Universidad Autónoma del Estado de México

Facultad de Odontología – Cirujano Dentista

Microbiología general

Practica No. 4: “Tinción diferencial de Gram”

Alumnos; Grupo 3, Equipo 3::

Cruz Bahena Lisset Perla
Flores Antonio Ximena
Olvera Flores Iván de Jesús

Profesores:

DR. EN C. ISAIAS DE LA ROSA GOMEZ

E. EN ES. LUIS MANUEL LAREDO MOYSEN
Título de la práctica: “Tinción diferencial de Gram”

Objetivos: Llevar a cabo una tinción diferencial (tinción de Gram) para identificar dos tipos de
microorganismos, Gram positivos (G +) y negativos (G -).

Antecedentes:

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en

bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su
nombre al bacteriólogo danés Christian Gram (1853-1938), que desarrolló la técnica en 1884.

Fig. 1: Bacterias Escherichia coli (G -) y bacterias de Clostridium perfringens (G +) vistas al

microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.

Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar
una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias G + a las
que se visualizan de color morado y bacterias G - a las que se visualizan de color rosado y rojo.

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto G + como
G -) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por yodo en equilibrio
con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo, y actúa de mordiente,
haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El
yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal
violeta.

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la

misma es soluble el complejo cristal violeta. Los organismos gram positivos no se decoloran,
mientras que los gram negativos sí lo hacen.

Para poner de manifiesto las células G - se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente
es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de
contraste las células G - son rojas, mientras que las G + permanecen violetas.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un
decolorante, y el color no se modifica al añadir este; otros pierden con facilidad el primer tinte, y
toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de gram positivos, y los que pierden la
primera coloración y retienen la segunda, de G -.

Pared celular

La pared celular es una capa resistente y rígida que se localiza en el exterior de la membrana
plasmática en las células de plantas, hongos, algas, bacterias y arqueas (no presente en
micoplasmas). La pared celular da rigidez a la célula, protege su contenido, funciona como
mediadora en todas sus relaciones con el entorno, actúa como compartimiento celular y
soporta las fuerzas osmóticas y el crecimiento. Además, en el caso de hongos y plantas, define
la estructura y otorga soporte a los tejidos y muchas más partes de la célula.

Fig. 2: Estructura química de las paredes celulares de las bacterias G + y G -.

La pared celular se construye a partir de diversos materiales, dependiendo de la clase de

organismo. En las plantas, la pared celular se compone, sobre todo, de un polímero de
carbohidrato denominado celulosa, un polisacárido, y puede actuar también como almacén de
carbohidratos para la célula. En las bacterias, la pared celular se compone de peptidoglicano.
Entre las arqueas se presentan paredes celulares con distintas composiciones químicas,
incluyendo capas S de glicoproteínas, pseudopeptidoglicano o polisacáridos. Los hongos
presentan paredes celulares de quitina, y las algas tienen típicamente paredes construidas a
partir de glicoproteínas y polisacáridos. No obstante, algunas especies de algas pueden
presentar una pared celular compuesta por dióxido de silicio. A menudo, se presentan otras
moléculas accesorias integradas en la pared celular.
Fundamento de la técnica

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las
bacterias G + y G -.

Fig. 3: Paredes celulares de las bacterias G + y G -.

La pared celular de las bacterias G + posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de
dos clases de ácidos teicoicos: anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la
membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido
teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido como mureína).

Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las bacterias G - es delgada, y se encuentra

unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por
medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana
exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y
lipopolisacárido.

Ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de

su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared
celular bacteriana, y las G + lo poseen en mucha mayor proporción que las G -.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración se debe a que la membrana
externa de las bacterias G - es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de
alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder
retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este
complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Por el contrario, las bacterias G
+, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no
son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los
poros, cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y
manteniendo la coloración azul-violeta.

Fig. 4: Ejemplos de algunos microorganismos G + y G -.

Existen dos tipos de colorantes según su origen: naturales y artificiales. Los colorantes
naturales se obtienen de la naturaleza: de plantas y animales como la hematoxilina o el carmín.
Los colorantes artificiales son sintetizados químicamente en el laboratorio, por ejemplo: la
eosina.

Colorantes catiónicos, aniónicos y neutros

● Los colorantes catiónicos: colorean estructuras aniónicas de las células. Ejemplo: Azul
de toluidina, hematoxilina.
● Los colorantes aniónicos colorean las estructuras catiónicas de las células. Ejemplo:
eosina, verde luz, azul de anilina.
 ● Los colorantes neutros están formados por una mezcla de colorantes catiónicos y
aniónicos. Ejemplo: May Grunwald-Giemsa.

Acidofilia y basofilia

“Acidofilia” significa afinidad por los colorantes ácidos (aniónicos).

“Basofilia” significa afinidad por los colorantes básicos (catiónicos).

