Facultad de Ciencias Biológicas–UNPRG

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
Asignatura de Biología Molecular

“UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO”

Facultad de Ciencias Biológicas

 
PRACTICA DE LABORATORIO 3: EXTRACCIÓN Y
PURIFICACIÓN DE ADN EN PLANTAS

DOCENTE
Dr. Cachay Wester Jorge Víctor Wilfredo 

ÁREA PROFESIONAL
Biología Molecular 

INTEGRANTES
Castillo Manayalle Juan
De la Cruz Collazos Luis
Sigueñas Chamay Jairo
Vallejos Bustamante Edin
Vásquez Olivera Linder
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Asignatura de Biología Molecular

PRACTICA DE LABORATORIO 3: EXTRACCIÓN DE ADN

I. INTRODUCCIÓN

En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones y

especies para explicar patrones y procesos ecológico-evolutivos se aborda mediante
marcadores moleculares, segmentos de ADN con o sin función conocida que proporcionan
inform ación sobre la variación alélica y permiten distinguir individuos (Alejos & Aragón &
Cornejo, s.f)

La purificación de DNA es un paso clave en la experimentación en Biología Molecular.

Los métodos de purificación de DNA se clasifican en dos grandes categorías, según pretendan
purificar DNA cromosómico o DNA plasmídico. La purificación de DNA plasmídico es la base
de cualquier experimento de clonación molecular. El problema principal que hay que resolver
es la separación del DNA plasmídico y DNA cromosómico (Prieto & López & Pueyo, s.f)

La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa

en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas
de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por
un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o
citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante
enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se
unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal. Los grupos
fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta
negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción.
Tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al
ADN en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero,
en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo
estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas
repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite. Por otro lado, la
carga neta negativa del ADN le permite unirse a moléculas y matrices inorgánicas cargadas
positivamente. (Ramos, 2018)
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Los métodos de extracción y purificación de ADN se diferencian por utilizar

detergentes catiónicos CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide). Por lo
general, la extracción de tampón se llama el método CTAB y es ampliamente utilizado en
plantas y vegetales, además de ser muy eficaz para la extracción a partir de una pequeña
muestra de tejido (Ferreira y Grattapaglia, 1998).

En un estudio de tesis se planteó tres protocolos de extracción de ADN vegetal

propuestos por Quintanilla et al. (2010), Cota et al. (2006) y Jobes et al. (1995) los que
posibilitan sustraer ADN de buena calidad, susceptible a secuenciación y técnicas de PCR. Para
el efecto que se producirá, se usaron de 2 a 5 miligramos de tejidos provenientes de 7 exsicados
de orquídeas recolectadas entre los años 1948 y 2011, preservadas en el Herbario “Lorenzo
Uribe Uribe, S. J.” de la Pontificia Universidad Javeriana- Bogotá (HPUJ). De los protocolos
supervisados, el más efectivo fue Quintanilla et al. ya que con este se obtuvieron productos de
PCR en 6 de las 7 muestras estudiadas, y las relaciones de pureza ADN/Proteína (260/280 y
60/230) fueron las más óptimas. (Molina, 2011)

Por último se puede afirmar que existe una interacción de manera directa y proporcional
entre la proporción de tejido y la concentración ADN. Se pudo sustraer, amplificar y secuenciar
el ADN perteneciente de exsicados de orquídeas con más de 40 años de preservación. El
análisis del ADN antiguo es un instrumento fundamental para implantar una base molecular
confiable, que posibilite hacer un análisis de Código de Barras molecular que ayudará a los
herbarios a hacer una categorización más segura y corroborar probables errores en la
taxonomía de los exsicados. (Molina, 2011)
II. OBJETIVOS
Objetivo General
 Conocer y evaluar los protocolos de extracción y purificación de ADN en plantas para
asegurar la calidad del ácido nucleico requerido.
Objetivos Específicos
 Conocer los protocolos de extracción y purificación de ADN en plantas para asegurar la
calidad del ácido nucleico requerido.
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 Evaluar los protocolos de extracción y purificación de ADN en plantas para asegurar la

calidad del ácido nucleico requerido.

