Manu Al

Universidad Galileo
Facultad de Ciencias de la Salud

Departamento de Microbiología MANUAL DE PRÁCTICAS DE
Licenciatura en Química Biológica LABORATORIO
Microbiología Aplicada II
Si es posible, la muestra debe ser enviada al laboratorio en el empaque original, sin abrir. Si el
producto se empaca en envases muy grandes para ser enviados, es necesario transferir una porción
representativa a un contenedor estéril bajo condiciones asépticas. Para realizar esto es necesario
contar con cucharas, espátulas y tijeras de una pieza de acero inoxidable que puedan ser
autoclaveadas (Andrews & Hammack, 2015).
Los contenedores para almacenar la muestra deben encontrarse limpios y secos, contar con una
boca ancha para la recolección de la muestra. Es necesario que sean herméticos para evitar la
pérdida o contaminación de la muestra. Evitar envases de vidrio que pueden quebrarse y contaminar
la muestra. Las bolsas estériles o botellas plásticas son ideales para recolectar muestras. Evitar el
llenado excesivo de la bolsa, ya que puede causar una rotura de la misma. Siempre que sea posible,
recolectar por lo menos 100g de cada unidad de muestreo (International Commisssion on
Microbiological Specification for Foods, 1986).
Las muestras recolectadas deben ser llevadas con prontitud al laboratorio y deben ser mantenidas
en las mimas condiciones en las que se encontraban al momento de ser recolectadas. Es necesario
anotar la temperatura de recolección (Andrews & Hammack, 2015).
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MATERIALES Y EQUIPO
 Mechero bunsen
 Guantes descartables estériles
 Mascarilla
 Lentes de protección
 Cofia
 Fósforos o encendedor
 Marcador permanente punta fina
 Algodón
 Alcohol al 70%
 Paleta de madera estéril
 Bolsas estériles para recolección de muestra
 Pipetas automáticas de rango de 50-100 uL y de 100-1000 uL
 Puntas para pipeta automática estériles
 Tubos con 9 mL de solución diluyente
 Frasco con 250mL de capacidad con 250mL de caldo Butterfield, solución amortiguadora
de fosfatos o agua peptonada
 Licuadora o Stomacher
 Equipo de filtración por membrana
 Membranas para equipo de filtración
PROCEDIMIENTO
A. Recolección de la muestra
1. Todo el material e instrumentos de muestreo que estarán en contacto con el alimento
se deben encontrar limpios, estériles y libres de sustancias que afecten la viabilidad de
los microorganismos.
2. Lávese las manos y colóquese los guantes estériles descartables y su equipo de
protección personal. El lavado de manos debe realizarse hasta los codos, cepillar las
uñas con jabón.
3. Si el producto a muestrear se encuentra en envase comercial para venta al menudeo,
este debe ser recolectado en el envase original de forma aleatoria no aséptica.
4. Si el producto se encuentra en recipientes grandes, es necesario abrir el recipiente y
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extraer la muestra en condiciones asépticas para evitar la contaminación. Si el producto
está expuesto al aire libre y otras contaminaciones, no es necesario precauciones

asépticas estrictas.
5. La toma de la muestra debe hacerse con rapidez de forma cuidadosa. Los recipientes
deben abrirse únicamente al momento de introducir la muestra y cerrarlos
inmediatamente.
6. Tomar la temperatura a la que se realiza el muestreo. Rotular la muestra sobre una
etiqueta y no escribir directamente sobre la bolsa, ya que el rotulador puede alterar el
alimento.
7. En el caso de alimentos líquidos o semilíquidos se deberá agitar o mezclar hasta
conseguir homogeneizar y después efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles.
8. En alimentos sólidos cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse con
ayuda de utensilios estériles como paletas, cucharas, cuchillos, etc.
9. En productos a granel, tomar la muestra de varios puntos del contenedor para obtener
una muestra representativa. Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de
salida o una compuerta de una partida a granel, antes de obtener la muestra se deben
dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo.
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B. Transporte de la muestra
1. El manejo y transporte de las muestras deberá efectuarse de tal manera que se impida
su ruptura, alteración o contaminación, evitando su exposición a la luz solar directa.
2. Las muestras deben entregarse al laboratorio lo más rápidamente posible. Los alimentos
perecederos se transportarán bajo condiciones de temperatura de 2 a 8°C; y deben
mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas, las cuales
deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección.
En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0°C, empleando

para conservarla hielo seco. Para la refrigeración es recomendable el empleo de
recipientes con líquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plástico
impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que
de alguna manera contamine a los alimentos muestreados.
3. En el caso de muestras individuales blandas, evitar que la presión que puedan ejercer
otros recipientes, o una cantidad excesiva de las mismas, las deformen u originen
derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la
envoltura.
4. En el caso de muestras no perecederas, evitar que se dañen, humedezcan o contaminen
con otras.
5. Los productos con presentación comercial deben ser transportados en sus envases
originales a temperatura ambiente, siempre y cuando ésta no exceda de 45°C.
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C. Dilución de las muestras

