UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS

ESCUELA DE CIENCIAS Y PROCEOS AGROPECUARIOS

INDUSTRIALES ISTMO COSTA CAMPUS IX ARRIAGA

MANUAL DE PRACTICAS
DE MICROBIOLOGIA

NOMBRE DEL ALUMNO:____________________________

GRUPO: ______________

ELABORO: QFB. JUANA LOPEZ TOLEDO

Profesor de Tiempo Completo Enero/2024
 PRESENTACION
La microbiología es una ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas
de la Biología. El estudio de los Microorganismos se inició a partir de que Antonie
Van Leeuwenhoek en 1670 inventó el microscopio, y que a partir de los estudios
de Luis Pasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo y reconocimiento de los
microorganismos como actores de una gran diversidad de procesos.

Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas

de enfermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde la
antigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de
producción de alimentos fermentados como quesos, vinos, pan y cerveza, entre
otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas áreas de
investigación básica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacéutica.

OBJETIVO GENERAL DE CURSO PRÁCTICO DE MICROBIOLOGIA GENERAL:

Es que el alumno se inicie en el conocimiento de la biología básica de los

microorganismos, en sus características morfológicas, nutricionales de
crecimiento, control y que adquiera las habilidades necesarias para su
manipulación en el laboratorio.

Este manual está dirigido a estudiantes que inician su experiencia en el manejo

de microorganismos, por lo que se considera de gran importancia incluir al
principio una gran serie de recomendaciones relacionadas con las reglas
generales del laboratorio y los principales procedimientos que el estudiante deberá
aprender, para que manipule en forma adecuada a los microorganismos y
garantizar tanto su seguridad como la de sus compañeros.

Este manual contiene 9 prácticas, diseñadas para que el estudiante se

familiarice gradualmente con los procedimientos de cultivo y observación de
bacterias y hongos. El orden de presentación corresponde al programa del curso
teórico semestral de Microbiología General, que forma parte del plan de estudios
de la carrera de Ingeniería Agroindustrial impartida en el campus IX de la
Universidad Autónoma de Chiapas.

En cada práctica se presentan los objetivos y una breve introducción para

facilitar la comprensión de los mismos, después se indican los materiales
necesarios y procedimiento a realizarse en forma de instrucciones numeradas.
La programación del curso en el laboratorio es de 3 hrs. / semana.
RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE.

REGLAS DEL LABORATORIO

1.- Durante las sesiones, siempre deberá usar bata de laboratorio bien abotonada,
que deberá quitarse antes de abandonar el laboratorio.
2.- Levar una libreta pequeña la cual le servirá como bitácora en todo el curso
3.- Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con
la práctica de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas,
etc.), en la zona especificada por el profesor.
4.- Se prohíbe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del
laboratorio.
5.- Se prohíbe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o
algún otro objeto. Se deberá lavar meticulosamente las manos con jabón y agua
antes de salir del laboratorio, e incluso cuando salga por breves periodos.
6.- Por seguridad no deberá pipetear oralmente ningún tipo de cultivo microbiano,
esta actividad deberá realizarse con pipetas accionadas de forma mecánica o
automática, tratando de evitar la formación de aerosoles.
7.- No se admitirán visitas personales que distraigan la atención y pongan en
riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza.
8.- Deberá traer zapatos cerrados, no gorras, el cabello no suelto(para las mujeres
u hombres que traigan larga la cabellera)

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO
1.- Antes y después de cada sesión de práctica los alumnos deberán limpiar las
mesas de trabajo con el desinfectante que se le proporcionara para este fin.
2.- Cuando se ocupe un mechero, este deberá colocarse alejado del microscopio y
otros equipo, así como de su bitácora o prendas de vestir.
3.- Al concluir cada sesión el estudiante beberá de asegurarse de que los
materiales de desecho u objetos contaminados sean colocados en recipientes
específicos para ello, colocados en lugares apropiados, que los indicara el
profesor.
4.- Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados
(Balanzas analíticas, Microscopios, Autoclave, etc.) y reportar al maestro cualquier
irregularidad en el funcionamiento.
5.-En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá
notificarlo de inmediato al profesor. En caso de derrame de cultivos o rotura d
recipientes con cultivos activos, deberá conservar la calma además de informar al
profesor, seguir inmediatamente el procedimiento.
a).- Colocar toallas de papel sobre el material derramando para evitar dispersión.
b).- Poner abundante solución desinfectante sobre las toallas.
c).- Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y retirarlas en el
receptáculo destinado a la eliminación del material contaminado.
MATERIALES DISPENSABLES EN CADA SESION DE LABORATORIO

1.-Bata de laboratorio (No filipina) limpia y con botones.

2.- El protocolo de la práctica
3.- Un pedazo de tela sin gamuza (franela puede ser), cerillos, tijeras, marcador
indeleble o etiquetas pequeñas, cinta Masking, papel Destrasa y papel aluminio
(cuando se requiera), algodón, Bolsas de plástico transparente, esponja y jabón
líquido para trastes. (Todo el material es por equipo)
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PRACTICA No. 1
RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL DEL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA

OBJETIVOS:
1.- Que el alumno reconozca el material que se utiliza en el laboratorio de
Microbiología
2 El alumno adquirirá la habilidad y destreza de utilizar el instrumental así como
los equipos utilizados en el laboratorio de Microbiología

Parte experimental:
A. Operaciones elementales para trabajar en el laboratorio de
Microbiología

a.- Limpieza de material: la primera operación que debe efectuar quién trabaje en
un laboratorio de Microbiología, es limpiar el material a emplear. Esta operación
requiere el
Máximo de precaución: una experiencia en Microbiología quedará anulada, si el
material no está limpio la limpieza se efectuará por distintos medios, según las
características del material a limpiar. Nos referiremos únicamente al material de
vidrio.
El “lavado” consiste en lavar el material con agua corriente y jabón y enjuagado
con agua destilada. Si se debe eliminar impurezas, el instrumento será enjuagado
con agua y jabón y luego sumergido durante varias horas en una mezcla química
que puede ser:

- Sulfocrómica: solución saturada de dicromato de potasio en ácido sulfúrico

Concentrado. MUY CORROSIVA.
- Sulfonítrica: mezcla de ácido nítrico y sulfúrico en partes iguales. MUY
CORROSIVA.
- Alcalina: soluciones saturadas de fosfatos alcalinos.. Se utiliza la solución
limpiadora que se adapte mejor a la destrucción del material contaminante y a los
usos posteriores del instrumento.

