TALLER GRUPAL DE LABORATORIO

BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL

G6 Integrantes: Douglas Sancho - Ana Delgado - Sebasthiane Alvarado - Giuliana Guerra - Gabriel
Morán

ALGAS

● Técnica de aislamiento en medio sólido y líquido (Nitrogenado y fosfatado)

Del libro Methods in Microalgal Studies por Milagrosa R. Martinez-Goss, Windell L.

Rivera, and Nerissa K. Torreta.
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En el artículo “Aislamiento y Cultivo de Microalgas Bentónicas Del Caribe Colombiano

Bajo Diferentes Condiciones De Temperatura” nos dicen cómo se realizaron estas
técnicas de aislamiento citan lo siguiente: para el medio sólido se tomaron las muestras
respectivas de cada cultivo de Perifiton y se sembraron individualmente en cajas Petri
con medio de cultivo Guillard F/2 (15ml) y agar (20g/l de medio) Estos cultivos sólidos se
colocaron en la temperatura de la cual procedían y bajo las mismas condiciones
ambientales descritas anteriormente(20, 25, 28 °C). Luego, se repitió el procedimiento
por lo menos tres veces usando como inóculo muestras de las diferentes colonias que
se desarrollaban en este medio hasta verificar el aislamiento de una sola especie, de
acuerdo a la tipificación de la colonia y su verificación bajo el microscopio.

Para el medio líquido se tomaron muestras de perifiton provistas de medio de cultivo y

se evaluó el tipo y número de especies aisladas bajo tres temperaturas (20, 25 y 28 °C).
Los tubos de ensayo fueron colocados en gradillas plásticas inmersas en baños
termorregulados, mantenidos con una iluminación constante (1500 lux) y con valores
iniciales de pH de 7,0 y salinidad de 30‰. Diariamente se tomaron tres muestras (1 ml)
de cada tubo de ensayo con cultivo primario las cuales se examinaron bajo un
microscopio de luz para detectar la presencia de microalgas y se aplicó la técnica de
diluciones seriadas de 1:10 a aquellas muestras positivas . Las microalgas aisladas
fueron mantenidas en medio líquido en tubos de ensayo en el cepario

En la sección de "Bibliografía" se menciona el artículo de Adenan et al. (2013), que trata

sobre el efecto de la salinidad y la temperatura en el crecimiento de diatomeas y algas
verdes y también citan el artículo de Brito et al. (2006), que trata sobre el crecimiento de
microalgas de agua dulce en diferentes medios de cultivo, incluyendo el medio Guillard,
que es rico en nitrógeno y fósforo el cual fue utilizado en artículo ya antes mencionado.
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● Identificación taxonómica mediante visualización microscópica por tinción simple

En el documento “Catálogo de Microalgas y Cianobacterias de Agua Dulce del Ecuador”

podemos limitar nuestra búsqueda al Filo Chlorophyta, donde nos indican que los
cloroplastos están rodeados de doble membrana, sin retículo endoplasmático.

El libro “Methods in Microalgal Studies” sugiere utilizar tintura de yodo como un método
de tinción, en donde las estructuras de carbohidratos se teñirán aportando un dato a la
hora de definir la taxa. Sin embargo, su incorporación en las células puede oscurecer la
presencia de algunas características citológicas, especialmente si las células contienen
gránulos de almidón.

Además, no se recomienda la solución de Lugol, ya que este tiende a disolver

estructuras duras como los cocolitos y los fustulas de diatomeas y, por lo tanto, no es un
conservante ideal para estos taxones.

Por otro lado, en el capítulo XVI Taxonomic Studies of Philippine Microalgae detalla
detenidamente el procesos de clasificación filogenética mediante técnicas moleculares,
resaltando la importancia de su análisis para el aprovechamiento de su potencial en
investigaciones biotecnológicas. En este tomo indica el uso de marcadores moleculares
específicos del genoma nuclear (18s rRNA, ITS-2) y del cloroplasto (1,5-biphosphate
carboxilasa/oxigenasa).

● Determinación indirecta del potencial biorremediador: Técnicas basadas en el

crecimiento en medio líquido por conteo de células viables en cámara de neubauer o
medición del contenido de clorofila mediante espectrofotometría UV/VISIBLE.

Para realizar un conteo de células con cámara de

neubauer es importante antes identificar la microalga
que se encuentre en un estado de crecimiento
exponencial (presentará coloración oscura) y luego
contar la cantidad de células que hay presentes en el
recipiente de cultivo.

Procedimiento

1. Almacenamiento y preparación de muestra:

Antes del recuento es necesario concentrar o diluir la muestra de agua. Si la población

es escasa, se puede concentrar mediante sedimentación, filtración o centrifugación.