1. Lávese las manos y colóquese los guantes descartables y su equipo de protección
personal.
2. Desinfecte su área de trabajo con algodón con alcohol al 70%.
3. Encienda el mechero bunsen y ajústelo hasta tener una llama de color azul estable.
4. Para muestras de alimento no homogéneo es necesario realizar un macerado y luego
determinar la unidad analítica a utilizar.
5. Tarar el vaso de licuadora o bolsa de Stomacher y pesar asépticamente el tamaño de
muestra analítica recomendado. Si el alimento se encuentra congelado se debe pesar
antes de descongelarlo.
6. Adicionar la cantidad de diluyente necesario para obtener una dilución decimal. El
volumen de muestra más diluyente debe cubrir completamente las aspas de la
licuadora. Mezclar por 2 minutos en licuadora o Stomacher.
7. Transferir 1mL de la primera dilución a un tubo con 9mL de diluyente. Este corresponde
a la segunda dilución decimal.
8. Transferir 1mL de la segunda dilución a un tubo con 9mL de diluyente. Este corresponde
a la tercera dilución decimal.
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9. NOTA: No medir menos del 10% del volumen total de la pipeta, por ejemplo, no use
pipetas con una capacidad mayor a 10 mL para medir volúmenes menores a 1 mL; para
medirvolúmenes de 0.1 mL, no utilizar pipetas con una capacidad mayor a 1 mL.
10. La cantidad de diluciones a preparar depende de la cantidad de microorganismos que se
sospecha se encuentran en el alimento. Se pueden trabajar hasta 6 diluciones decimales
para su análisis.
11. Cuando finalice su trabajo debe desinfectar el área con alcohol al 70%, descartar los
guantes y lavarse las manos.
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DIAGRAMA DE FLUJO
Realizar el diagrama de flujo del procedimiento descrito en la sección anterior
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REPORTE DE RESULTADOS
Tipo de muestra recolectada: _ _
Fecha de recolección: _ _
Temperatura _____________________________________________________________
Personal encargado de la recolección: _ _
Apariencia de la muestra: _ _ _
_ _
Textura: _ _ _ _
_ _
Olor: _
_ _
Recuento de colonias por placa

Dilución preparada Cantidad de diluyente Cantidad de muestra
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REFERENCIAS
Andrews, W., & Hammack, T. (5 de Agosto de 2015). U.S. Food & Drug administration. Obtenido de Food
sampling and preparation of sample homogenate:
https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063335.htm
Arana, I., Orruño, M., & Barcina, I. (2015). Enumeración de microorganismos. En Como abordar y resolver
aspectos prácticos de Microbiología. Departamento Inmunología, Microbiología y Parasitología.
Camacho, A., Giles, M., Ortegón, A., Palao, M., Serrano, B., & Velásquez, O. (2009). Ténicas para el análisis
microbiológico de alimentos. México: Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de
Química, Departamento de Biología.
International Commisssion on Microbiological Specification for Foods. (1986). Microorganisms in Foods. 2.
Sampling for Microbiological Analysis: Principles an Specific Applications. Toronto: University of
Toronto Press.
Maturin, L., & Peeler, J. (Enero de 2001). U.S. Food & Drug Administration. Obtenido de BAM: Aerobic Plate
Count:
https://www.fda.gov/food/foodscienceresearch/laboratorymethods/ucm063346.htm#conventional
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Laboratorio N.2
Recuento Aeróbico en Placa
ANTECEDENTES
El recuento aeróbico en placa va enfocado a determinar la cantidad de microorganismos viables en un

producto. Este método puede ser utilizado en alimentos congelados, fríos, precocinados o preparados.
También se puede utilizar esta metodología para el análisis de agua, cosméticos y medicamentos
(Maturin & Peeler, 2001).
Al hablar de microorganismos viables se considera aquellos que poseen la habilidad de multiplicarse en