Por último se realiza un lavado con agua corriente y enjuagado varias veces con
agua destilada.
Cuando el material ha sido usado con productos que resisten estos tratamientos
deberán emplearse técnicas especiales.

b.- Calefacción: existen numerosos medios para calentar los materiales; pero en
el laboratorio sólo se emplea el gas combustible, la electricidad y el vapor de agua
generado en una caldera.
El alumno usará habitualmente el mechero de Bunsen adaptado al gas. La mezcla
del gas con aire, en distintas proporciones, permite modificar las condiciones
calóricas del mechero de Bunsen, obteniéndose diversos tipos de Llama.

La electricidad se emplea en forma cada vez más intensa. Se pueden emplear los
calentadores eléctricos comunes, Autoclave y baño María.

c.- Disolución: se denomina disolución a la dispersión homogénea de una

sustancia (sólida, líquida o gaseosa) en el seno de un líquido. A la sustancia
dispersante se la denomine solvente y a la dispersada, soluto. Para proceder a
disolver una sustancia conviene averiguar sus propiedades físicas, en especial su
solubilidad (tablas especiales). Una vez asegurado que la disolución es factible, se
pulveriza la sustancia. Si fuese necesario proceder cuantitativamente se pesa y se
coloca la sustancia en un recipiente adecuado (puede ser un vaso de
precipitación) con la cantidad necesaria del solvente. La disolución se activa,
generalmente, por agitación con une varilla de vidrio o por calentamiento
moderado.

d. - Centrifugación: consiste en hacer actuar sobre una mezcla de consistencia

líquida, la fuerza centrífuga. Esto se efectúa colocando la sustancia a centrifugar
en tubos especiales, que se hacen girar a gran velocidad en aparatos adecuados;
de este modo, los componentes de la mezcle, que poseen mayor densidad, se
disponen en el fondo de los tubos, pudiendo ser separados fácilmente de los de
menor densidad, que ocupan la parte superior.

B. INSTRUMENTOS DE MEDIDA
1.- Para medir volúmenes de líquidos.

a.- Pipetas: son tubos de vidrio, graduados. Se manejan aspirando con los
mismos, el líquido a medir y obturando rápidamente con el dedo índice derecho el
extremo superior; luego se enrasa el nivel del liquido, levantando levemente el
dedo a la división cero. Por último se vacían destapando el extremo superior.
Existen varios tipos de pipetas: entre las más usadas tenemos:
1. Pipetas graduadas: cuyo tubo ha sido calibrado y dividido de acuerdo al número
de mililitros de agua destilada que puede contener Generalmente presentan
divisiones al 1/10 de ml, ó 1/100 de ml.
2. Pipetas aforadas: que permiten medir una determinada cantidad de líquido
contenido en un ensanchamiento. Estas pipetas pueden ser con un solo aforo
o con doble aforo; en este último caso el liquido se desplazará entre los dos
trazos, resultando, por lo tanto, las pipetas más exactas. Muy estimadas por su
exactitud son las pipetas de Ostwald-Folin que poseen una construcción especial y
que descargan hasta la última gota mediante una leve presión, por soplado.
3. Buretas: son también tubos graduados; pero se mantienen en posición vertical
con auxilio de un soporte. Se cargan por la parte superior utilizando un embudo y
la salida del líquido, se regula por medio de una llave situada en la parte inferior.
Esta llave debe estar perfectamente lubricada para que gire suavemente.

b.- Frascos volumétricos:

- Matraces: tienen en el cuello una división (aforo) con la indicación de su
capacidad a determinada temperatura (generalmente 20º C). Se utilizan para le
preparación de soluciones valoradas. Los matraces no deben calentarse pues el
vidrio se dilata por el calor. Igual recomendación se debe tener en cuente pera
pipetas, buretas, etc. Los frascos volumétricos son calibrados para determinado
contenido y no sirven como instrumentos para expeler líquido.
- Probetas: son instrumentos cilíndricos de vidrio, graduados, que se utilizan para
medir volúmenes grandes de líquido, cuando no es necesario una gran exactitud.

c.- Otros instrumentos:

Para medir pesos: se utiliza la balanza analítica de precisión, sensible al 1/10 de
mg. Para el manejo de la misma, los alumnos deberán tener presente las
siguientes reglas:
- Las sustancias deberán pesarse en un pequeño vaso de precipitación o en un
vidrio de reloj.
- Antes de pesar, controlar si la balanza esté bien nivelada (observe la plomada).
- Nunca agregar o quitar pesas o material cuando la balanza esté en movimiento.
- Las pesas no se toman con los dedos sino con pinza.
Existen variantes de balanzas con dispositivos que facilitan su uso. Se usarán
diferentes balanzas según la exactitud requerida en la pesada.

I.- material y Equipo

MATERIAL

Tubos de ensaye de diferentes capacidades

Matraz Erlenmeyer de diferentes capacidades
Pipetas graduadas de diferentes capacidades
Pipetas volumétricas de diferentes capacidades
Vaso de precipitado de diferentes capacidades
Probeta de diferentes capacidades
Capsula de Porcelana
Agitador de vidrio
Mechero Bunsen
Mechero Fisher
Soporte universal con aro
Tela de asbesto
Caja petri
Asa bacteriológica o de siembra
Termómetros
Gradilla

EQUIPOS

Balanza Gravimétrica o de tres brazos

Balanza Digitales
Termo balanza
Espectrofotómetro
Campana de flujo laminar
Estufa incubadora
Autoclave
Centrifuga
Cuenta Célula
Estereoscopio
Microscopio
Baño maría

II Material del Laboratorio

Investigar el uso del material de laboratorio de Microbiología de a acuerdo a la

siguiente clasificación:

a. Material de sostén.
b. Material recipiente
c. Material volumétrico
d. Material de uso específico

Con el material que se le proporcione realice un cuadro que contenga lo siguiente.