El colorante

Los colorantes son sustancias que tienen la capacidad de teñir células, estructuras o tejidos; y
de acuerdo con su origen, permiten hacer visibles los objetos microscópicos y transparentes,
conocer su forma y tamaño, así como sus estructuras internas y externas. Los colorantes
hacen parte de reacciones químicas específicas y de acuerdo con su origen, se pueden
clasificar en naturales, aquellos que son extraídos de plantas o animales, y artificiales, los que
se extraen de minerales y son procesados en el laboratorio. En cuanto a su estructura química
los colorantes están constituidos por un grupo funcional cromóforo y un auxócromo .

En un colorante, el cromóforo es un grupo funcional que cuenta con una alta densidad
electrónica y por lo tanto se pueden clasificar de la siguiente manera:

● Dobles y triples enlaces carbono-carbono

● Anillos aromáticos
● Grupos carbonilos, imino, diazo y nitro
● Estructuras que presentan enlaces entre el carbono y átomos con pares de electrones
libres.

Por su parte, los auxocromos, son sustituyentes del cromóforo y alteran los valores de las
longitudes de onda en las que se presentan las absorciones de la luz. Generalmente, los
auxocromos son grupos mucho más sencillos que los cromóforos, como es el caso de grupos
metilo (-CH3), halógenos (-X), hidroxilos (-OH), y amino (-NH2).

Dependiendo de la sustitución en el cromóforo y el sustituyente o auxocromo, los efectos que

se logran en la molécula del colorante se han clasificado de acuerdo al desplazamiento de la
banda de absorción en el espectro.

Si el auxocromo causa una absorción del cromóforo hacia longitudes de onda mayores se
denomina batocrómico. Si el auxocromo causa una absorción del cromóforo hacia longitudes
de onda menores se denomina hipsocrómico.

Tipos de tinciones

Una tinción simple es una técnica de tinción básica utilizada en microscopía para hacer
visibles las bacterias. Este proceso de tinción utiliza un solo tinte para colorear las células, lo
que las hace más fáciles de identificar bajo un microscopio. Las tinciones simples son rápidas y
fáciles de realizar, lo que las hace ideales para su uso en aulas y laboratorios. Además, se
pueden usar tinciones simples para diferenciar entre diferentes tipos de bacterias.

La tinción simple es una técnica utilizada para colorear células y tejidos para que puedan ser
estudiados bajo el microscopio. Las tinciones simples más comunes son el violeta cristal, el
azul de metileno y la fucsina básica. La tinción simple se puede utilizar para teñir bacterias,
protozoos y levaduras. También se puede utilizar para teñir tejidos vegetales.

El cristal violeta es el colorante simple más utilizado. Es un colorante básico que tiñe las células
de color púrpura. El azul de metileno es otra mancha simple común. Es un tinte ácido que tiñe
las células de azul. La fucsina básica es un colorante básico que tiñe las células de rosa o rojo.

La tinción simple es una forma rápida y fácil de colorear las células para que puedan
observarse bajo el microscopio. Sin embargo, no proporciona mucha información sobre la
estructura de la célula. Una mancha simple es un tinte único que se utiliza para colorear un
microorganismo. Las tinciones simples más comunes son el violeta cristal, el azul de metileno,
la fucsina básica y la safranina. Estas manchas se pueden usar para identificar bacterias por su
morfología (forma).

● El cristal violeta es la tinción primaria utilizada en el procedimiento de tinción de Gram.

Colorea de púrpura la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.
● El azul de metileno generalmente se usa como contratinción, lo que significa que
colorea todas las células excepto aquellas que ya han sido teñidas con otro tinte.
● La fucsina básica tiñe las bacterias acidorresistentes de rojo o rosa, mientras que la
safranina tiñe de verde a todas las demás bacterias.

Las tinciones diferenciales se utilizan en microbiología para ayudar a identificar diferentes

tipos de microorganismos. La tinción diferencial más común es la tinción de Gram, que utiliza
cristal violeta, yodo y un agente decolorante para ayudar a distinguir entre bacterias Gram
positivas y Gram negativas. Otras tinciones diferenciales incluyen la tinción acidorresistente,
que se usa para identificar especies de Mycobacterium, y la tinción de endosporas, que se usa
para identificar esporas bacterianas.

Las tinciones diferenciales son un tipo de tinción que se usa en microscopía para ayudar a
identificar diferentes tipos de células y bacterias. Hay muchos tipos diferentes de tinciones
diferenciales, cada una con su propio propósito específico. Las tinciones diferenciales más
comunes son la tinción de Gram, la tinción acidorresistente y la tinción de endosporas.

