Sesión 24/03/2022

Bilogía Molecular
 Biología Molecular

Conceptos PCR un ciclo de pcr dura media hora, de 1 copia

obtenemos 30 o 40 copias
molecula de adn que va a copiar muchas veces

PCR→ Reacción en cadena de la polimerasa

Es una técnica de amplificación de ADN que nos

permite replicar una misma secuencia millones de
veces en poco tiempo.
Además nos permite localizar una secuencia
concreta y obtener muchas copias de ella

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 Biologia Molecular
Componentes de la PCR
ADN molde→ cadena que se quiere replicar
secuencia corta que se une al adn para que la polimerasa se uniera
PRIMERS o Cebadores→ es el factor mas importante
para que una PCR sea eficaz.
primers: Son oligonucleótidos de cadena corta y secuencia

conocida, que será complementaria a la secuencia que

queremos amplificar.
Se utilizan 2 cebadores uno para cada una de las
cadenas de ADN

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 Biología molecular

PCR

Sesión 20/01/2022 4
 Biología molecular
Componentes PCR
de adenina, citosina, guanina y timina
nucleotidos de adn

Desoxirribonucleótidos trifosfatados o dNTP→ (

dATP, dCTP, dGTP,dTTP) son elementos químicos
cargados positivamente necesarios para que funcione
la polimerasa.

Cloruro de Mg → Optimiza la reacción.

hace que la reaccion funciones mejor

Sesión 20/01/2022 5
 Biología Molecular
Componentes PCR degradan adn/arn

Agua libre de ADNasas y ARNasas

tampon
o
Buffer para mantener el PH (entre 8 y 9)

Taq-polimerasa→ (por la bacteria tolerante al calor de

la que se aisló (Thermus aquaticus). Es una ADN
polimerasa que es estable y actúa eficientemente a
altas temperaturas para que no se inactive

todo esta mezcla (llamada master mix) de componentes de PCR se llevan al termociclador

Sesión 20/01/2022 6
 Biología Molecular

PCR
A toda esta mezcla de componentes se le llama
master mix y es lo que introduciremos todo junto en el
termociclador (el cual realiza la PCR) para amplificar
la secuencia seleccionada

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 Bilogía Molecualr

Etapas de la PCR
para mandar a los cebadores las hebras tienen que estar abiertas
1ª Etapa→ Desnaturalización del ADN elevando la
temperatura (95ºC) y se produce la separación de las 2
cadenas del ADN dura 3-5 minutas esta etapa
para que los cebadores se unan a su zona complementaria se tiene que bajar la temperatura
2ª Etapa→ Hibridación de los cebadores, se baja la
temperatura a unos 50ºC-70ºC lo que permite que los
cebadores se unan a su región complementaria de la
cadena de ADN annealing--> temperatura optima para que se unan los cebadores

Sesión 20/01/2022 8
 Biología Molecular

Etapas PCR
Tercera etapa→ Extensión o elongación en la cual
se une la taq-polimerasa a los cebadores y a partir de
(fabricar)
ellos sintetiza las cadenas complementarias al
fragmento molde.
Los cebadores marcan el inicio de la replicación y por
lo tanto la secuencia a amplificar

Sesión 20/01/2022 9
 Biología Molecular

temperatura idonea para la polimerasa

Sesión 20/01/2022 10
 Biología Molecular
PCR
Todas estas reacciones se repiten en ciclos entre 30 y
40 veces dando lugar a una amplificación en cadena
del fragmento de ADN

Se utiliza el termociclador que es un sistema

programable que enfia y calienta la reacción en
periodos cortos de tiempo consiguiendo en cada fase
la temperatura adecuada para que se produzca la
replicación del ADN

Sesión 20/01/2022 11
 pagina 128 la explicacion de cada una
Biología Molecular
Problemas que pueden surgir en una PCR
puede ser porque no hay suficiente cantidad de cloruro de magnesio, la reacción no se optimizara y se soluciona con un aumento de magnesio. También puede
ser porque los cebadores no se han unido, porque la t no ha bajado lo suficiente o porque se han degradado. Esto se soluciona bajando la t y si se han degradado
no hay solucion
1. No se produce amplificación la zona que se ha amplificado no es la que queríamos (el cebador se
equivoca) esto puede ser porque tengamos mucha concentración de dnpts y
2. Amplificaciones inespecíficasse unen en zonas que no son y tendremos que bajar el magnesio.
a veces los cebadores se complementan entre ellos y se unen entre
3. Se forman dímeros de cebadoresellos y no a la cadena molde. Se soluciona añadiendo a la muestra
rapdiamente el adn molde
4. Se produce contaminación ( hay q contar siempre
con un control negativo muestras con todos los
componentes menos el ADN y un control positivo
muestra de ADN q haya amplificado correctamente
y se conozca el patrón de bandas)control positivo: una muestra con ADN que ha amplificado
correctamente
contaminacion con otro ADN o moleculas/particulas

Sesión 20/01/2022 12
 Control Alimentario
Variantes de la PCR
• PCR multiplex→ Amplificación simultanea de varios
fragmentos de ADN
• PCR anidada→ doble PCR una primera y la
segunda se realiza sobre el producto de la primera
• PCR a tiempo real→ permite cuantificar y detectar
haciendo el seguimiento de la PCR paso a paso

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