Esquema del Clasificación Nombre Uso Cuidados al Medidas como

Material correcto adecuado Manipularlo lo podemos
encontrar

III.- Equipo del laboratorio de Microbiología

Investigar el uso de los del equipo que encontramos en el laboratorio

Esquema del Equipo Nombre correcto Uso adecuado Cuidados al manipularlo

BIBLIOGRAFIA
*Guzmán, D.D., Jiménez .Z.J., Polanco. H.V., Ulloa.C.E. Introducción a la Técnica
Instrumental. Instituto Politécnico Nacional. Primera Edición 2001.México.D.F
*Ladrón de Guevara O. Guía de seguridad para Laboratorios con Agentes
Químicos.
Instituto de Investigaciones biomédicas.
*Mallinckodt, Laboratory Chemicals Catalog. 1999- 2000.
*Manual Merck, Productos y reactivos químicos 1999-2000.

IV.- Cuestionario:

1.- ¿Por qué considera que es necesario conocer el material y equipo de

laboratorio de Microbiología?
2.- ¿Cómo considera que el material y equipo para que estén en buen estado
debe manipularse?
3.- Según la información proporcionada para el uso de material y equipos ¿usted
propondría algo más?

V.- OBSERVACIONES
VI ANALIS DE RESULTADOS
VII.- CONCLUSIONES
VIII.- DISCUSIONES
IX.- REFERENCIA BLIBLIOGRAFICA
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PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA
PRACTICA No.2
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO Y
ESTEREOSCOPIO.

OBJETIVO:
El alumno reconocerá el microscopio compuesto, identificará cada una de sus
partes y lo manejará correctamente observando la presencia de microorganismos
en muestras biológicas.
Así como también el buen manejo del Estereoscopio, su utilidad en el laboratorio
de microbiología.

INTRODUCCION:
El microscopio es el instrumento más frecuentemente utilizado y el más útil en
un laboratorio de microbiología, proporciona la amplificación o agrandamiento que
nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista. Los
microscopios permiten una amplia gama de amplificaciones, desde cien veces a
ciento miles de veces.
Las dos categorías de los microscopios disponibles son los microscopios
ópticos y los microscopios electrónicos. Los microscopios ópticos utilizan un
sistema de lentes ópticas y comprenden los microscopios de campo claro, campo
oscuro, fluorescencia y contraste de fases.
Los microscopios electrónicos emplean haces de electrones en lugar de ondas de
luz para producir una imagen ampliada.

El Estereoscopio es un instrumento óptico. Los estereoscopios permiten hacer

estudios de objetos y especímenes demasiado pequeños para ser estudiados a
simple vista, pero demasiado grande para ser estudiados bajo el microscopio
compuesto. Su magnificación de desde cerca de 5x hasta más de 60x. Los
estereoscopios también son conocidos como microscopios de disección, pues en
muchas ocasiones son usados para disecar los especimenes o muestras,
separando de ellos aquellas partes que serán examinadas mediante otro tipo de
microscopio.
MATERIAL Y REACTIVOS

Microscopio Compuesto
Porta y cubre objetos
Palillos
Solución salina NaCl al 0.85%
Solución de Yodo-Lugol
Muestras Biológicas (alimentos en descomposición, agua estancada, etc.).

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO OPTICO

1.- Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina

completamente.
2.- Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3.- Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar
el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
4.- Para realizar enfoque:
 Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el
tornillo Macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a
través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la
preparación pudiendo dañar alguno de ellos o ambos.
 Mirando, ahora si, a través de los oculares, ir separando lentamente el
objetivo de la preparación con el Macrométrico y, cuando se observe algo
nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5.- Para el siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele
ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al
cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a
enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo

de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que
ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación sei se descuidan las
precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión se se observa una
preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

PROCEDIMIENTO:

TECNICA DE MONTAJE HUMEDO

 La gota pendiente o las preparaciones húmedas permiten examinar organismos
vivos suspendidos en un fluido. Las preparaciones húmedas se hacen colocando
una gota del fluido que contiene el organismo sobre una lámina de vidrio y
cubriéndola con una fina pieza de vidrio (cubreobjetos): para reducir la tasa de
evaporación y eliminar corrientes de aire, generalmente se rodea la gota con
vaselina.
Cuando se examinan las preparaciones húmedas por microscopía de campo
claro, es importante ajustar la fuente de luz de forma adecuada. Es posible
disminuir la intensidad de la luz mediante la utilización de filtros especiales.

MONTAJE EN SOLUCION SALINA FISIOLOGICA O AGUA.

Utilizada para estudiar la movilidad de las bacterias.

1.- En el centro de un portaobjetos colocar una gota de solución salina

2.- Con un hisopo tomar muestra problema y colócala en la solución salina
mezclando cuidadosamente.
3.- Examinar con el objetivo 40x

MONTAJE EN SOLUCION YODO LUGOL

1.- En el centro de un portaobjetos colocar una gota de Yodo – Lugol

2.- Con un hisopo tomar muestra problema y colócala en el yodo – Lugol
mezclando con mucho cuidado.
3.- Examinar con el objetivo 10x y 40x

CUESTIONARIO:

1.- ¿Qué es poder de resolución?

2.- ¿Cómo crees que se vería la muestra que observaste en esta sesión en un
microscopio de campo obscuro?
3.- ¿Cuál es la importancia que tiene el diafragma en el microscopio?
4.- ¿Cuál es la diferencia entre observar en el microscopio y el estereoscopio?
5.- ¿Qué importancia tiene el estudiar y observar los microrganismos en muestras
biológicas?
5.- ¿Cuál fue la diferencia entre la preparación de solución salina y la de Yodo
Lugol?
6.- ¿Qué tipo de muestras observarías en el Estereoscopio?

OBSERVACIONES.
Dibuja lo observado en los diferentes objetivos para cada muestra que preparaste
durante la práctica.
Dibuja lo observado en el Estereoscopio.
CONCLUSIONES.
DISCUSIONES
BIBLIOGRAFIA

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PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA
PRACTICA No.3
PREPARACION, FIJACION Y COLORACION SIMPLE DE FROTIS.

