UNIVERSIDAD NACIONAL TORIBIO RODRÍGUEZ DE

MENDOZA DE AMAZONAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

TINCIÓN DE GRAM

ASIGNATURA:
Microbiología Ambiental
DOCENTE:

CAMPOS RAMOS, Ricardo

ESTUDIANTES:

- ACOSTA ACOSTA, Waldir Miguel

- ALVA DÍAZ, Luis Humberto

- CABAÑAS HUMÁN, Melytza

- CÓRDOVA HUAMÁN, Daiman Brandon

- TAFUR BAZAN, Leydi.

CHACHAPOYAS, 2019 II.

1
 ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 3

II. OBJETIVOS ....................................................................................................... 4

1. FUNDAMENTO TEÓRICO ............................................................................... 4

1.1. TINCIÓN DE GRAM .................................................................................. 4

1.2. COLORANTES ........................................................................................... 6

1.3. GRAM-NEGATIVAS Y GRAM-POSITIVAS ............................................ 7

1.4. APLICACIONES DE LA TINCIÓN DE GRAM ....................................... 10

2. METODOLOGÍA ............................................................................................. 11

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 18

4. CONCLUSIONES ............................................................................................ 19

5. ANEXOS .......................................................................................................... 19

6. REFERENCIAS ............................................................................................... 20

2
 I. INTRODUCCIÓN

En la década de 1880, en un hospital de Berlín, trabajó el médico danés Hans Christian

Gram quien desarrolló la más importante tinción bacteriológica. Él desarrolló una técnica
de tinción en la cual observaba bacterias en tejidos de pulmones de pacientes que morían de
neumonía. El procedimiento, ahora llamado tinción de Gram, demostró dos categorías
generales de bacterias que causaban neumonía: algunas se teñían de violeta y otras se teñían
de rojo. Las bacterias teñidas de violeta fueron conocidas como Gram positivas, y las teñidas
de rojo como Gram negativas. (Arenas, 2018)
La tinción de Gram es una técnica muy utilizada, desde su descubrimiento hasta la
actualidad, esto se debe a su procedimiento sencillo, eficaz y económico. Es un tipo de
tinción diferencial empleado en la microbiología para la observación de bacterias, se utiliza
tanto como para referirse a su morfología y diferenciación bacteriana.

En este informe, daremos a conocer de una manera detallada, sencilla, eficaz: conceptos,
importancia y aplicaciones en campos requeridos.

“Si no conozco una cosa, la investigaré”.

-Louis Pasteur.

3
 II. OBJETIVOS

 GENERAL

- Identificar las aplicaciones de la Tinción de Gram con referencia a su

fundamento teórico.

 ESPECÍFICOS

- Analizar fuentes para conocer conceptos fundamentales sobre la Tinción de

Gram.
- Determinar la relación existente entre los reactivos y estructura celular.
- Realizar la parte experimental en laboratorio, para demostrar y consolidar
nuestro aprendizaje.

1. FUNDAMENTO TEÓRICO
1.1. TINCIÓN DE GRAM
Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las
bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram-negativas y bacterias Gram-positivas. Los
principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de
las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. La pared
celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglicano
y una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared
celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular
externa; así pues, la composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared
celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las
características tintoriales. (Luis Esaú López-Jácome, 2014)

4
  DESCRIPCIÓN DE LA TINCIÓN DE GRAM:

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de
cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para
quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las Gram-positivas
como las Gram-negativas, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una
solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente
hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua
con el cristal violeta. De nuevo tanto las células Gram-positivas como las Gram-negativas
se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después la decoloración, usando una
mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta.
Algunos organismos (Gram-positivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos)
lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia
a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de
bacterias Gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la
membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana
citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz
de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células Gram-
positivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos
lípido), no son permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo
quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células Gram
positivas son todavía azules, pero las Gram negativas son incoloras. Para poner de
manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente
es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración
de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas
permanecen azules.