III. METODOLOGÍA

La metodología llevada a cabo en esta práctica de laboratorio se inicia con la preparación

de dos conjuntos de muestras que cada una será identificada, enumerada y codificada según
especie (Oryza sativa y Solanum tuberosum), edad aproximada y parte de la planta a ser
utilizada. Luego se adiciona el Nitrógeno líquido en cantidad suficiente para poder cubrir los
tejidos que serán triturados hasta que el tejido este congelado. Después este tejido será triturado
en un mortero hasta ser pulverizado. Luego se adiciona 700 µl de tampón de extracción 2x
CTAB para resuspender el tejido con la ayuda de un estilete. Inmediatamente se incuba los
tubos en baño maría a 65°C durante 30 minutos como mínimo y se agita por 10 minutos los
tubos hasta lograr homogenizar la suspensión. Se retira los tubos del baño maría y se deja
enfriar. Posteriormente se realiza la extracción con un solvente orgánico, agregando 600 µl de
CIA y se agita los tubos durante 5 minutos, invirtiéndolos hasta 20 veces para obtener una
emulsión homogénea. Luego se pasa a centrifugar en un microcentrífuga a velocidad máxima
de 12000-15000 RPM durante 5 minutos, para después retirar los tubos de la centrifuga
cuidadosamente sin mezclar las dos fases obtenidas hasta regular la micropipeta a 180 µl para
transferir el sobrenadante aun tubo nuevo, Para transferir una cantidad total de 540 µl.
Siguiendo con el procedimiento se adiciona 2/3 del volumen de la solución acuosa con una
aproximación de 400 µl de Isopropanol helado a 20°C para así mezclar suavemente la
´precipitación de los Ácidos Nucleicos. Luego pasáramos a centrifugar a 6000-7500 RPM (3-5
minutos). Si es necesario se centrifuga a 13000 RPM por 10 minutos si el precipitado no fuese
visible se debe llevar a congelación el tubo a 20°C y centrifugarse nuevamente. Después se
descarta el sobrenadante suavemente sin perder el precipitado, se lava y mezcla el Pellet dos
veces con 400 µl de Etanol al 70%, a continuación, se centrifuga a 800013000 RPM para
descartar el sobrenadante. Al lavar el Pellet con 500 µl de etanol al 95 % o con etanol absoluto
helado. Se centrifuga a 8000-13000 RPM y descartar el sobrenadante suavemente y dejar secar
por 1-2 horas. Finalizando, se resuspende el pellet en 25-100 µl de TE (20:5)
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IV. RESULTADOS

PROTOCOLO DE EXTRACCION Y PURIFICACION DE ADN EN PLANTAS

• Las hojas serán cortadas, pesadas y distribuidas en tubos eppendorf, conteniendo cada uno
100 mg de tejido foliar.

• Para cada extracción será utilizados 700 µl de tampón de extracción. Calcular la cantidad
necesaria multiplicando el volumen por la cantidad de muestra más algunos mililitros.
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• Adicionar 2 µl de β-mercaptoetanol por cada mililitro de tampón.Mantener el tampón en

baño maría a 65°C.
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• OBS: Las muestras de Arroz (Oryza sativa) presentan gran cantidad de rendimiento de
ADN con relativamente poca cantidad de material foliar, por lo cual serán utilizadas
cantidades menores a 100mg

PROCEDIMIENTO

1. Preparar dos conjuntos de muestras, cada una identificada, enumerada y codificada

según especie, edad aproximada de la planta y parte de la planta a ser utilizada.

2. Oryza sativa 1. Solanum tuberosum

Edad: 25-35
2. Adicionar Nitrógeno Edad:
días en cantidad suficiente para
liquido 64-130
cubrir los días
tejidos a ser
triturados yParte utilizada:
esperar hojas
hasta que el tejido este congelado. Parte utilizada: hojas

3. Triturar o macerar el tejido con un mortero hasta pulverizar todo el tejido.

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4. Adicionar 700 µl de tampón de extracción 2x CTAB. Resuspender el tejido en el

tampón con auxilio de un estilete.

5. Incubar los tubos en baño maría a 65°C durante 30 minutos como mínimo. Durante la
incubación, agitar por 10 minutos los tubos para homogenizar la suspensión.

6. Retirar los tubos del baño maría y dejarlos enfriar.

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7. Realizar la extracción con solvente orgánico, agregando 600 µl de CIA (Cloroformo:

Alcohol Isoamilico).

Agitar los tubos durante 5 minutos, invirtiéndolos hasta 20 veces para obtener una
emulsión homogénea.

8. Centrifugar en microcentrifuga a velocidad máxima de 12000-15000 RPM durante 5

minutos.
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9. Retirar los tubos de la centrifuga cuidadosamente sin mezclar las dos fases obtenidas.