OBJETIVOS:

Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, de fijación y

coloración más utilizadas en el estudio microscópico de cultivos bacterianos,
obtenidos de medios sólidos y líquidos.
Que identifique las principales formas de bacterias y la importancia de las
tinciones simples en la caracterización morfológica de estos microorganismos.

INTRODUCCION.

Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se requiere

de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o campo oscuro para hacer la
descripción morfológica de estas. El microscopio de uso mas común es el de
campo claro, en el que la observación de las células vivas es limitada debido a
que las células son incoloras y permiten el paso de una gran cantidad de luz.
La observación de frotis teñidos es más recomendable. El frotis se prepara
haciendo una extensión de microorganismos sobre la superficie transparente, en
la cual se fijan y tiñen los microorganismos. De acuerdo al número de soluciones
colorantes y a los objetivos de estudio como son: Simple, Diferencial, Negativa y
Selectiva.
Los frotis de cultivo liquido se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del
medio, que al quemarse darán interferencias en las observaciones y los de colonia
de medio sólido se fijan generalmente con calor.
Después de la fijación de los frotis son teñidas con diferentes colorantes sintéticos
derivados de anilina.
Los colorantes más utilizados son sales formados por iones coloridos cargados
conocidos como cromóforos.

MATERIAL Y EQUIPO.

1 Probeta de 100 ml
1Vaso de Precipitado de 100 ml
1 Mechero bunsen
1 Asa de siembra
Porta Objetos
Piceta con Agua destilada
Microscopio compuesto de campo claro
Azul de Metileno
Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

PREPARACION DE FROTIS

1.- Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos

2.- Prender el mechero y esterilizar el asa con la flama del mechero hasta que se
ponga al rojo vivo.

3.- Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos
sean destruidos. Después acercar al mechero la caja con las colonias o muestras
a estudiar, tomar una asada de la muestra en estudio.

4.- Si el cultivo es medio sólido, previamente se colocara en el centro del

portaobjeto una gota de agua destilada donde se mezclara una pequeña muestra
del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 3. Extenderla
suavemente y dejar secar al aire.

FIJACION DEL FROTIS.

1.- Completamente secos se fijas al calor. Para esto pasará el frotis rápidamente 2
– 3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero.

2.- Palpar la parte inferior del portaobjeto son el dorso de la mano izquierda para
enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento.

TINCION SIMPLE

1.- Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1

minutos.

2.- Eliminar el exceso de colorante con lavado suave de agua corriente o con la
ayuda de la Piceta con agua destilada.
3.- Dejar secar al aire.

OBSERVACION AL MICROSCOPIO.

1.- Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel
seda.

2.- Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo las
indicaciones del profesor.

3.- Colocar el portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el

objetivo de 10 X, posteriormente pasar al objetivo 40 X. Para la observación con el
objetivo de 100 X, colocar previamente una pequeña gota de aceite de imersión
sobre la preparación.

4.- Al finalizar las observaciones limpiar cuidadosamente el objetivo con papel

seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos
sistemas

RESULTADOS:

A).- Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada

uno de los microorganismos.

B).- Comparar sus observaciones con los resultados en la literatura.

CUESTIONARIO.

1.- Investigué cuáles son las estructuras celulares o moleculares responsables de

la tinción simple realizada. De ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse.
2.- ¿Cuáles son las principales preocupaciones de manejo del microscopio y por
qué se debe utilizar el aceite de imersión al hacer el estudio microscópico de
bacterias?
3.- ¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple?
4.- ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación de frotis?

OBSERVACIONES
CONCLUSIONES
DISCUSIONES
BIBLIOGRAFIA

1.- Manual Práctico de Microbiología. 3ª. Edición. Carlos Gamazo, Editorial

Masson 2005
2.- Microbiología 2ª. Edición. Richard A. Harvey. Editorial Lippincott 2005
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PRACTICA No.4
ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO

OBJETIVO: Que el alumno conozcan los principios generales de las técnicas de

esterilización de materiales de vidrio, medios de cultivos de usos comunes en
microbiología y de productos varios que ellos elaboren.

INTRODUCCION:

Existen diversos métodos físicos de esterilización y de inhibición del

crecimiento microbiano, como puede ser calor, la filtración y la radiación, pero el
más ampliamente usado es el calor, ya sea húmedo o seco, los cuales tienen
diferentes penetraciones.
Conforme aumenta la temperatura por encima de la temperatura máxima de
crecimiento, se producen efectos letales en los microorganismos.
La muerte de bacterias por calor es consecuencia de la desnaturalización de sus
proteínas.
Los enlaces intracelulares e intermoleculares (puentes de Hidrogeno), de las
proteínas de las cuales dependen su funcionalidad son más lábiles cuando las
proteínas están hidratadas que cuando no lo están, de tal manera que el “calor
húmedo” es más efectivo en la desnaturalización de enzimas y otros componentes
proteicos importantes para la célula que el “calor seco”.
Por eso se dice que el calor húmedo tiene mayor “penetrabilidad” que el calor
seco.
El calor de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal
microbiano y se puede utilizar a numerosos instrumentos, material y sustancias,
con el propósito de matar a los microorganismos que ellos contengan.
Este proceso se llama “Esterilización” y al material, sustancia o medio de cultivo
sometido a éste, se le denomina entonces “estéril”, es decir, desprovisto de toda
forma viviente.
El calor puede ser generado en diversos aparatos y por lo tanto se puede
esterilizar por calor húmedo o por calor seco.
En ambos casos hay numerosos factores que condicionan la efectividad del
proceso:
Cantidad de agua, temperatura, presión, tiempo e contacto, superficie de
esterilización, pH, edad de las bacterias, la presencia o no de esporas,
composición del medio de suspensión, etc.
Las células vegetativas y las endosporas bacterianas de un mismo organismo
varían considerablemente en cuanto a su resistencia al calor.
La muerte de microorganismos es más rápida a pH acido.
Las concentraciones elevadas de azúcares, proteínas o grasas disminuyen la
penetración del calor y habitualmente aumentan la resistencia de los
microorganismos al calor, mientras que las elevadas concentraciones de sal
pueden incrementar o bien reducir la resistencia al calor, dependiendo del
organismo.

MATERIAL Y EQUIPO.

