herramientas
de ingeniería genética. Estos plásmidos son conocidos como vectores. Los
vectores se utilizan como portadores de información genética exógena que
puede ser fácilmente aislada y amplificada en las bacterias en un procedimiento
denominado clonación de genes.

Algunas propiedades de los vectores de clonación son:

-Presentan un alto número de copias por célula

-La replicación es independiente del ADN del huésped
-Sus secuencias de nucleótidos completa es conocida para muchos vectores, lo
cual permite digerir con enzimas llamadas enzimas de restricción estas
secuencias para la posterior inserción del ADN en estudio.

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La bacteria de uso más común para contener los plásmidos o vectores a utilizar
en el laboratorio con fines de clonaje es conocida como Escherichia coli . Esta
bacteria es un huésped común del tracto digestivo de mamíferos, por lo tanto el
riesgo de infección por manipulación es bajo si es manipulada adecuadamente.
Las técnicas de aislamiento y purificación de plásmidos han tenido gran
desarrollo hoy en día lo que permite obtener preparaciones de cantidad y calidad
adecuadas que son la base de la mayoría de los protocolos en biología
molecular. Uno de los métodos más utilizados es el de desnaturalización alcalina
en presencia del detergente duodecil sulfato de sodio (SDS). Este método, que
utilizaremos en la práctica de laboratorio, se basa en las diferencias con respecto
a la forma y tiempo de desnaturalización y renaturalización del ADN de plásmido
versus el ADN cromosomal. Los plásmidos al tener un tamaño menor, pueden
ser separados fácilmente de las moléculas de ADN cromosomal que son
grandes y precipitan más rápidamente. El primer paso consiste en crear un
ambiente osmótico hostil para la bacteria y lograr así su lisis y consecuente
liberación del material genético. Para ello, las bacterias son puestas en contacto
con una solución de alta concentración de sales, glucosa y ácido etilendiamino
tetracético (EDTA) (solución I). Este último es un agente quelante de calcio (el
calcio es un ión estabilizador de las membranas bacterianas). Posteriormente se
agrega una solución (solución II) con una alta concentración de SDS e hidróxido
de sodio: en condiciones alcalinas (pH 11) el ADN se desnaturaliza. Sin
embargo, el ADN cromosomal al no ser tan compacto se desnaturaliza más
rápidamente que el ADN de plásmido . Cuando a esta solución se le agrega
acetato de potasio (solución III), el ADN desnaturalizado (cromosomal) forma un
agregado junto con el SDS y las proteínas bacterianas, el cual precipita,
mientras que el ADN del plásmido se mantiene en solución. La separación de la
fracción soluble de la insoluble se logra mediante centrifugación. Finalmente, el
ADN del plásmido es concentrado por precipitación con etanol. Debido a que
este procedimiento no garantiza una alta pureza, es posible que la muestra final
contenga trazas de ADNasas bacterianas que se acarrean durante el proceso de
extracción. Para evitar la degradación de las moléculas de ADN por estas
enzimas, se aconseja trabajar de forma rápida y con soluciones a baja
temperatura. Recuerde además que usted también es portador de ADNasas en
sus manos, saliva, lágrimas que pueden contaminar su muestra y dar al traste
con la extracción.

Materiales y reactivos
Medio enriquecido para el cultivo de las bacterias: medio Luria Bertani.
Bacteria: E coli conteniendo el vector pUC18. Importante: material infeccioso,
manejar con precaución. Si ocurre un derrame, llame inmediatamente al
instructor.
Antibióticos para la selección del plásmido
Solución I: 50 mM Tris.Cl, pH 8, 10 mM EDTA, 20 mM glucosa

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Solución II: 200 mM NaOH, 1% SDS
Solución III: 3 M Acetato de potasio
Etanol al 70% y al 95%
Amortiguador de Tris y EDTA (TE)
Hielo
Tubos descartables de 1.5 ml
Micropipetas y pipetas

Procedimiento
Preparación de las Células

Los plásmidos son preparados a partir de cultivos de bacterias en

presencia de agentes selectivos como antibióticos. (QIAGEN plasmid mini
Handbook, 1997)
Previo al inicio de la práctica se ha inoculado medio LB enriquecido
conteniendo antibiótico con una colonia de E. coli que contiene el plásmido que
le confiere resistencia y por lo tanto que permite su propagación. Se ha incubado
durante la noche a 37 º C y con agitación vigorosa.

Del medio de cultivo donde crecieron las bacterias se han hecho

alícuotas. Se han centrifugado y aspirado el medio quedando en el precipitado
las bacterias.

Lisis celular

Resuspender el precipitado de bacterias en 100 µl de la solución I

previamente enfriada. Se debe agitar vigorosamente para evitar que las células
se mantengan en grumos.

Agregar 200 µl de la solución II (Lisis) preparada recientemente a cada

suspensión de bacterias. Se cierran los tubos y se homogeniza invirtiendo el
tubo rápidamente alrededor de 5 veces. Para prevenir ruptura del ADN
cromosomal y por tanto la contaminación del ADN del plásmido con el mismo, se
debe agitar invirtiendo el tubo suavemente. Incubar el tubo por 5 minutos exactos
en hielo.

Agregar 150 µl de la solución III (Neutralización) previamente enfriada. Se

cierran los tubos y se homogeniza invirtiendo el tubo varias veces. El tubo se
incuba 3 – 5 minutos en hielo.

Centrifugar el lisado de bacterias a máxima velocidad por 5 minutos a 4

ºC. Tomar el sobrenadante obtenido luego de la centrifugación y pasarlo a un
tubo limpio.

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Recuperación del Plásmido

Para precipitar los ácidos nucleicos del sobrenadante se agregan dos

volúmenes de etanol al 95% a temperatura ambiente. La solución se agita
suavemente por inversión y se deja reposar por dos minutos a temperatura
ambiente.

Para colectar el precipitado de ácidos nucleicos se centrifuga a máxima

velocidad, a 4º C por 30 minutos.

Remover el sobrenadante por aspiración con la micropipeta hasta que se

observe el precipitado seco.

Para eliminar restos de sales, agregar 1 ml de etanol 70% e invertir el

tubo varias veces hasta disolver el precipitado. Centrifugar 5 min a 14 000rpm.

Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en un volumen

adecuado (50 µl) de amortiguador TE.

La solución se puede almacenar a -20 ºC y posteriormente la preparación

de ADN debe ser evaluada mediante electroforesis en gel de agarosa.

Resultados
Describa el patrón de migración que presenta el plásmido que extrajo en una
electroforesis en gel de agarosa (esta pregunta solo podrá ser contestada
cuando se realice la corrida electroforética, que por falta de tiempo, se realizará
en la próxima sesión de laboratorio).

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Bibliografía
Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts & P, Walter. 2007. Molecular
Biology of the Cell. 5th. ed. Garland Science. N.Y., EE.UU

Madriz, K. 2004. Manual de Laboratorio: Biología Molecular. Editorial Instituto

Tecnológico de Costa Rica. Cartago, C.R.

QIAGEN plasmid mini Handbook, Marzo 2006.

Sambrook, J & D, Russell. 2001. Molecular cloning: Laboratory Manual. Vol 1.

Editorial CSHL. EE.UU.

UNAM (Universidad Nacional Autónoma de México). 2000. Bioquímica y Biología

Molecular Manuales departamentales. Editorial Mc Graw-Hill. México.

Promega. Protocols and Applications Guide: The Source for Discovery. En:
http://www.promega.com/paguide/, consultado el 1 de febrero del 2010
La redacción de esta práctica fue elaborada con la colaboración de la Dra.
Lizbeth Ramírez.

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