Laboratorios de Biología Celular y Microbiología

Profesores: Juan Carlos Higuita V. PhD, Ivonne Ximena Cerón MSc.

LABORATORIO
PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE
CULTIVO

El conocimiento humano sobre los efectos producidos por los microorganismos ha estado
presente incluso desde antes de tener conciencia de su existencia. Por ejemplo los procesos
de fermentación provocados por levaduras donde se elabora pan, bebidas alcohólicas y
productos derivados de la leche. En la antigüedad la causa de las enfermedades era atribuida
a castigos divinos, fuerzas sobrenaturales o factores físicos. Durante el periodo posterior al
descubrimiento de los microorganismos, el reto se convirtió en controlar las enfermedades
infecciosas por destrucción, disminución de su número o inhibición de los microorganismos.
Esto se puede llevar a cabo con diferentes métodos en función del lugar a aplicar y el grado
de erradicación microbiana que se pretende conseguir.

Por esto es conveniente definir algunos conceptos:

 Esterilización: proceso principalmente físico (pocas veces químico) que destruye toda
forma de vida microbiana, incluidas las esporas.
 Desinfección: tiene por objeto la destrucción de microorganismos mediante agentes
de naturaleza química (desinfectantes), con el fin de disminuir el número de formas
vegetativas a niveles mínimos.
 Asepsia: término que se aplica a los procedimientos utilizados para prevenir que los
microorganismos progresen en un medio determinado (quirófano, laboratorio. etc.)

1. Fundamentación

Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambio de condiciones
ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han
distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre
todo de tipo físico-químico.

Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización para limitar

su presencia o eliminarlos. La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo
de organismo y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que

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la desinfección es un proceso que solamente elimina formas vegetativas de los

microorganismos. Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de
cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan, el más recomendable es el
autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121 ºC.
El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse la destrucción de
endoesporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.

Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como las soluciones de
vitaminas, aminoácidos, etc. Se esterilizan por filtración en membranas estériles de 0.2
micras de diámetro y para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases
como óxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se
desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma líquida como: los fenoles,
compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehido, alcoholes,
halógenos y detergentes.

Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas de uso, los sistemas de
filtración son muy eficientes y rápidos para la esterilización pero solo se aplican en pequeños
volúmenes. Los fenoles y compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos para la
desinfección de superficies pero son muy corrosivos. Los detergentes y los alcoholes tienen
actividad limitada contra esporas bacterianas y algunos virus por lo que sólo son
desinfectantes.

Medios de cultivo Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en
concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiología por lo que
un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud,
confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios de
microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en
forma líquida o en forma sólida. Según la naturaleza de los medios de cultivo estos se
pueden clasificar en:
 Medios naturales o complejos
 Medios definidos o sintéticos
De acurdo al uso del medio de cultivo, estos se pueden clasificar en:
 Medios enriquecidos
 Medios selectivos

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 Medios diferenciales
Por su composición los medios de cultivo se clasifican en:
 Líquidos
 Sólidos
 Semisólidos

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus
constituyentes básicos o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente
(medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo
deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor
probabilidad de obtener resultados reproducibles.

2. Objetivos:
 General
Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización de materiales de
vidrio y medios de cultivo de uso común en microbiología.
 Específicos
o Seleccionar los métodos de esterilización adecuados para las diversas
necesidades del laboratorio de microbiología.
o Comprobar la efectividad del proceso de esterilización.
o Elaborar adecuadamente los medios de cultivo sólidos y líquidos.
o Relacionar la composición de los diversos medios de cultivo con sus
características y aplicaciones.

3. Materiales y Reactivos

Materiales
 4 cajas Petri
 2 pipetas de 1 mL
 2 pipetas de 10 mL
 2 Erlenmeyer de 250 mL
 4 Erlenmeyer de 100 mL
 Beaker de 100 mL

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 Placa de calentamiento con agitación

 1 autoclave
 1 horno de calor seco
 1 mechero
 1 Incubadora a 35ºC
 7 hisopos estéril
 Medio de cultivo líquido y sólido
 1 pliego de papel bond.
 Papel o toalla absorbente.
 Gasa y papel aluminio.
 Alcohol

4. Procedimiento
Experiencia 1
o Limpie con agua muy bien la mesa de trabajo, posteriormente rocié alcohol para
desinfectar.
o Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con detergente. Enjuagar muy bien
con agua corriente.
o Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada. Dejar escurrir el
agua y secar con papel absorbente.
o Una vez seco el material, envolver las cajas Petri y pipetas en papel bond.
Las cajas Petri deben ser ensambladas (tapa y caja) y empaquetada en grupos no
superiores de 5 placas. Ver figura 1-a.
Las pipetas deben colocarse en el mismo sentido y se enrollan en una franja de papel
bond como se muestra en la figura 1-b. Señalar con marcador la orientación de las
pipetas para facilitar su uso evitando la contaminación posterior. No empaquetar
más de 6 pipetas juntas.

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A B

Figura 1. A. Empaque Cajas de Petri. B. Empaquetamiento pipetas

Las cajas Petri y las pipetas envueltas, se deben colocar en un horno a 150ºC durante
2 horas. Transcurrido el tiempo dejarlas enfriar. Estas solamente deben abrirse en un
área aséptica.
o Preparar 120 mL de medio de cultivo sólido en un Erlenmeyer de 250 mL, siguiendo
las instrucciones del fabricante.
o Preparar 80 mL de caldo nutritivo en un Erlenmeyer de 250 mL, siguiendo las
indicaciones del fabricante. Distribuir 20 mL en cada Erlenmeyer de 100 mL.
o Taponar la boca de los Erlenmeyer con gasa y papel aluminio como se muestra en la
figura 2.

o
o Figura 2. Preparación de tapón para Erlenmeyer.

o En un beaker de 100 mL coloque en la base algodón, introduzca los hisopos y cubra

muy bien con papel aluminio.
o Esterilizar los medios de cultivo y los hisopos, siguiendo las siguientes instrucciones:

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 Revisar que el nivel del agua en el autoclave. Si es necesario agregue agua.