 Placas de petri de vidrio

 Mechero Bunsen
 Masking Tape
 Cerillos o Encendedor
 Cinta Testigo
 Papel Destraza
 Autoclave

TECNICA

1.- Rotular los paquetes que contengan las cajas de petri con el nombre del
alumno o equipo para su identificación.
2.- Asegurarse de que haya un buen nivel de agua en el autoclave. Si no hay
suficiente agregarle hasta que casi llegue a la parrilla inferior.
3.- Introducir el material que se va a esterilizar procurando que quede bien
colocado para evitar algún problema y cerrar la tapa ajustándola bien. Debe
quedar herméticamente cerrado.
4.- Abrir la válvula de salida de vapor y encender la fuente de calor del autoclave.
5.- A medida que suba la temperatura del agua (ver el termómetro), empezara a
salir una mezcla de vapor-aire por la válvula de salida de vapor, dejar que escape
esta mezcla hasta que salga un flujo continuo de vapor y el aire haya sido
eliminado; a esto se le llama flama purgar el autoclave.
6.- Una ves purgado el autoclave, cerrar la válvula de salida del vapor y dejar que
la presión suba hasta 15 libras pulgadas cuadradas (vigilar el manómetro), lo que
proporciona una temperatura de 121°C. Observar que no es la presión del
autoclave lo que mata a los microorganismos sino la elevada temperatura que
puede alcanzarse cuando el vapor de agua se somete a presión.
7.- En este momento empezar a contar el tiempo.
8.- Trascurrido los 15 minutos a 15 lb. De presión, apagar la fuente de calor y dejar
que el autoclaves enfríe solo (no abrir la válvula de salida de vapor) hasta que la
presión haya bajado a 0 lb.
9.- Abrir el autoclave y sacar el material

CUESTIONARIO.

1.- Dibujar y describir un Autoclave.

2.- ¿Qué tipo de material se puede esterilizar en el autoclave? De ejemplos.
3.- ¿Por qué es necesario ajustar el tiempo y la temperatura para lograr la
esterilización?
4.- En el calor húmedo que otras técnicas de esterilización podemos encontrar.
Menciónelas.
5.- Explica razonadamente que técnica emplearías para esterilizar material de
plástico

OBSERVACIONES

CONCLUSIONES

DISCUSIONES

BLIBLIOGRAFIA.

1.- Wistreich, G. A y M.D Lechtman 1993. Prácticas de laboratorio de

microbiología. Editorial Limusa, México.

2. - Johnson T.R and C.L case 1992. Laboratory experiments in microbiology 3a.
Ed.Cummings Publishing Company. Inc. USA
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PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA
PRACTICA No. 5
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO SOLIDO Y LIQUIDOS

OBJETIVO:
Que el estudiante prepare medios de cultivos de uso general, diferenciales y
selectivos para el cultivo de diferentes especies bacterianas.

INTRODUCCION:

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos

es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
medio de cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que
las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir
una serie de condiciones como son: Temperatura, Grado de Humedad y Presión
de oxigeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un
medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesario
y debe estar exento de todo
Microorganismos contaminantes. La mayoría de las bacterias patógenas requieren
nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo
humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de
extractos de carne y peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El Agar es
un elemento solidificarte muy empleado para la preparación de medios de cultivo.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento con hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la
Sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos
menos resistentes.
Por su aspecto físico.

Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su aspecto en:
Líquidos, Semisólidos, Sólidos.

Por su uso en:

I.- Medios de cultivo básicos.

II.- Medios de cultivos especiales como: Mejorados, Diferenciales, de transporte

MATERIAL Y REACTIVOS.

2 Matraz Erlenmeyer de 250 ml

2 Mecheros Bunsen
1 soporte universal con aro
1 Tela de asbesto
1 Agitador de vidrio
1 Vaso de precipitado de 250 ml
1 Probeta de 100 ml
1 Espátula
Papel aluminio (para pesar el medio de cultivo)
Papel Destraza
Tubos de ensaye de 13 x 100

REACTIVOS.

Agar Eosina y Azul de Metileno (EMB)

Agar Papa Dextrosa (PDA)
Caldo nutritivo
Estafilococo 110
Agua Destilada

PROCEDIMIENTO:

1.- Primeramente se desinfecta el área de trabajo con fenol al 5% o alcohol al 96%

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVOS SÓLIDOS Y LIQUIDOS

1.- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la
cantidad necesaria según el volumen requerido.

2.- Colocar el medio en un matraz Erlenmeyer, medir el agua necesaria y

adicionarla, agitar y calentar a ebullición para disolver el Agar. En el último paso se
debe tener cuidado ya que el recipiente se calienta en exceso y el producto tiende
a hervir y proyectarse, lo cual puede producir serias quemaduras. El Agar disuelto
se hace transparente al medio que originalmente estaba turbio.

3.- Esterilizar el medio a 121°C, 15 Libras de Presión. Durante 15 minutos.

CUESTIONARIO.

1.- ¿Qué es un medio de cultivo?

2.- ¿Qué es un cultivo de microorganismos?

3.- ¿Qué finalidad tiene utilizar medio de cultivo, sólidos?

4.- ¿Mencione por lo menos 3 medios de cultivos?
5.- ¿Usted cree que se encontraran los mismos microorganismos en medios de
cultivos sólidos y líquidos?

OBSERVACIONES
CONCLUSIONES
DISCUSIONES
BIBLIOGRAFIA.

1.-. Carlos Gamazo. Ed. Masson 2003

2.- Microbiología 2ª. Edición. Richard A. Harvey. Ed. Lippincott 2005

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ESCUELA DE CIENCIAS Y PROCESOS AGROPECUARIOS
INDUSTRIALES. ISTMO COSTA CAMPUS IX ARRIAGA

PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA
PRACTICA No. 6
MÉTODOS DE VACIADO EN CAJA PETRI

OBJETIVO:
Que el alumno aprenda a reconocer las diferentes formas de vaciado de medios
de cultivos.

INTRODUCCION:
Las diferentes formas de consistencia de los medios de cultivo, hacen que la
forma de vaciado de medio de cultivo sea diferente.

VACIADO EN CAJAS DE PETRI

1.- Primeramente desinfectar el área de trabajo como se indicó anteriormente.

