Tecnológico Nacional De México Instituto

Tecnológico De Ciudad Madero

Carrera: Ingeniería Ambiental

Alumnas: Martínez de Blas Ana Gabriela

Vigil Maya Fatima Montserrat

Materia: Microbiología

Profesora: Salas Ordaz Lorena Margarita

Proyecto Unidad 3
3.1.2 Métodos directos e indirectos para l
a cuantificación del crecimiento microbiano.

Fecha: 23 de Octubre del 2023 CD. Madero

Tamaulipas
DETERMINACION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

El cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a cabo mediante el
recuento celular (microscopía, número de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrógeno
celular, turbidimetría) o actividad celular (grado de actividad bioquímica en relación al tamaño de la
población). Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos
indirectos.

 Métodos directos:

 Recuento del número de células en una cámara Thoma

 Peso seco celular
 Determinación de nitrógeno o de proteínas totales
 Determinación de DNA

 Métodos indirectos:

 Recuento de colonias en placa

 Recuento sobre filtro de membrana
 Consumo de oxígeno
 Liberación de dióxido de carbono
 Concentración de un enzima constitutivo
 Decoloración de un colorante
 Incorporación de precursores radiactivos
 Medida de la turbidez


LOS MÉTODOS INDIRECTOS DE CUANTIFICACIÓN DE

MICROORGANISMOS:
 MÉTODO DE LA REDUCCIÓN DEL COLORANTE AZUL DE METILENO (ENZIMA
REDUCTASA):
Para estimar el número aproximado de microorganismos en la leche cruda se utiliza un método
indirecto basado en la reducción del colorante azul de metileno que es un indicador de oxido-
reducción (es azul cuando está oxidado e incoloro cuando esta reducido). La actividad reductora de
los microorganismos se manifiesta por el tiempo de la reducción del colorante a una temperatura de
37 a 38 grados centígrados. La prueba de la reductasa sirve para controlar el estado higiénico y de
conservación de la leche. De manera general, esta prueba sirve para determinar el número de
microorganismos que la leche contiene y a su vez, esta prueba permite determinar el grado de
conservación de los diferentes productos lácteos, prevalecientes en nuestro medio, y así, por lo
tanto, juzgar su calidad como leche de consumo. Por este motivo la prueba de la reductasa es el
factor principal que se debe tomar en cuenta por el pago de las diferentes leches dentro de nuestro
medio. Este método es el más difundido en el mundo para apreciar la calidad de los suministros de la
leche a las fábricas y para fijar el precio según la calidad.
  CITOCROMO OXIDASA:
Esta enzima cataliza la reducción del oxígeno a H2O y es una importante terminal en el mecanismo
de la respiración de ciertas bacterias, la misma puede ser utilizada como una medida de activad
metabólica y del número de M.O. En la detección se utiliza una prueba de reducción de colorantes
con N, N1, N1 tetrametil - p – fenileno-diamina (TMPD), el cual ha sido extensamente utilizado en
importantes pruebas taxonómicas. La prueba fue utilizada en la
determinación y enumeración de psicrófilos Gram negativos en leche,
la misma es simples, fácil y rápida brindando resultados en 5 min. El
método puede detectar 104 ufc/mL o más, no siendo sensible para
determinar organismos psicrófilos en leche pasteurizada fresca.
Aunque luego de un período de preincubación puede ser utilizada para
predecir la calidad de la leche pasteurizada y productos lácteos.

 CATAL
ASA: La catalasa es una enzima presente en las células de la mayoría de los animales y
plantas, es una enzima perteneciente a la categoría de las oxidorreductasas que cataliza la
descomposición del peróxido de hidrógeno (H2O2) hacia oxígeno y agua. Esta enzima utiliza
como cofactor un grupo porfirínico de hierro. El peróxido de hidrógeno es un residuo del
metabolismo celular de muchos organismos vivientes y tiene entre otras funciones la de
proteger contra microorganismos patógenos, principalmente anaerobios, aunque dada su
toxicidad, ésta debe transformarse a compuestos no peligrosos. Esta función de
descomposición la lleva a cabo esta enzima que cataliza la descomposición hacia oxígeno y
agua. Además, la catalasa se utiliza en muy diversos procesos de tipo industrial, de
diagnóstico químico, clínico, veterinario, agropecuario, etc. Se puede ver en la industria textil
para la eliminación de peróxidos del blanqueado de telas, así como en casos detallados de
limpieza de lentes de contacto que hayan sido esterilizados con agua oxigenada o en
diagnósticos clínicos como la prueba de Elisa, o en la denominada acatalasemia, que es la
ausencia congénita de catalasa en sangre (conocida como enfermedad de Takahara
 caracterizada por fuertes infecciones gangrenosas en encías causantes de destrucción de los
maxilares.