el medio de cultivo utilizado. A cada colonia aislada se le denomina unidad formadora de colonia (UFC)y
corresponde, en teoría, a la presencia de un solo microorganismo capaz de reproducirse lo suficiente
para formar una colonia visible. La cantidad de unidades formadoras de colonia que se permite como
promedio es de 25 a 250 (Arana, Orruño, & Barcina, 2015).
Para el desarrollo de este método es necesario realizar diluciones decimales que permitan conocer la
cantidad aproximada de UFC presente en la muestra. Así mismo es necesario realizar la siembra de las
diluciones por duplicado para mejorar el recuento. A continuación, se detalla los métodos para calcular
e interpretar (Maturin & Peeler, 2001):
1. Sin crecimiento en ninguna placa: Cuando se tengas placas sin crecimiento se debe reportar
como menor a una vez el factor de dilución utilizado. Si se considera que el producto analizado
se encuentra contaminado, pero no se obtiene crecimiento, se debe repetir el procedimiento.
2. Placas con menos de 25 UFC: Si en todas las diluciones se obtienen recuentos de menos de 25
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colonias por placa se debe reportar como 25 veces el factor de dilución menor donde se obtuvo
crecimiento.
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3. Placas con 25-250 UFC: Si se obtiene recuentos entre 25 a 250 UFC por placa se debe utilizar la
siguiente fórmula:
∑𝐶
𝑁=
⌊(1 × 𝑛1) + (0.1 × 𝑛2)⌋ ÷ 𝑑
Donde:
N: Número de colonias por gramo o mililitro de producto
ΣC: sumatoria de todas las colonias en todas las placas contadas
n1: número de placas en la primera dilución contada
n2: número de placas en la segunda dilución contada
d: Factor de dilución de la primera
4. Todas las placas con más de 250 UFC: Cuando las dos diluciones presentan crecimiento de más
de 250 UFC pero menos de 100 UFC/cm2, es necesario realizar un recuento estimado y
multiplicarlo por el factor de dilución. Para realizar el recuento estimado es necesario realizar
cuadro de 1cm2 dentro de la placa y tomar en cuenta las siguientes condiciones:
a. Menos de 10 colonias por cm2: Seleccionar 12 cuadros, 6 horizontales y 6 verticales.
b. Más de 10 colonias por cm2: Seleccionar 4 cuadros de forma aleatoria.
En ambos casos se debe obtener el promedio de colonias por cm2 y el resultado se multiplica
por el área total de la caja de Petri y por el factor de dilución.
Estos resultados deben ser informados como recuento estimado.
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Figura 0.1 Cuadrícula para realizar recuentos en placas de más de 250 UFC. Se debe realizar cuadrículas de 1cm2 y para recuentos de
menos de 10 colonias por cuadro, seleccionar 12 cuadros, 6 horizontales y 6 verticales (marcados con números). Para recuentos de más
de 10 colonias por cuadro seleccionar 4 cuadros (marcados con letras).
MATERIALES Y EQUIPO
 Mechero bunsen
 Guantes descartables
 Mascarilla
 Lentes de protección
 Cofia
 Fósforos o encendedor
 Marcador permanente punta fina
 Algodón
 Alcohol al 70%
 Paleta de madera estéril
 Bolsas estériles para recolección de muestra
 Placas de Petri de 150x90 mm
 Pipetas automáticas de rango de 50-100 uL y de 100-1000 uL
 Puntas para pipeta automática estériles
 Tubos con 9 mL de caldo Butterfield, solución amortiguadora de fosfatos o agua peptonada
 Frasco con 250mL de capacidad con 250mL de caldo Butterfield, solución amortiguadora de
fosfatos o agua peptonada
 225mL de agar PCA (plate count agar) fundido y mantenido en baño de agua a 45°C
 Incubadora
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PROCEDIMIENTO
A. Recolección de la muestra
1. Lávese las manos y colóquese los guantes descartables y su equipo de protección personal.
2. Introduzca la totalidad del alimento dentro de la bolsa plástica estéril.
3. Transporte el alimento en hielera a una temperatura entre 4-8°C y procese lo más rápido
posible.
B. Procesamiento de la muestra
1. Lávese las manos y colóquese los guantes descartables y su equipo de protección personal.
2. Desinfecte su área de trabajo con algodón con alcohol al 70%.
3. Encienda el mechero bunsen y ajústelo hasta tener una llama de color azul estable.
4. Pesar 25g de la muestra cómo se describió en la práctica de “preparación y dilución de
muestra”.
5. Rotular las cajas de Petri con la identificación de la muestra y la dilución. Se realizará cada
recuento por duplicado.
6. Inocular por duplicado 1mL de cada dilución correspondiente en la caja de forma estéril.
7. Agregar de 18-20mL del medio PCA fundido y mantenido a 45°C.
8. Homogenizar mezclando con movimiento en forma de ocho sobre la mesa. Es importante
revisar la completa incorporación del inóculo en el medio. Tener precaución de no hacer
movimientos bruscos que hagan que se moje la cubierta de las cajas.
9. Dejar solidificar cerca del mechero. El tiempo máximo para este paso no debe exceder los
20 minutos.
10. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como control de
esterilidad biológico.
11. Incubar en posición invertida las cajas durante el tiempo que se requiera, según el tipo de
alimento y microorganismo que se trate, como se indica a continuación.
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Grupo bacteriano Temperatura Tiempo de incubación

