Bioquímica y Función Celular

Informe de Laboratorio
Práctica No. 2, 28/02/2024

AMINOÁCIDOS: CURVAS DE TITULACIÓN Y SEPARACIÓN

POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Maria Alejandra Gonzalez Ortiz1, Yuli Alejandra Torres Requinivar2
Brayam Alejandro Rodriguez Lesmes3
Programa de Biología, Departamento de Biología y Química,
Universidad de los Llanos
Vereda Barcelona, km 12 vía a Puerto López, Villavicencio 500017, Meta, Colombia.
1
magonzalez.ortiz@unillanos.edu.co, 2 yatorres.requiniva@unillanos.edu.co,
3
barodriguez.lesmes@unillanos.edu.co

Resumen- Los aminoácidos son las bases de las proteínas y están compuestas por un grupo amino y un grupo carboxilo
en un extremo,que se pueden analizar mediante técnicas como la titulación y la cromatografía que son importantes para el
estudio de los aminoácidos permitiendo determinar sus propiedades físico-químicas. Entendiendo la importancia de estas
técnicas para entender los aminoácidos, se obtuvo en el laboratorio que La leucina tuvo un pK 1 de 2.063 y pK2 de 9.906 con
un punto isoeléctrico similar al teórico de 5.985 es por esto que cuenta con regiones de capacidad tamponante, y por la
cromatografía se obtuvo prácticamente datos que relacionan los aminoácidos según su capacidad polar la polar tienen más o
menos desplazamiento en la placa.
Palabras Clave- , Aminoácidos, cambio pH, concentración, cromatografía, leucina.

I. INTRODUCCIÓN
Los aminoácidos son las piezas estructurales que en
conjunto dan a los polímeros con la unión de varios de
estos obtenemos las proteínas, estas son fundamentales
para los procesos metabólicos en los seres vivos,
viéndolos como los que permiten la vida en sí. La unión de
estos polímeros de sa gracias a la propiedades de enlace
covalente que tenga el aminoácido final e inicial de la
cadena. Los principales aminoácidos son veinte siendo los
más comunes en la proteínas y así mismo los esenciales
para la continuidad de los procesos vitales. Todos estos
poseen un grupo carboxilo y un grupo amino de ahí su
nombre particular, estos dos grupos se encuentran unidos
a un mismo carbono [1].
Existen los aminoácidos según tipo por polaridad y
carga presente, por un lado los hidrófobos, estos poseen
cadenas laterales no polares las cuales tienen una
relación de interacción directa con el agua. Algunos de
los aminoácidos de este tipo se encuentran en la Alanina,
Valina, leucina y otras. Además de esto, este tipo de
aminoácido se encuentra comúnmente en el interior de
las proteínas y no es frecuente que participen en
reacciones químicas. De segunda mano tenemos los de
tipo polar, estos se caracterizan por su facilidad de
interacción con el agua, esto es gracias a la presencia de
grupos con capacidad de formar puente de hidrógeno.
Algunos de estos aminoácidos son la Serina, Treonina,
Tirosina y otros [2].
Un aminoácido importante para el proceso metabólico en
los mamíferos es la leucina, esta cumple una función
reguladora en el sistema, este se encuentra clasificado
como de tipo esencial esta categoría se debe a la
imposibilidad del organismo para sintetizar por sí mismo
así que se debe obtener de forma externa. Dentro de este
encontramos los grupos R, este determina su carácter de
capacidad por polaridad, para el caso de la leucina se da
como apolar. Los grupos que caracterizan a los
aminoácidos dentro de su estructura son ionizables lo que
conlleva a que actúan como ácidos y bases según el caso
de reacción, así se da la necesidad de realizar curvas de
titulacion con relacion de su pKa el cual indica la zona
donde las concentraciones del que dona electrones es la
misma a la que los está recibiendo [3] y [4].
La cromatografía se basa en la separación las sustancias
que componen a una inicial de la que se desee conocer su
composición, esto por disolución de la misma se da la
retención de los distintos diferenciándose en sí la por su
nivel de desplazamiento. Se encuentra en esta misma dos
fases, una estacionaria y otra la fase móvil. Aquí se
encuentra por la diferencia entre el punto de partida de los
analitos contra la línea final de las fase móvil, obteniendo
como resultado su factor de retención. Para la
cromatografía de capa fina son de principal importancia
los absorbentes por buena selección, siendo los
disolventes los que determinan la velocidad de migración
[5].