 BIOLUMINISCENCIA: La Bioluminiscencia es otra técnica muy interesante. Se basa en una

serie de reacciones enzimáticas (generalmente a cargo de oxidasas) que cursan con una
emisión de luz y tiene lugar en determinados seres vivos, como por ejemplo en la luciérnaga.
Para su procedimiento se obtiene la enzima luciferasa de un coleóptero de la familia
Lampyres, el Photinus pyralis, la cual, en presencia de sus dos sustratos, luciferina y ATP
microbiano, produce una reacción bioluminiscente que se puede medir con un
espectrofotómetro. La luz emitida es proporcional a la cantidad de ATP presente en la
muestra, se puede por lo tanto hacer una estimación del número de M.O ya que el contenido
de ATP en las células bacterianas es generalmente constante (1 fg ATP/cel) sobre
circunstancias determinadas en las cuales la luciferina y luciferasa estén en exceso. El tiempo
requerido para el análisis es muy corto, aproximadamente 1 minuto, pero partiendo de la
preparación de la muestra, el tiempo tomado usualmente es de 5-15 minutos. La sensibilidad
de la prueba se ha movido desde 104 hasta 1 x 107 ufc/mL, con el empleo de equipos
semiautomatizados como el LUMAC RAW MILK MICROBIAL o más automatizado como el
BACTOFOSS.


MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP): El método de NMP consiste principalmente
en determinar la presencia o ausencia sea positiva o negativa de atributos específicos de
microorganismos en copias obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de
lácteos. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un
cultivo turbio. El método requiere la realización de una serie de diluciones en serie de la
muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de
un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de esos tubos y, pasado un
tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que recibieron una o más células microbianas
procedentes de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron
ninguna célula permanecerán transparentes.
 MÉTODO DE PESO HÚMEDO: Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es
pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil
para grandes volúmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda
atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de
líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy
empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de
acuerdo a la forma y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se determina la
cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugación,
para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextran) que pueden
ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.
 MÉTODO DE PESO SECO: Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por
filtración. Se expresan en g.m.s/mL. La principal desventaja de estas técnicas es que su
determinación incluye no sólo microorganismos activos sino microorganismos muertos,
material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica adsorbida. Además, no puede
aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los métodos gravimétricos son
simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles. A la vez este método este
método los componentes volátiles de las células pueden perderse en el secado y puede existir
alguna degradación. También la muestra seca pude recobrar humedad durante el pesado,
principalmente si el ambiente tiene humedad relativa alta.
 MÉTODO DE LA TURBIDIMETRÍA: La turbidimetría mide la luz dispersada como un
decrecimiento de la luz transmitida a través de la solución. Con relación a la longitud de onda
y al tamaño de la partícula pueden existir tres tipos de dispersión. Los métodos de dispersión
de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos
bacterianos. Son muy útiles y poderosos, pero pueden llevar a resultados erróneos.
Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido macromolecular).
Turbidimetría La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a partículas
de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios teóricos y experimentales
han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente
del tamaño celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso
seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente
proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo. Sin
embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad
Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por
esta razón, para estimar el número de microorganismos totales o el número de
microorganismos viables de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de
calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar
Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC.
MÉTODOS INDIRECTOS

 Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de

tiempo . Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados
por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos.
 Métodos turbidimétricos (ópticos). Son muy usados en la práctica cotidiana del laboratorio. La
base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o
transmitida a través de un cultivo bacteriano.

Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula
pequeña suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites,
proporcional a la masa del cultivo.

a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o

Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida
a través de la suspensión).

Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la masa
bacteriana en una muestra problema.

Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la

partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudes de
onda (l) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para >10 7céls/ml.
b) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo
recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada
directamente por la preparación. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro.

 Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una

graduación en superficie y unas medidas muy concretas:

excavación con 0.02 mm de profundidad;

área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes;
cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños.
O sea, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).

La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del
microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas
(normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células
observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

Ventajas: es un método muy rápido.

Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 céls./ml). Por
debajo de este valor el número de células vistas en el campo del microscopio es muy pequeño y
poco significativo estadísticamente. En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con
una mezcla de alcohol y agua.
 Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una
suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada
vez que por un orificio (30 mm diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la
corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el
tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del
pulso de voltaje al paso de la partícula).

Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partículas extrañas (las pequeñas
serían contabilizadas erróneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el orificio del
aparato).

 Recuento de viables en placa: Los métodos de recuento de número de células que hemos
visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En muchos casos
conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de
viables. (Una célula se define como viable cuando, colacada en un medio adecuado, es capaz de
 dividirse y dar descendencia). El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas
de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio sólido (con agar).
Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado de incubación.
Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de
alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original. (Para
esto, mira el ejemplo de la diapositiva, y sobre todo, estate atento a la práctica correspondiente,
que se suele realizar en la 3ª tanda).

Precauciones:

para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada
dilución;
hay que usar pipetas nuevas en cada dilución;
contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.
Como no podemos garantizar que cada colonia no proceda de más de un indiviudo (y esto es
especialmente cierto para bacterias que forman agrupaciones de 2 o más células), el recuento se
refiere no a “células viables reales” sino a “unidades formadoras de colonia” (UFC). Por lo tanto,
una UFC corresponde, como mínimo, a una bacteria, pero sobre todo en bacterias con
agrupaciones, la medida por siembr en placa infravalora el número real de individuos, porque cada
UFC puede corresponder a dos o más individuos que estaban juntos al ser sembrados en la placa.
 Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un
gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estériles (con
un diámetro de poro que retiene las bacterias pero permite el tránsito de sustancias).
Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias
se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se cuentan,
 deduciéndose la concentración original de viables en función del volumen de suspensión que se
hizo pasar por el filtro.

Recuento de masa por peso húmedo y seco: Se obtiene a partir de una muestra en
suspensión que es pesada luego de la separación de las células
por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de
muestra.
La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio
intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido
retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas
muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre
el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular. Para corregir
el peso húmedo se determina la cantidad de líquido que queda retenida en
el espacio intercelular luego de una centrifugación, para ello se utilizan
soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextrano) que pueden ingresar
en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.
El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se
encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en
un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes
volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos
representan el peso de un gran número de bacterias.
La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula
pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También
la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente
si el ambiente tiene una humedad relativa alta.

Recuento de masa por filtración: Consiste en hacer pasar un volumen

Recuento de masa por filtración: Consiste en hacer pasar un volumen determinado

de una muestra líquida a través de un filtro de membrana
microporosa en cuya superficie quedarán retenidos los microorganismos,
colocado en un equipo de filtración. Tras la filtración, el filtro se coloca sobre
la superficie de una placa de Petri con el medio de cultivo apropiado y se
incuba el tiempo/temperatura adecuados según el tipo de microorganismos
que se necesite analizar. Las bacterias formarán colonias sobre la superficie
de los filtros.

Turbidimetría: La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz

Turbidimetría: La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luzdebido a partículas de una
suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.
Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de
diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen
casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto
quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente
proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del
microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes
por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños
de las células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el
número de microorganismos totales o el número de microorganismos viables
de una suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con
cada tipo de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar
Absorbancia (Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o
con UFC.

BIBLIOGRAFÍA
1. https://www.studocu.com/es-mx/document/universidad-juarez-autonoma-de-tabasco/
microbiologia/metodos-para-medir-el-crecimiento-microbiano/29199160

2. https://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm#_Toc58934323

3. http://webcd.usal.es/Web/educativo/micro2/tema07.html#anchor598995