La sedimentación tiene la ventaja de minimizar el daño a las células, pero requiere

mucho tiempo.

La filtración puede ser un método más rápido, pero existen los problemas de separar las
células del papel y la posibilidad de perder células diminutas en el filtrado. Para este fin
se ha adoptado la centrifugación porque minimiza la pérdida de organismos y es un
método más rápido. Las muestras de agua normalmente se centrifugan durante al
menos 6 minutos a 1200 x g. Las formas flotantes que no se asientan se pipetean y se
cuentan en un volumen conocido de muestra pre centrifugada. Si la muestra es
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demasiado densa, normalmente se diluye con agua de lago filtrada y esterilizada. En
ambos casos, es decir, si la muestra de agua se diluyó o se concentró, la suspensión
restante se distribuye uniformemente.

2. Llenado de la cámara de conteo.

En primer lugar, el portaobjetos de conteo y el cubreobjetos deben limpiarse

adecuadamente antes de usarlos para disminuir la viscosidad del fluido. Se pipetea una
gota de la muestra de agua encima de cada cámara de recuento. Inmediatamente se
coloca encima el cubreobjetos con los bordes de este último apoyados sobre los
soportes pulidos. La gota no debe ser demasiado grande para causar que el agua se
desborde hacia las muescas o canales ni demasiado pequeña para tener una cámara
incompletamente llena. Se coloca suficiente agua para que cuando se aplica el
cubreobjetos, el agua llegue sólo a los dos bordes opuestos del cubreobjetos. El
hemocitómetro también se puede llenar con un asa de alambre, pero los recuentos son
menores en comparación con las cámaras llenas de pipetas (Guillard, 1973).

3. Procedimiento de conteo:

Las cámaras llenas se dejan reposar durante 1-2 minutos antes de la observación para
dar tiempo suficiente a las células para que se asienten. Sigue la observación con bajo
aumento para inspeccionar la uniformidad de la distribución de las células.

Normalmente, las células que tienen 6 µm o más de diámetro o longitud se cuentan bajo
objetivos de baja potencia, en los cuatro bloques de las esquinas, A-D, y en el bloque
central. Cada uno de estos bloques tiene un área de 1 mm2 o cada suspensión densa.
lleno de organismos diminutos (5 µm o menos de dimensiones), es mejor contar las
células en los cuadrados más pequeños de 0,04mm2.

Los recuentos de algas se registran en bloques individuales de 1 mm2 y el número de

algas dentro de un bloque se considera una estimación independiente de la población.
Un organismo unicelular se considera contado si todas sus partes están dentro de las
líneas limítrofes o una parte de ellas toca las líneas limítrofes superior y/o izquierda. La
línea límite es la línea central de tres líneas muy adyacentes que separan cada bloque
de 1 mm2 o área de 0,04 mm2.

Por otro lado, las formas filamentosas o coloniales que tienen tendencia a cruzar más de
un bloque se cuentan sólo una vez dentro de un bloque en particular. Por lo tanto, aparte
de la consideración anterior, cada organismo se cuenta dentro de un bloque particular si
una porción importante de la unidad, es decir, un filamento o colonia, se encuentra en
esa área. Es preferible realizar al menos dos llenados de cada cámara de conteo para
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minimizar los errores debidos a la falta de muestreo aleatorio y de dispersión de la
muestra.

La doble regla de Neubauer mejorada dentro de una cámara del hemocitómetro.

Medición del contenido de clorofila mediante espectrofotometría UV/VISIBLE.

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La clorofila es un pigmento que absorbe la luz en ciertas longitudes de onda,
especialmente en la región visible del espectro electromagnético. Esta absorción de luz
es específica para la clorofila a y la clorofila b, los dos principales tipos de clorofila
presentes en las plantas y las algas. Al medir la absorbancia de la luz en ciertas
longitudes de onda, podemos determinar la concentración de clorofila en una muestra.

Procedimiento:

1. Extracción de Clorofila:

Se extrae la clorofila de la muestra biológica utilizando un solvente orgánico, generalmente

acetona o alcohol etílico. Esto separa la clorofila de las células y los tejidos, permitiendo su
cuantificación.

2. Preparación de las Muestras:

La solución de extracción se centrifuga o filtra para eliminar los residuos celulares y obtener una
solución clara que contenga la clorofila en solución.

3. Obtención del Espectro de Absorción:

La solución se coloca en un espectrofotómetro UV/Visible. Se realiza una lectura de absorbancia

a diferentes longitudes de onda en la región visible del espectro (generalmente entre 400 y 700
nanómetros).

4. Picos de Absorción de Clorofila:

Las clorofilas a y b tienen picos de absorción característicos en la región del rojo y el azul del
espectro, respectivamente. El pico de absorción de clorofila a es alrededor de 665-680 nm,
mientras que el de clorofila b es alrededor de 640-660 nm.