1
Fig 1. Estructura general de un aminoácido.

Fig 3. Ascenso de la fase móvil en placa de sílica gel

Fig 2. Proceso de cromatografía en capa fina.
III. Resultados
II. METODOLOGÍA

-Titulación de aminoácido (leucina) Se determinó pK1=2.063.

Se inició preparando el ph-metro con una debida
limpieza con agua destilada para comenzar con las
titulaciones correspondientes al aminoácido elegido,
leucina, se demostró 50 ml de esta en un vaso
precipitado, junto con ello en el montaje para la bureta se
llenó con HCl, luego se comienza la agregación de 1ml de
ácido, al mismo tiempo se anotó el valor de ph por cada
adicion de acido. En armonía a ello para la segunda
titulación se repitió lo anterior cambiando el titulante por
NaOH, igual se tomó el dato de pH por cada adición de la
base a 1 ml. Con los datos obtenidos se graficó tres
curvas de titulación, una para el ácido, una segunda para
la base y por último una en conjunto de los dos para
hallar los pKa y el punto isoeléctrico de la leucina.

-Cromatografía en capa fina (distintos aminoácidos).

Fig 4. Curva de titulación de Leucina con HCl al 0.189N.
Se inició con la placas ya preparadas gracias al
laboratorio, con la siembra de las muestras, esta se Se determinó pK2= 9.906
realizó a una distancia de 1,5 cm desde el borde inferior
de la placa, se sembraron dos placas con dos
aminoácidos distintos en cada una, para la placa A se
sembró Metionina y Leucina, en la placa B se sembró
Desconocido y Arginina. Luego se de la siembra con
capilares se insertaron las dos placas en la cámara de
aire, se dejaron reposar hasta visualizar el desplazamiento
del líquido a la línea final superior marcada a 1 cm del
borde final. al finalizar la fase móvil se dejó secar las
placas al aire libre, al estar completamente secas se les
roció con un atomizador de ninhidrina para lograr la
tinción de los puntos de llegada de los analitos, por último
se re posaron, midieron para el cálculo de Rf de cada
aminoácido sembrado. se tomaron evidencias
fotográficas señalando sus distancias y valores de Rf para
cada uno.
Fig 5. Curva de titulación de Leucina con NaOH al
0.203N.

Con los pK se determinó Pi=5.985

2
Fig 6. Fusión de curvas de titulación invirtiendo la de HCl,
con punto isoeléctrico representado.
Fig 8. Desplazamiento en placa cromatográfica de B1:
TABLA I
Desconocido, B2: Arginina.
Factores de retención determinados para cada
aminoácido en siembra.
IV. Discusión

Metionina 0.64 La curva de titulación en el caso de los aminoácidos, se

Leucina 0.70 utiliza para obtener representaciones de los grupos
Desconocido 0.22 ionizables, las zonas tamponantes y el punto isoeléctrico.
Arginina 0.26 En esta práctica , se realizó la curva de titulación de la
leucina, la cual cuenta con dos grupos ionizables, el de su
grupo carboxilo y su grupo amino y debido a que los
aminoácidos contienen estos grupos ionizables, la forma
iónica predominante de estas moléculas en solución
depende del pH. [5].
La titulación de un aminoácido se puede fraccionar en
etapas, que corresponden a la desprotonación de los dos
grupos con los que cuenta la leucina; la primera etapa, el
grupo de la leucina pierde su protón y es aquí donde se
encuentra el , de manera teórica, el de la Leucina se
muestra como 2.36 y de manera práctica se obtuvo una
pequeña variación teniendo como resultado de 2.063; a
medida que avanza la titulación se alcanza el punto
isoeléctrico donde se completó la eliminación del primer
protón y comenzó la eliminación del segundo, es decir,
que el 50% de las moléculas tendrán carga neta +1 y el
50% de las moléculas tendrán carga neta 0, en este punto
de manera teórica se cuenta con un pH de 5.98 que de
igual forma se obtuvo de manera práctica el pH 5.98.
Durante la segunda etapa se elimina el grupo , se alcanza
el que en su forma teórica se muestra como 9.60 mientras
que en la práctica se obtuvo un pKa de 9.90 , la leucina
existe en una forma completamente protonada como
catión, en este caso la titulación procede con NaOH, la
Fig 7. Desplazamiento en placa cromatográfica de A1: leucina pierde sus protones y a pH isoeléctrico (pI), se
Metionina, A2: Leucina. convierte en un zwitterion.
Estos valores de igual manera son distintos a los teóricos
y a los valores obtenidos durante la práctica, sin embargo,
todos son similares y entran en los rangos de las zonas
tamponantes por lo que se pueden considerar correctos.
En la proximidad de los pKa, el pH cambia muy poco. En
otras palabras es aproximadamente igual a en la región
del pKa. Si un ácido débil está dentro de una unidad de
pH=pKa, está dentro de un buen rango de
almacenamiento en buffer. Por lo que, al obtener la gráfica
de titulación se puede deducir que la leucina cuenta con
dos regiones de capacidad tamponante. Una de estas es