La tinción de Gram puede proporcionar información rápida para diagnósticos de infecciones,

puede revelar los agentes causales incluso con una toma de muestra no adecuada. También
hace posible distinguir entre contaminación de la muestra y una verdadera infección. Puede
ayudar al clínico a seguir o cambiar un tratamiento antibiótico inicial antes de los resultados
del cultivo, y en algunos casos, es capaz de mostrar la necesidad de una atención médica
urgente.
5
 1.2. COLORANTES
Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo de la
microbiología.
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras,
etcétera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son
extraídos de plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales
procesados y manipulados en el laboratorio.

Químicamente, el colorante está constituido de un componente cromóforo y un auxócromo.

El cromóforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene una absorción
característica en la región ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la capacidad que
tiene la molécula para que sus electrones absorban energía o luz visible, se exciten y emitan
diversos colores de acuerdo con la longitud emitida como resultado del cambio en el nivel
energético. Cabe mencionar que esta longitud de onda corresponde al rango de espectro
visible. Los colorantes tienen las siguientes funciones:

- Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.

- Revelan su forma y tamaño.
- Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
- Producen reacciones químicas específicas.

Colorantes usados en la Tinción de Gram:

- CRISTAL VIOLETA. - Es un colorante primario de la coloración de Gram que se

adhiere a la pared celular bacteriana, las bacterias Gram-positivas, absorben este
colorante porque tienen mayor porcentaje de ácido teicoico en su estructura y por eso
adquieren un color violeta en el microscopio, lo cual permite identificar su estructura y
composición de la pared celular de las bacterias. (Antonio, 2015)

6
- SAFRANINA. - Es un colorante biológico también
conocido como dimetil safranina y rojo básico 2. Al ser
una molécula cargada positivamente (catión) es capaz de
combinarse con elementos celulares de cargas negativas,
Ilustración 1. Estructura química de la
safranina. Recuperado de:
la colorante safranina O es comúnmente utilizado para https://commons.wikimedia.org/wiki/
File:Safranin.svg
teñir tejidos biológicos, y sirve como herramienta en la
detección de estructuras en células eucariontes y procariontes. La tinción de Gram es el
ejemplo más común del uso de rojo básico 2. Esto, gracias al alemán Carl Weigert quien
mejoró la técnica de Gram al añadir safranina después del lavado de etanol logrando
teñir de rosa a las bacterias Gram negativas, las cuales pierden el colorante cristal violeta
después de ese lavado.

- ACEITE DE INMERSIÓN. - En general el aceite de inmersión sirve para aumentar la

resolución de un microscopio mediante la inmersión del lente objetivo y el espécimen
en un aceite transparente de alto índice de refracción, lo cual ayuda a aumentar la
resolución de los microscopios con una gran ampliación y sella el espacio de aire entre
el objetivo y la cubierta de vidrio. (Herenz, s.f)

- AZUL DE METILENO. - Es un colorante de naturaleza orgánica, también conocido

con el nombre de cloruro de metiltionina. Fue sintetizado en el año 1876 para teñir
prendas textiles, sin embargo, no pasó mucho tiempo en que los científicos de la época
descubrieran su gran utilidad en el campo de la medicina, especialmente para teñir
preparaciones microscópicas. Este uso aún se conserva, pues actualmente es utilizado en
técnicas de coloración simple para el diagnóstico de ciertas patologías infecciosas, tales
como, pitiriasis versicolor, eritrasma o meningitis por Haemophilus influenzae, su
fórmula C16H18ClN3S. (Gil, s.f)

1.3. GRAM-NEGATIVAS Y GRAM-POSITIVAS

LAS BACTERIAS GRAM-POSITIVAS

Se le denomina bacterias Gram-positivas a aquellas que se tiñen de azul oscuro o violeta

por la tinción de Gram. esta característica química está íntimamente ligada a la estructura de
la envoltura celular, por lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana. son grupos

7
principales de bacterias y, cuando se tratan como taxón, se utiliza también el nombre de
posbacteria y las que restan son las bacterias Gram-negativas. (Okdiario, 2017)

Composición de su pared celular:

La pared celular de las bacterias Gram-positivas está formada en un 90% por peptidoglicano,
siendo éste el principal componente que permite diferenciarlas con la pared de las Gram
negativas, pues al teñirlas, es gracias a él, al grosor que este le proporciona, que se logra
mantener la coloración del cristal violeta en el interior de la célula al teñirla con la tinción
Gram.