La tinción de Gram es la tinción diferencial más utilizada. Se utiliza para identificar bactérias
que son G + o G -. Las bacterias G + tienen una capa gruesa de peptidoglicano en sus paredes
celulares, mientras que las bacterias G - tienen una capa delgada. Esta diferencia se puede ver
bajo un microscopio cuando las células se tiñen con colorante violeta cristal. Las bacterias G +
aparecerán de color púrpura, mientras que las bacterias G - aparecerán de color rojo o rosa.
Material:

El set de coloración de Gram está compuesto por:

● Cristal violeta
● Lugol
● Alcohol acetona
● Safranina o fucsina básica

Tecnica o método:

El proceso de tinción consta de los siguientes pasos:

1. Con el asa de cultivo se cogen varias cargas (colonias, células bacterianas), y se

extienden por el portaobjetos. No se añade agua destilada.
2. El proceso de fijación se realiza por calor a la llama.
3. Se añade cristal violeta, recubriendo con este colorante el portaobjetos durante 2 o 3
minutos.
4. Ahora se añade lugol (yoduro potásico 2% + yodo) durante 1 minuto. El lugol no es un
colorante en sí, sino que hace de mordiente. El mordiente se acopla con el colorante y
facilita su absorción por parte del microorganismo.
5. Se lava el portaobjetos con agua destilada. El agua no debe tocar directamente la
muestra.
6. Decolorado con alcohol 96%. Se añade el alcohol gota a gota, y de la muestra saldrán
gotas violáceas. Paramos de añadir alcohol cuando salga la primera gota transparente
de la muestra.
7. Se añade el colorante de contraste, la safranina, durante 5 minutos.
8. Por último se lava el portaobjetos y se seca.
Fig. X: Procedimiento esquemático de la tinción de Gram
Factores que afectan la tinción de Gram

● Edad de la bacteria.
● Errores del operador.
● Uso de antibióticos

A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado con
precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de
bacterias G + pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como G -) y la técnica
empleada (al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias
G+ se tiñan como G-). Por esta situación, junto a la muestra deben teñirse controles con
bacterias G + (por ejemplo Staphylococcus aureus) y G - (por ejemplo, Escherichia coli).

Resultados:

Fig. X: Microfotografías de las tinciones obtenidas de S. aureus y C. albicans

Discusión y conclusión:

La tinción de Gram es una técnica fundamental en microbiología utilizada para diferenciar

bacterias en dos grupos principales: las bacterias Gram-positivas y las bacterias
Gram-negativas. A continuación, se presentan algunas conclusiones clave sobre la tinción de
Gram:

1. Clasificación de bacterias:
 La tinción de Gram permite clasificar a las bacterias en función de las diferencias en su
pared celular. Las bacterias Gram-positivas retienen el color violeta-azul de la tinción de
cristal violeta, mientras que las bacterias Gram-negativas se tiñen de rosa-rojo después
de la tinción con safranina.

2. Pared celular:
Las bacterias Gram-positivas tienen una pared celular gruesa compuesta principalmente
de peptidoglicano. Esta pared gruesa retiene el cristal violeta y da como resultado un
color violeta-azul.
Las bacterias Gram-negativas tienen una pared celular más delgada que consiste en
una capa de peptidoglicano rodeada por una membrana externa que contiene
lipopolisacáridos. Esta estructura permite la penetración de la safranina y da como
resultado un color rosa-rojo.

3. Importancia clínica:
La tinción de Gram es una herramienta esencial en el diagnóstico y la clasificación de
infecciones bacterianas. Ayuda a los médicos a elegir el tratamiento adecuado, ya que
las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas a menudo responden de manera
diferente a los antibióticos.
También puede proporcionar información sobre la morfología y la estructura de las
bacterias, lo que puede ayudar en la identificación de especies bacterianas específicas.

4. Limitaciones:
No todas las bacterias se pueden clasificar claramente como Gram-positivas o
Gram-negativas. Algunas bacterias tienen una estructura de pared celular atípica o
varían en su respuesta a la tinción de Gram.
La técnica de tinción de Gram solo proporciona información sobre la estructura de la
pared celular de las bacterias y no ofrece detalles sobre otras características, como la
capacidad de patogenicidad o la identificación a nivel de especie.

5. Pasos de la tinción de Gram:

La técnica de tinción de Gram implica varios pasos, que incluyen la tinción con cristal
violeta, el lavado con yoduro de potasio, la descoloración con alcohol o acetona y la
tinción con safranina.
Es importante seguir cuidadosamente los procedimientos y los tiempos de exposición
para obtener resultados precisos y reproducibles.

En resumen, la tinción de Gram es una técnica microbiológica esencial que permite la

clasificación de bacterias en Gram-positivas y Gram-negativas. Esta clasificación es valiosa en
el diagnóstico de infecciones y en la elección de tratamientos adecuados. Aunque es una
técnica poderosa, no es adecuada para todas las situaciones y no proporciona información
detallada sobre la identificación de especies bacterianas.
Bibliografia:

● Gram, C. (1884). The differential staining of Schizomycetes in tissue sections and in

dried preparations. Fortschritte der Medizin, 2, 185-9. Disponible en
https://web.archive.org/web/20160610220109/http://www.asmusa.org/ccLibraryFiles/FIL
ENAME/0000000235/1884p215.pdf
● Madigan, M. T; Martinko J., Parker J. (2004): Brock biology of microorganisms. Lippincott
Williams & Wilkins, décima edición, 2004. ISBN 0-13-066271-2.