2.- No destapar las cajas de petri, sino hasta el momento que vayan hacer
utilizadas. Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a realizar
el vaciado y evitar hablar en todo momento para no contaminar el medio de
cultivo.

3.- Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del área

estéril al momento del vaciado en las cajas de petri. Levantar la tapadera de la
caja de petri con la mano izquierda, sin soltarla y sin retirarla demasiado de la
base de la misma caja mientras que con la mano derecha tomar el matraz que
contiene el medio de cultivo y realizar el vaciado de aproximadamente 15 a 20 ml
de Agar por caja procurando que no se forman burbujas, se procede a tapar la
caja inmediatamente.
4.- Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la
superficie de la caja de petri y de manera rápida, se procede a tapar la caja.

5.- Esperar que el medio solidifique, se rotulan los medios de cultivo anotando la
fecha y con iníciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no se van a utilizar el
mismo día se envuelven con papel estraza y se sujetan con cinta y se colocan en
el refrigerador de manera invertida para evitar que el calor condensado caiga
sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar.

6.- Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, será necesario
secar las placas invertidas en estufa a 37°C. Antes de realizar el sembrado de
microorganismos.

PRUEBA DE ESTERILIDAD DE MATERIALES.

1.- Colocar las cajas de forma invertida en una estufa de incubación ajustada a 30
°C durante 24 a 48 horas.

2.- Revisar las cajas de petri para detectar la presencia de contaminantes, por la
aparición de turbidez, nata superficial, así como la formación de colonias
microbianas en la superficie de medios sólidos.

3.- Si no hay contaminación de los medios se abrirá una de las cajas de petri de
cada medio durante 1 minuto en el laboratorio o zona accesoria al mismo y se
etiquetara como al “Aire”

4.- La otra caja de petri de cada medio de cultivo se abren durante 30 segundos
cerca del mechero y se etiquetara “En área aséptica”.

5.- La tercera caja se conservaran sin abrir y se etiquetaran como “control”

6.- Y lo mismo meter a la estufa de incubación a 30°C durante 24 horas.

7.- Checar resultados.

CUESTIONARIO

1.- Se le dificulto vaciar en las caja petri si o no ¿Porqué?

2.- cuales son las diferentes formas de vaciado de medios de cultivos según su
consistencia.
3.- ¿porque o para que cree usted que se realice la prueba de esterilidad?
4.- ¿Cree usted que es necesario la prueba de esterilidad? Si o no ¿Por qué?

CONCLUSIONES
DISCUSIONESBIBLIOGRAFIA.
1.- Manual práctico de Microbiología. 3ª. Edición. Carlos Gamazo. Ed. Masson
2003
2.- Microbiología 2ª. Edición. Richard A. Harvey. Ed. Lippincott 2009

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PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA
PRACTICA No. 7
MÉTODOS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS.

OBJETIVOS:

Que el alumno conozca las diferentes técnicas de asilamiento en medios de

cultivos sólidos y líquidos para la obtención de cultivos puros bacterianos.

INTRODUCCION:

Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio para

caracterizar su crecimiento, hacer su identificación y determinar sus actividades
metabólicas. Un medio de cultivo es una solución acuosa de diferentes
compuestos que contiene todos los elementos indispensables que requieren los
microorganismos para crecer.
Generalmente las bacterias son inoculadas o inducidas en medios líquidos
(caldos) o solidificados para su propagación y/o conservación, así como para
estudiar sus características de crecimiento. Es importante recordar que la
inoculación de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre deberán
realizarse en zonas asépticas (cerca del mechero o campana de flujo laminar),
condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables o
contaminantes.
Las técnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismos a partir
de muestras complejas (suelo, Agua, Alimentos, etc.). En las que hay una gran
diversidad microbiana, así como para comprobar la pureza de los cultivos
obtenidos. Los cultivos puros están formados por solo un tipo de microorganismos,
y son indispensables para conocer las características morfológicas, propiedades
de tinción, Actividad Bioquímica, Patogenicidad, Sensibilidad a Antibióticos e
identificación de las especies microbianas.
En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros componentes
como: Sangre, Colorantes, indicadores, etc. Para distinguir especies bacterianas
diferentes por la forma en que metabolizan los sustratos que se manifiestan por
los cambios en la apariencia o modificación del pH del medio de cultivo. Estos
medios se conocen como medios diferenciales y son de gran utilidad para la
caracterización e identificación de especies bacterianas.

MATERIAL

Cajas de petri con medios de cultivo

1 Tubo con Agua destilada estéril
1 Mechero Bunsen
1 Asa de inoculación.
Muestras

TECNICA DE ESTRIA CRUZADA.

A).- En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en 4 cuadrantes. Tomar una

muestra con el asa previamente flameada y fría. Inocular la muestra haciendo 4 –
5 estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja.

B).- Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de petri un cuarto de

vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie
del medio lejos de la zona de estrías recién hechas.

C).- Rozar el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un
segundo grupo de estrías en el segundo cuadrante como en el caso anterior.

D).- Referir el proceso 4 y 5 en el tercer cuadrante y efectuar la siembra en el

último cuadrante, no se deben flamear el asa de siembra y se hará una estría mas
abierta (simple).

E).- Introducir la caja ya estriada en la estufa de incubación a 35°C durante 24

horas y observar su crecimiento.

OBSERVACIONES
RESULTADOS:
1.- Recopilar la información de las características coloniales de cada cepa.

2.- De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes en la

muestra problema.

Morfología colonial de cultivos bactrianos.

Aislado por estría cruzada

Forma
Color
Tamaño (mm)
Borde
Superficie
Elevación
Luz Transmitida
Luz Reflejada

Consistencia

CUESTIONARIO

1.- ¡Qué es el agar y de donde se obtiene? ¿Cuáles son los nutrimentos que
proporciona al microorganismos?
2.-¿Cuál es la composición química de los medios EMB. St 110, PDA? ¿Cuales
son los componentes o propiedades responsables de su función como medio
selectivo o diferenciales
3.- ¿Por qué el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de
bacterias?

CONCLUSIONES

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA.

1.- Wistreich. GA y MD Lechtman 1983, Practicas de laboratorio en microbiología

Editorial Limusa México.