 Conectar el autoclave y poner la perilla de control en 25 minutos (la temperatura
de trabajo debe ser aproximadamente 121 ºC. (El autoclave disponible esta
automáticamente programado para trabajar a estas condiciones).
 Acomodar los Erlenmeyer con medio preparado y el beaker con los hisopos
dentro del autoclave.
 Cerrar la puerta y asegurar las manijas y esperar que salga el vapor de agua por el
orificio de purgado.
 Cerrar el orificio de purgado.
 Dejar que el equipo se caliente, revisando continuamente la escala del
manómetro y mantener el equipo en estas condiciones durante los 25 minutos.
 Transcurrido el tiempo, cuidadosamente y con ayuda de guantes de asbesto, abra
el orificio de purgado.
 Al finalizar el purgado abra la compuerta y retire los erlenmeyer con cuidado
evitando quemaduras por la salida de vapor.

Experiencia 2

Preparación de medios sólidos en las cajas de Petri.

o Dejar que el medio de cultivo sólido que se ha retirado del autoclave se enfríe a una
temperatura aproximada de 40-50 ºC, con el fin de poder sostener el Erlenmeyer con
la mano.
o Prenda el mechero en la mesa de trabajo completamente limpia y desinfectada con
alcohol.
o De manera aséptica cerca del mechero o en la cámara de flujo laminar, vierta
aproximadamente 25- 30 mL de medio de cultivo sólido en las cajas Petri. Deje
solidificar como se muestra en la figura 3.

Figura 3. Cajas de Petri con medio sólido

o Tapar las cajas.

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o En zona aséptica roce con un hisopo las manos de su compañero y frote suavemente
sobre el agar de una de las cajas y márquela. (Frotris – grupo – sin lavar)
o El mismo compañero que se lave las manos solamente con agua y se las seque con
una toalla desechable. Repita el procedimiento con el hisopo y frote en una segunda
caja de Petri. Márquela (Frotis – grupo - agua)
o Rocie sobre las manos de su compañero alcohol y secar con una toalla desechable.
Repita el procedimiento con el hisopo, frote en una tercera caja de petri y márquela.
(Frotis – grupo – alcohol)
o Sin abrir la cuarta caja de Petri y márquela (Control – grupo)
o Envolver las cajas con papel cristaflex.
o Colocar las cajas de petri de manera invertida al agar. en una incubadora ajustada a
30 ºC durante 24 horas.
o Revisar las cajas para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de
colonias microbianas en la superficie de los medios.

Experiencia 3

Cultivo líquido
o En zona aséptica roce con un hisopo esterilizado las manos de su compañero e
introdúzcalo sobre el medio líquido preparado en un Erlenmeyer. Tape nuevamente
el matraz y márquela (Frotis – grupo – sin lavar)
o El mismo compañero que se lave las manos solamente con agua y se las seque con
una toalla desechable. Repita el procedimiento con el hisopo y frote en un segundo
Erlenmeyer. Márquelo (Frotis – grupo - agua)
o Rocié sobre las manos de su compañero alcohol y secar con una toalla desechable.
Repita el procedimiento con el hisopo, frote en un tercer Erlenmeyer y márquelo.
(Frotis – grupo – alcohol)
o No abra el cuarto Erlenmeyer y márquelo (Control – grupo)
o Colocar los erlenmeyer. en una incubadora ajustada a 30 ºC durante 24 horas.
o Revisar las Erlenmeyer para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición
de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo.

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Experiencia 4

Esterilización de material de desecho

o Finalizada la práctica, vierta el agar de las cajas de Petri en un beaker de 250 mL y
esterilice todo el material usado.
o Una vez estéril, lave el material con agua y jabón y entréguelo al monitor

Preguntas sugeridas
1. ¿Cuáles son las condiciones generales para el cultivo de microorganismos?
2. Nombre y explique los medios de esterilización más usados.
3. Explique y de un ejemplo de los medios de cultivo según su naturaleza.
4. Explique y de un ejemplo de los medios de cultivo según su uso.
5. Explique y de un ejemplo de los medios de cultivo según su composición.
6. ¿Qué debe contener un medio de cultivo para permitir el desarrollo y crecimiento de los
microorganismos?
7. ¿Qué sustancia permite que los medios sólidos se solidifiquen?, ¿Cuáles son sus
características?
8. ¿Por qué es necesario esterilizar los medios de cultivo?
9. ¿Cómo se esteriliza el material de desecho?.¿Por qué es necesario esterilizarlo?

BIBLIOGRAFÍA

Aquihuti Ramos, María de los Angeles; Péres Chabela, María de Lourdes. Manual de
prácticas del Laboratorio de Microbiología General. Universidad Autónoma Metropolitana –
Iztalapa. México. 2004.

González, José; González, Boris; Barrial, Rosa. Laboratorio de Microbiología: Instrumentación

y principios básicos. La Habana. 2004.

Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. Microbiología: Manual de Métodos Generales. 2ª edición.

Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela. 1992

Ortega, Y.; Quevedo F. Garantía de la Calidad de los Laboratorios de Microbiología

Alimentaria. Organización Panamericana de la Salud. Organización Mundial de la Salud. 1991

Organización Mundial de la Salud – OMS. Manual de bioseguridad en laboratorio. Tercera

edición. 2005.

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