3
la porción relativamente plana de la curva y la otra zona de VI. AGRADECIMIENTOS
taponamiento [6].
En cuanto a la cromatografía de aminoácidos como Se le agradece al personal de laboratorio por permitir
estos están compuestos de una cadena lateral R, mientras el material y espacio a disposición para la práctica. A la
esta cadena sea más apolar tendrá una tendencia a profesora presente y compañeros.
desplazarse junto con la fase móvil mientras que los
aminoácidos que tengas una cadena más polar ya sean VII. REFERENCIAS
con carga o sin ella no migran debido a la fase
[1]Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M., Simoes, A.
estacionaria es por ello que la fase móvil está compuesta
A., & Lodi, W. R. N. Principios de bioquímica.
por disolventes que son más apolares que el agua y esta a
Principios de bioquímica (pp. 839-839), 1995.
su vez es la fase estacionaria [7].
En esta práctica se usó una placa recubierta con sílica
[2]Pratt, Charlotte W., and Kathleen Cornely. Essential
gel como fase estacionaria y una mezcla de disolventes
Biochemistry. Wiley, 2011.
orgánicos (n-butanol, ácido acético y agua) como fase
móvil. La separación de los aminoácidos se basa en las
[3]Garlick, P. J. The role of leucine in the regulation of
diferencias en las interacciones de sus cadenas laterales
protein metabolism. The Journal of nutrition, 135(6),
con las dos fases. Los aminoácidos apolares o no polares
1553S-1556S, 2005.
(como leucina y metionina) tienen menor afinidad con la
fase estacionaria polar (sílica gel) y por lo tanto migran
[4] DE LOS AMINOÁCIDOS, ESTRUCTURA Y.
más fácilmente con la fase móvil orgánica. Por otro lado,
NOMENCLATURA. "ESTRUCTURA Y PROPIEDADES
los aminoácidos polares o iónicos (como arginina)
DE AMINOÁCIDOS Y PÉPTIDOS.", 2011.
interactúan más fuertemente con la sílica gel a través de
puentes de hidrógeno o interacciones ión-dipolo, migran
[5]Mckee T, Mckee JR. Bioquímica. La base molecular de
más lentamente. El factor de retención (Rf) es un
la vida. ed. Editorial fondo educativo interamericano.
parámetro clave que permite identificar los aminoácidos
pp. 109-125, 2014.
separados al compararlos con valores de referencia.
Cuanto mayor sea el Rf, menor es la retención del
[6]Nelson D.L, Cox M.M. Lehninger. Principios de la
aminoácido en la fase estacionaria. Además de la
bioquímica. ed. Editorial Omega. pp. 81-85, 2019.
polaridad, otros factores como el punto isoeléctrico (pI)
del aminoácido y el pH de la fase móvil influyen en la
[7]Adriana, C. Técnicas de análisis de química orgánica
separación, ya que determinan la carga neta y por tanto
CROMATOGRAFÍA, 2019.
las interacciones. En el caso del "aminoácido
desconocido", su baja migración sugiere que se trata de
un compuesto polar o iónico. La comparación de su Rf
con patrones permitiría su identificación.

V. CONCLUSIONES

El carácter anfotérico de la leucina, se logra comprobar

gracias a las curvas de titulación. Así mismo los pK que se
determinan prácticamente varían levemente respecto a los
teóricos tanto como el punto isoeléctrico determinado
indicado por la literatura.

Técnicas como la cromatografía y las titulaciones

permiten estudiar las propiedades físico-químicas de los
aminoácidos, lo cual es fundamental para comprender su
papel en sistemas biológicos complejos dentro de
grandes sistemas metabólicos principalmente celulares.
junto a la cromatografía de capa fina lograr el cálculo del
factor de retención (Rf) permite comparar la migración
relativa de los aminoácidos separados con patrones
conocidos para su identificación.

Los comportamientos de los aminoácidos dependen de

su R y grupo identificado, esto les da la variabilidad de
actuar tanto como ácidos o bases llegando a una relación
directa con el pH y su mismo equilibrio arrojando el
carácter de tener 2 o más pKa para las zonas buffer.