2.- Diagnóstico Microbiológico. Bayley and Scott 12ª. Edición. Editorial

Panamericana, México.
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INDUSTRIALES. ISTMO COSTA CAMPUS IX ARRIAGA

PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA
PRACTICA No.8
TINCION DIFERENCIAL DE GRAM

OBJETIVOS:
1. Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas
de acuerdo a la tinción de Gram.
2. Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterización
e identificación de las bacterias. Hans Christian Gram (1853-1938)

INTRODUCCIÓN:
La tinción diferencial requiere más de un tipo de colorante y se utiliza para
distinguir entre varios tipos de células bacterianas. Una tinción diferencial
típicamente consiste de tres pasos principales: primero un colorante primario, el
cual se utiliza para teñir a todas las células en la tinción; enseguida un paso de
decoloración, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de células y
finalmente un colorante de contraste, el cual tiñe las células recién decoloradas
pero no tiene efecto sobre las células que aún retienen el colorante primario.
La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las
tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos
bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. La
reacción de la tinción de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se
encuentra en las paredes celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram
positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen
moléculas de ácido teicoico. El ácido teicoico reacciona con el cristal violeta y el
yodo utilizado en este proceso de tinción. Un complejo de las moléculas cristal
violeta-yodo-ácido teicoico es muy difícil de remover. Como la pared celular de las
células Gram positivas retiene estos compuestos, es más difícil decolorar una
célula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el
cristal violeta de la célula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla
de alcohol también disuelve mucho de la capa exterior de Lipopolisacárido de la
pared celular de la pared Gram negativa, lo cual acelera la remoción del colorante
primario cristal violeta de estas células.
Cuando otro colorante, usualmente safranina, se añade, las células Gram
positivas siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el
color rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de tinción, las células Gram
positivas serán del color del cristal violeta, o colorante primario, y las células Gram
negativas serán del color de la safranina que es el colorante de contraste.

MATERIAL POR EQUIPO:

- Microscopio óptico
- Colorantes para tinción de Gram
- 1 mechero
- asa microbiológica
- Piceta
- Recipiente de plástico para las tinciones
- Aceite de inmersión
- Papel seda
- Plumón indeleble

PROCEDIMIENTO:
1. Marcar un portaobjetos con el nombre del microrganismo a observar. Cada
equipo deberá hacer obligatoriamente cinco preparaciones (una preparación por
persona): de los cultivos que hayan hecho los alumnos.
2. Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar.
3. Añadir 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por
completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto.
4. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparación con la Piceta sobre el
recipiente de plástico para tinciones.
5. Agregar 1 ó 2 gotas de solución Lugol a la preparación, y dejar actuar 1 minuto.
Transcurrido el tiempo, lava.
6. Con cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparación
durante 10 segundos.
7. Añadir el colorante de contraste, safranina (1 ó 2 gotas) y dejar actuar durante
30 segundos. Lava con la Piceta.
8. Dejar secar al aire y observar al microscopio, siguiendo la técnica de la práctica
anterior para enfocar correctamente. Observar con el objetivo de inmersión.
RESULTADOS: describe brevemente los resultados obtenidos.
Dibuja tus observaciones
Género o especie:
Aumento: ×
Morfología:
Gram:
Género o especie:
Aumento: ×
Morfología:
Gram:
Género o especie:
Aumento: ×
Morfología:
Gram:

DISCUSIÓN
• Busca en la literatura, a los microorganismos observados en la práctica y
compara tus resultados con lo reportado.
• Si observaste alguna diferencia en cuanto a morfología o reacción a la tinción de
Gram, trata de buscar alguna explicación.
• Investiga qué tipo de variables pueden ocasionar que se obtengan resultados no
deseables cuando se realiza una tinción de gram (por ejemplo que una bacteria
Gram negativa se colore de morado).

CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA

CUESTIONARIO
a) Glosario. Define los siguientes términos.
1. Colorante
2. Mordente
3. Tinción diferencial
4. Tinción simple
5. Peptidoglucano
6. Ácido teicoico
7. Espacio periplásmico
8. Porinas
9. Membrana celular
10. Lipopolisacárido

b) Haz un diagrama de flujo sobre el proceso de la tinción de Gram, indicando la

función de cada sustancia empleada.
c) Haz un dibujo de las paredes celulares de una bacteria Gram positiva y una
Gram negativa señalando las principales estructuras en ellas.
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PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA
PRACTICA No. 9
MÉTODOS PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS

OBJETIVO
Conocer el número de Mohos y Levaduras que contiene un alimento.

CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE

Este procedimiento se aplica a todos los alimentos de consumos humano o animal
en los Cuales el ambiente es menos favorable para el crecimiento bacteriano por
ej. pH<5, baja humedad, aw (0.75), alto contenido en sal o azúcar, baja
temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos o exposiciones a
irradiación.

FUNDAMENTO
Los hongos son generalmente aerobios estrictos, en cambio las levaduras pueden
crecer con o sin oxígeno; en presencia de éste crecen mejor. Las levaduras
crecen más rápido que los hongos.
Existen varios medios de cultivo recomendados para alimentos, para reducir el
crecimiento bacteriano, algunos utilizan valores de pH bajos (≈4), otros la adición
de antibióticos como por ejemplo penicilina + estreptomicina, cloramfenicol,
clortetraciclina, oxytetraciclina
REFERENCIAS
Norma ISO 7954. Microbiology- General Guidance for enumeration of yeasts and
Moulds- Colony count technique al 25°C. First edition 1987.