Regular la micropipeta a 180 µl para transferir el sobrenadante (fase acuosa) aun tubo
nuevo. Transferir una cantidad total de 540 µl

10. Adicionar 2/3 del volumen de la solución acuosa (aprox 400 µl) de Isopropanolhelado
(20°C). Mezclar suavemente para precipitar los Ácidos Nucleicos.
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11. Centrifugar a 6000-7500 RPM durante 3-5 minutos. Si es necesario centrifugar a 13000
RPM por 10 minutos. Si el precipitado no fuese visible, llevar a congelación el tubo a
20°C y centrifugue nuevamente.

En la Centrifugar se le lleva a una velocidad máxima de 12000-15000 RPM durante 5 minutos.

12. Descartar elmicropipeta
Regular la sobrenadantea 180suavemente sin elperder
µl para transferir el precipitado
sobrenadante (Pellet).
(fase acuosa) aun tubo nuevo.

En el siguiente Adicionar 2/3 del volumen de la solución acuosa (aprox 400 µl) de Isopropanol helado(-
20°C). Mezclar para precipitar los Ácidos Nucleicos. Centrifugar a 6000-7500 RPM durante 3-5 minutos.

13. Lavar y mezclar el Pellet dos veces con 400 µl de Etanol al 70%, Centrifugar a
800013000 RPM y descartar el sobrenadante.
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14. Lavar el Pellet una vez con 500 µl de etanol al 95 % o con etanol absoluto
helado.Centrifugar a 8000-13000 RPM y descartar el sobrenadante suavemente y djar
secar por 1-2 horas.

15. Resuspender el pellet en 25-

100 µl de TE(20:5)

Finalmente tenemos la muestra en el

procedimiento , explicado paso a paso
en el cual se le llevara al laboratorio y
guardas la presente muestra .
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REACTIVOS: Kit de Extracción

1 Tubo Falcon 15 ml Tampon de extracción CTAB 2X
1 Tubo Falcon 15 ml Alcohol Isoprpilico helado
1 Tubo Falcon 15 ml Etanol 70% helado
1 Tubo Falcon 15 ml Etanol 95 % helado
1 Tubo Falcon 15 ml Tampon TE 20:5

MATERIALES

• 1 pipeta de 20 µl
• 1 pipeta de 200 µl
• 1 pipeta de 1000 µl
• Puntas de 1µl
• Puntas de 10 µl
• Puntas de 50 µl
• Eppendorf de 1.5 ml
• Eppendorf de 0.5 ml
• Soporte para eppendorf
• Baño maria
• Tijera
• Mortero
• Estilete
• Marcador indeleble
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PREPARACION DE REACTIVOS

Preparar las siguientes soluciones madre en 100 mL

Tris-HCl 1 M

NaCl 5 M

EDTA 0.5 M

CTAB 10%

PVPP (polyvinyl polypyrrolidine) 1% (w/v) B-

mercaptoethanol 2% (v/v)

Preparar el siguiente CTAB extraction buffer 2X en 100mL

100 mM Tris-HC1 (pH 8.0)
1.4 M NaC1
20 mM EDTA
2% (w/v) CTAB
0.1% (w/v) PVPP (polyvinyl
polypyrrolidine)
0.2% (v/v) B-mercaptoethanol
Agua destilada

Preparar la siguiente solución de TBE 5x en 1000 mL

Tris Base
Acido Borico
EDTA 0.5M pH 8.0
Agua destilada

Preparar la siguiente solución de T.E. 20:5 en 100 mL

10 mM Tris –HCl pH 8.0
1mM EDTA pH 8.0
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Agua desilada
V. DISCUSIÓN

El crecimiento del número de protocolos de extracción de ADN para especies de plantas

específicas sugiere que la extracción de ADN no es siempre simple y los protocolos publicados

no son necesariamente reproducibles para todas las especies. El problema a menudo encontrado

durante la extracción de ADN es separar el ADN de los contaminantes que existen naturalmente

en la célula de la planta, tales como polisacáridos y compuestos fenólicos. Estos compuestos en

sus formas oxidadas se enlazan covalentemente a los ácidos nucleicos durante la extracción y los

inutilizan para la mayoría de las aplicaciones en investigación. Los polisacáridos son

visualmente evidentes en extracciones de ADN por su textura viscosa, como de goma, y hacen

que el ADN sea no manejable en el pipeteo y no amplificable en el PCR debido a la inhibición

de la Taq ADN polimerasa.