5. Medición de Absorbancia:

Se mide la absorbancia de la solución en los picos de absorción específicos de clorofila. La

intensidad de la absorbancia está relacionada con la concentración de clorofila en la muestra.

6. Cálculos:

Utilizando curvas de calibración previamente establecidas con soluciones estándar de clorofila a

y clorofila b, se calcula la concentración de clorofila en la muestra. Estas curvas relacionan la
absorbancia con la concentración conocida de clorofila.

● Determinación directa del potencial biorremediador: Técnica de detección de metales

pesados (Digestión y Lectura en equipo Absorción atómica o ICP)

La evaluación del potencial biorremediador de microalgas implica la determinación

cuantitativa de su capacidad para acumular y tolerar metales pesados. Esta puede ser
medida siguiendo los siguientes pasos para la obtención de la curva de concentración de
Cromo (Cr - metal utilizado) en una muestra proveniente de un cultivo de microalgas:

- Pre-tratamiento de la muestra:
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Las muestras recolectadas serán digeridas con una mezcla de ácido HNO3
(70%) y ácido HClO4 (70%) en una proporción de volumen 1:1, siguiendo un
procedimiento modificado (Awotoye, Adewole, Salami y Ohiembor, 2009).
Después de homogeneizar las muestras recolectadas en cada sitio de muestreo
en una botella de plástico de polietileno de 1 L, se colocará una porción de 50
mL de la muestra compuesta en un vaso de precipitados de 250 mL. Después de
añadir 10 mL de la mezcla de HNO3 y HClO4, el vaso de precipitados se cubrirá
con un cristal de reloj y luego la muestra se digerirá utilizando una almohadilla de
calentamiento durante 1 hora a 120°C. Luego, la muestra se enfriará, se diluirá a
100 mL con agua desionizada y se preservará en un refrigerador para la
determinación total de cromo utilizando la ICP-OES.

- Preparación de solución buffer

Se preparó una solución salina tamponada (PBS) con un pH de 2 mezclando

volúmenes apropiados de fosfato de dihidrógeno de potasio y fosfato de
monohidrógeno de potasio en equimolaridad (1 M) en agua desionizada (DDW).
El pH se ajustó con HCl 0.2 M y NaOH 0.2 M.

- Preparación de soluciones stock

Se preparó una solución patrón estándar de 1,000 ppm de cromo hexavalente

disolviendo 711.5 mg de dicromato de potasio en 250 mL de agua desionizada
(DDW). Se prepararon soluciones patrón de trabajo de 0.00, 0.2, 0.8, 3.2 y 12.8
ppm de Cr(VI) a partir de una solución patrón intermedia (100 ppm) mediante
dilución en serie y se analizaron utilizando ICP-OES bajo condiciones operativas
optimizadas.

¿Qué analito debe analizar en el ICP?

La revisión titulada “Bioremediation of heavy metals using microalgae: Recent Mechanism” nos
presenta el posible mecanismo que la microalga puede tomar para biorremediar Cromo VI. En
donde mediante una reacción redox cambia el estado del cromo al Cromo III.

Con esa información el analista puede decir leer en el ICP-OES como la concentración de
Cromo VI va disminuyendo, y también como la concentración de cromo III aumenta.

- Determinación de Cromo total utilizando ICP-OES

A continuación se muestra la curva de calibración, las concentraciones y los

parámetros que pueden ser visualizados en una prueba según los datos
proporcionados por Fikirte Zewdu & Meareg Amare (2018):
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La figura presenta la curva de calibración de ICP-OES para concentraciones estándar de cromo. Como se
puede observar en la figura, se observa una dependencia lineal entre la intensidad de emisión de
ICP-OES (I) y la concentración total de cromo (CrT) en el rango de concentración de 0.2-12.8 ppm, con
una ecuación de regresión lineal, coeficiente de correlación y límite de detección del método (MLD = 3s
donde s = desviación estándar de la blancura) de I = 898 + 33,523CrT (ppm), 0.99947 y 6.3510^-5 ppm,
respectivamente.

Referencias bibliográficas:
Awotoye, O. O., Adewole, M. B., Salami, A. O., & Ohiembor, M. O. (2009). Arbuscular
mycorrhiza contribution to the growth performance and heavy metal uptake of Helianthus
annuus LINN in pot culture. African Journal of Environmental Science and Technology, 3(6),
157–163.
Fikirte Zewdu & Meareg Amare.(2018) Determination of the level of hexavalent, trivalent,
and total chromium in the discharged effluent of Bahir Dar tannery using ICP-OES and
UV–Visible spectrometry, Cogent Chemistry, 4:1, DOI: 10.1080/23312009.2018.1534566