GENERALIDADES
Los hongos y levaduras son fácilmente encontrados en alimentos en los cuales el
ambiente es menos favorable para el crecimiento bacteriano por ej bajo pH 5 o <5,
baja humedad, aw (0.75), alto contenido en sal o azúcar, baja temperatura de
almacenamiento, la presencia de de antibióticos o exposiciones a irradiación.
Causan deterioro de estos alimentos si son almacenados en condiciones
deficientes, como por ejemplo (frutas frescas, jugos de fruta, vegetales, quesos,
cereales, y alimentos deshidratados o congelados, decoloración de las superficies
de los alimentos, olores y sabores extraños. Habría que sumar al deterioro, el
peligro potencial de producción de micotoxinas, producidas por algunas especies
de hongos. Si estas sustancias son ingeridas causan intoxicación alimentaria.
Para eliminar o reducir tales problemas en los alimentos susceptibles se debería:
a) Reducir la carga de esporas con buenas prácticas de higiene.
b) Consumo rápido de los alimentos preparados
c) Guardar los alimentos congelados a-12 ºC
d) Eliminar o reducir el contacto con el aire
e) Calentar los alimentos antes de envasarlos para destruir células vegetativas y
esporas.
f) Agregar ácidos que eviten el crecimiento.
g) Agregar preservantes químicos, tales como sorbatos o benzoatos.
Ningún ser humano ni animal puede consumir alimentos que estén visiblemente
Contaminados por hongos, excepto los alimentos fabricados con algunas especies
de
Hongos que le dan su sabor característico, como por ejemplo queso roquefort,
Cammembert o ciertos salames. Las levaduras crecen más rápido que los hongos,
pero generalmente crecen en conjunto. Los hongos son generalmente aerobios
estrictos, en cambio las levaduras pueden crecer con o sin oxígeno; en presencia
de éste crecen mejor. En alimentos frescos y congelados, el encontrar un número
bajo de esporas de hongos y levaduras es poco significativo; pero si el alimento
está altamente contaminado su consumo puede resultar peligroso.

MATERIAL Y EQUIPO

1 Matraz Erlenmeyer de 250 ml

2 Mecheros Bunsen
1 Tripie
1 Tela de asbesto
1 Vaso de precipitado de 250 ml
Cajas de petri estériles o desechables
Estufa de Inoculación reguladaentre el rango de 22°C a 25º C (24°C ± 1°C).
Agua Destilada
Tubos de ensaye 16 x 160 con tapón estéril
Pipetas bacteriológicas de 1 ml. estéril

REACTIVOS.

Agar Papa Dextrosa (PDA)

PROCEDIMIENTO:

1.- Primeramente se desinfecta el área de trabajo con fenol al 5% o alcohol al 96%

se enciende el mechero.
2.- Preparar la muestra por uno de los métodos recomendados en el PRT-712.01-
002.
3.- Pipetear por duplicado a placas Petri estériles alícuotas de 1 mL de la muestra
si es producto líquido o 1 mL de la dilución 10-1 en el caso de otros productos.
4.- Sembrar por lo menos dos diluciones consecutivas por duplicado.
5.- Incubar en estufa por 5 días.
6.-Se recomienda esta serie de diluciones cuando no se conoce el rango
aproximado de Microorganismos.
7.- Agregar 15mL de agar fundido y temperado a 47ºC ± 2ºC.
El tiempo transcurrido entre la preparación de la suspensión inicial y el momento
de agregar el agar no debe exceder de los 15 min.
8.- Mezclar el inóculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La
forma adecuada de llevar a cabo esta operación sería la siguiente: Mover la placa
con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección, hacerla girar 5 veces en el
sentido de las agujas del reloj, mover con movimientos de vaivén en una dirección
que forme ángulo recto con la primera y hacerla girar 5 veces en el sentido
contrario a las agujas del reloj. Una vez solidificado el agar, NO INVERTIR las
placas.
9.- Incubar a 22 - 25ºC durante 3 a 5 días.
10.- Realizar controles de ambiente, medio de cultivo y diluyente.

LECTURA

Tomar todas las precauciones necesarias al manipular las placas Petri, para evitar
la contaminación del área de trabajo. Las esporas de los mohos se dispersan con
gran facilidad.
Usar un cuenta colonias y contar las placas que contengan menos de 150
colonias.
Si parte de la placa presenta desarrollo excesivo de hongos, o si es difícil contar
Colonias aisladas en menos tiempo, registrar los recuentos obtenidos y registrar el
Período de incubación, ya sea tres o cuatro días e incluirlo en el informe final.
No contar las placas antes de 3 días de incubación, la manipulación podría
provocar
Colonias secundarias por dispersión de esporas.
Contar las colonias de mohos las que se presentan bajo una forma filamentosa
Característica (micelio) de color variable. Estas se desarrollan más tardíamente
que las levaduras. Anotar resultados
Contar las colonias de levadura por separado. Las colonias de levaduras se
presentan en forma de colonias opacas, blancas o amarillas. Anotar resultados.
Realizar Tinción de Gram o microscopía al fresco
a las colonias sospechosas de levaduras para confirmar su presencia.

CALCULO

El número de Mohos y Levaduras por gramo o mL de alimento se determina

Según la siguiente fórmula:

N=ΣC
[ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d

Donde:

N = número de colonias por ml o g de producto

Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas
n1 = número de placas contadas de la menor dilución.
n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva.
d = dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento

EXPRESION DE RESULTADOS

Se informa Recuento de Mohos por gramo o mL de alimento y Recuento de

Levaduras por gramo o mL de alimento.

Aproximar el resultado a dos cifras significativas. Si el tercer dígito es 6, 7, 8 o 9

Adicionar una unidad al segundo dígito. Si el tercer dígito es 1, 2, 3 o 4 considerar
Solamente los dos primeros dígitos. Cuando el tercer dígito es 5, agregar una
Unidad al segundo dígito si este es impar y mantener el segundo dígito si este es
Par. Usar ceros para los demás dígitos hacia la derecha.
i todas las placas de ambas diluciones no presentan crecimiento o desarrollo,
Informar como menor de uno por el valor recíproco de la dilución menor por g o
mL.

< 1 x 1/ dm , donde dm = menor dilución

CUESTIONARIO:

1.- ¿Cuáles son las principales estructuras características de levaduras y hongos?

2.- Elaborar un cuadro comparativo de características morfológicas, nutricionales y
sensibilidad a antibióticos de hongos y bacterias. Mencione las diferencias que hay
entre las especies de hongos y endosporas de bacterias.

3.- Mencione los criterios de clasificación de hongos filamentosos y levaduras.

4.- Describir brevemente tres problemáticas concretas para el hombre causado

por hongos y tres de utilización benéfica.

RESULTADOS
CONSCLUSIONES
DISCUSIONES
BIBLIOGRAFIA