Para la identificación de una especie, el primer paso es el aislamiento del material genético, los

cuales deben estar lo suficientemente puro para su manipulación y amplificación. Actualmente

existen muchos tipos de sistemas comerciales que permiten la extracción del ADN a partir del

material vegetal, pero no hay que descartar el uso de otras técnicas que han sido propuestas con

el fin de disminuir la interferencia que provoca el alto contenido de polifenoles o polisacáridos

en determinadas especies como los Agaves y las Anonáceas. Esta interferencia en la muestra trae

consigo la disminución de la pureza y el rendimiento del A-DNA. Las técnicas moleculares

requieren de protocolos que permitan determinar los niveles de variación genética dentro de las

poblaciones, en diferentes condiciones ambientales y la caracterización de los recursos

filogenéticos. Es esencial contar con métodos adecuados de aislamiento y purificación del ADN
que permita la aplicación de diversas técnicas de biología molecular, así como de eficientes

protocolos para la amplificación del ADN mediante marcadores.

El aislamiento del ADN en el caso del arroz, es un proceso básico e importante para las

evaluaciones, de su calidad y cantidad dependen diversos estudios genéticos útiles para el

mejoramiento de los cultivos. Ya que continuamente se busca aumentar los rendimientos,

aplicando diferentes técnicas incluyendo la selección asistida por marcadores y la producción de

arroz híbrido. El protocolo consiste en macerar el grano de arroz en un tubo y adicionar un buffer

a base de urea, adicionar fenol-cloroformo y el sobrenadante se precipita con isopropanol, el

producto de la extracción se puede diluir a 35 ng /μl y usarse en una PCR para la amplificación

exitosa de cloroplasto, mitocondrial, y regiones genómicas.

El uso de los marcadores microsatélites (SSR) para estudios de diversidad genética en papa, es

de suma importancia para el manejo de los bancos de germoplasma (colecciones núcleo,

detección de duplicados), en programas de mejoramiento genético, en la micropropagación y en

la producción de papa semilla.

VI. CONCLUSIONES

 La extracción de ADN con material cotidiano es una de los puntos de actividad práctica
interdisciplinar, ya que para determinar cómo extraer ADN de una muestra biológica es
preciso relacionar conceptos químicos, físicos y biológicos en los estudios de
polimorfismos genético vegetal a nivel de ácidos nucleicos deben de contar siempre con
un protocolo de extracción y purificación de ADN eficiente, lo que viabilizara su empleo
en diversos estudios y a la vez la obtención de resultados con un alto grado de
confiabilidad.
 Se logró conocer la implica en el protocolo para la extracción y purificación del ADN en
plantas, en este caso, se realizó dicho procedimiento con muestras foliares de Arroz
(Oryza sativa) las cuales fueron cortadas y pesadas previamente para ser colocadas en
tubos eppendorf, luego pasaron por procesos de trituración, resuspensión y centrifugación
constante, aplicando diversos reactivos para la obtención del pellet, que a su vez fue
lavado y resuspendido para conseguir ADN en condiciones de pureza.
 En la evaluación de los protocolos para la extracción de ADN, los resultados obtenidos
en esta investigación concuerdan con los reportados por Ferrer para otra especie leñosa
tropical (Gmelina arborea), quien empleando el mismo protocolo obtuvo ADN en
concentración y calidad suficiente para el desarrollo de la técnica RAPD en estudios de
diversidad genética. Culminando la práctica se ha comparado y evaluado los protocolos
de extracción y amplificación de ADN en plantas, además se definió el protocolo a
utilizar al momento de la extracción y amplificación del ADN en plantas (Oryza sativa).
También se diseñó el procedimiento seguido por el protocolo establecido para la
extracción y amplificación del ADN en plantas (Oryza sativa), además mediante la
fórmula de la molaridad se pudo obtener resultados certeros para que así los reactivos de
extracción de ADN en plantas sea el preciso. El método de extracción de ADN
desarrollado es muy riguroso además de ser potencial de mejoramiento y confiabilidad
para ser incorporados en los programas de mejoramiento de cultivos por selección
asistida con marcadores moleculares.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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1#:~:text=La%20extracci%C3%B3n%20consiste%20en%20el,caracter%C3%ADsticas
%20fisicoqu%C3%ADmicas%20de%20la%20mol%C3%A9cula.&text=Tienen%20una
%20fuerte%20tendencia%20a,hidratante%20alrededor%20de%20la%20mol
%C3%A9cula.