Termófilos 55 ± 2°C 48 ± 2 horas
Mesófilos 35 ± 2°C 48 ± 2 horas
Psicrotróficos 20 ± 2°C 3 a 5 días
Psicrofílicos 5 ± 2°C 7 a 10 días
12. Cuando finalice su trabajo debe desinfectar el área con alcohol al 70%, descartar los
guantes y lavarse las manos.
13. Luego del período de incubación se deberá contar las colonias desarrolladas en las placas y
realizar el cálculo de los resultados.
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DIAGRAMA DE FLUJO
Realizar el diagrama de flujo del procedimiento descrito en la sección anterior
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MEDIOS DE CULTIVO
Nombre del PLATE COUNT AGAR (PCA)

medio de
cultivo
Componentes
Fundamento
Nombre del CALDO BUTTERFIELD

medio de
cultivo
Componentes
Fundamento
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Nombre del AGUA PEPTONADA

medio de
cultivo
Componentes
Fundamento
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REPORTE DE RESULTADOS
Tipo de muestra recolectada: _ _
Fecha de recolección: _ _
Personal encargado de la recolección: _ _
Recuento de colonias por placa
Dilución Placa 1 Placa 2

1:10
1:100
1:1000
Cálculos:
Resultado:
_ _ _
_ _ _
_ _ _
_ _________________________________
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REFERENCIAS
Arana, I., Orruño, M., & Barcina, I. (2015). Enumeración de microorganismos. En Como abordar y resolver
aspectos prácticos de Microbiología. Departamento Inmunología, Microbiología y Parasitología.
Maturin, L., & Peeler, J. (Enero de 2001). U.S. Food & Drug Administration. Obtenido de BAM: Aerobic Plate
Count:
https://www.fda.gov/food/foodscienceresearch/laboratorymethods/ucm063346.htm#conventional
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Laboratorio N.3
Recuento aeróbico en placa para
mohos y levaduras
ANTECEDENTES
Los hongos constituyen un grupo grande y heterogéneo de organismos que incluye a los mohos, las
setas y las levaduras. Se estima que podría existir hasta 1.5 millones de especies de hongos, los cuales
poseen hábitats diversos, la mayoría vive en ambientes terrestres, en el suelo o en materia en
descomposición (Martinko, Dunlap, Clark, & Madigan, 2009). La presencia de hongos en alimentos
puede ser como parte de la microbiota normal del alimento o como contaminante en equipos mal
sanitizados (Camacho, Giles, Ortegón, Palao, & Serrano, 2009).
Los hongos pueden ser causantes de enfermedades transmitidas por alimentos, ya que tienen la
capacidad de crecer en rangos de temperatura desde 10-35 °C, ambientes alcalinos o ácidos o en
alimentos con una actividad de agua (aw) de 0.85 o menos; esto les permite crecer en alimentos en los
que no pueden crecer las bacterias (Tournas, Stack, Mislivec, Koch, & Bandler, 2016).
Los hongos pueden causar deterioro o descomposición de los alimentos. Estos organismos pueden
invadir y crecer en cualquier tipo de alimento como cultivos, granos, nueces, frijoles, frutas o alimentos
procesados. Su detección en los alimentos depende del tipo de alimento, de los organismos
involucrados y del grado de invasión. El alimento contaminado puede verse ligeramente manchado,
severamente manchado o completamente descompuesto. Se puede observar el crecimiento del hongo
en forma de manchas de podredumbre de diversos tamaños y colores, costras antiestéticas, limo,
micelio algodonoso blanco, o un moho esporulante muy coloreado. También se pueden producir
sabores y olores anormales. Ocasionalmente, un alimento parece libre de moho, pero se encuentra en
27

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está expuesto al aire libre y otras contaminaciones, no es necesario precauciones

En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0°C, empleando

C. Dilución de las muestras

Personal encargado de la recolección: _ _

Recuento de colonias por placa

El recuento aeróbico en placa va enfocado a determinar la cantidad de microorganismos viables en un

Al hablar de microorganismos viables se considera aquellos que poseen la habilidad de multiplicarse en

Grupo bacteriano Temperatura Tiempo de incubación

Realizar el diagrama de flujo del procedimiento descrito en la sección anterior

Nombre del PLATE COUNT AGAR (PCA)

Nombre del CALDO BUTTERFIELD

Nombre del AGUA PEPTONADA

Tipo de muestra recolectada: _ _

Personal encargado de la recolección: _ _

Recuento de colonias por placa

Dilución Placa 1 Placa 2

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