Además del peptidoglicano, esta se encuentra compuesta de ácidos teicoico, los cuales están
presentes en pequeñas cantidades. Estos se presentan embebidos en la pared de la
bacteria como polisacáridos ácidos. (Okdiario, 2017)

LAS BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS

Son aquellas que no se tiñen de azul oscuro o de violeta por la tinción de Gram, y lo hacen
de un color rosado tenue. Las bacterias Gram-negativas no retienen el colorante de cristal
violeta durante el proceso de coloración porque presentan una capa muy delgada de
peptidoglicano en su pared celular y su capa más externa está cubierta por una membrana
de lipoproteínas. (Revistas Bolivianas, 2014)

Composición de su pared celular:

Pared celular. En las bacterias Gram-negativas tiene unos 10 nm de espesor y es más

compleja que en las Gram-positivas, tanto química como estructuralmente. Sus
componentes son: Peptidoglicano o mureína, espacio periplasmático, membrana externa,
proteínas, lipopolisacáridos.

8
Diferencias entre bacterias Gram-negativas y Gram-positivas:

Bacterias Gram-positivas Bacterias Gram-negativas

- Poseen peptidoglicano (mureína),
lo cual forma una capa gruesa en
este tipo de bacterias.
- No cuentan con una membrana
externa
- No tienen espacio
periplasmático.
- Poseen una red de mureína que
está bien desarrollada y puede
llegar a tener hasta 40 capas.
- La penicilina mata a la
grampositivas.
- Retienen la tinción azul, etc.
- Poseen una pared celular más completa, pero
una capa más delgada de peptidoglicano.
- Las negativas tienen membrana externa que
forma un saco rígido alrededor de la bacteria.
- Sí tienen espacio periplasmático, entre la
superficie externa de la membrana
citoplasmática y la interna de la membrana
externa.
- Cuentan solamente con una capa.
- La penicilina no mata a las gramnegativas, es
decir son más resistentes a los antibióticos.
- No retienen la tinción azul, ellas quedan
decoloradas, etc.

Comparación de envolturas celulares bacterianas:

Bacteria Gram-positiva
1. Membrana citoplasmática
2. Peptidoglicano
3. Fosfolípidos
4. Proteínas
5. Ácido lipoteicoico.

Bacteria Gram-negativa
1. Membrana citoplasmática
(membrana interna)
2. Espacio periplasmático
3. Membrana externa
4. Fosfolípidos
5. Peptidoglicano
6. Lipoproteína
7. Proteínas
8. Lipopolisacáridos
9. Porinas.
Ilustración 2: Comparación de las envolturas celulares bacterianas. Arriba: Bacteria Gram-positiva. Abajo Bacteria
Gram-negativa.

9
 1.4. APLICACIONES DE LA TINCIÓN DE GRAM
La tinción de Gram es importante porque permite diferenciar bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas. Debido a esto se utiliza en el sector salud permitiendo reconocer bacterias
que causan problemas las personas. Dentro de estas bacterias que podemos reconocer
tenemos:

 Escherichia coli: Bacteria que causa problemas

en el tracto intestinal del ser humano. La tinción
de Gram revela que la bacteria Escherichia coli
está integrada por bacilos Gram negativos, no
esporulados, móviles con flagelos peritricos. Su
nicho ecológico natural es el intestino delgado y
grueso, forma parte de la flora nativa intestinal.
(Arteaga, Farfan, & Pinto, 2015)
Ilustración 3: Escherichia coli.
Recuperado
de:https://estaticos.muyinteresante.es/
media/cache/760x570_thumb/uploads/i
mages/pyr/55520750c0ea197b3fd50a8c/
ecoli-p.jpg

 Gonorrea: En el diagnóstico precoz de la

gonorrea y su tratamiento, la evaluación
microscópica representa un elemento importante,
ya que es rápido, económico y sencillo. La
sensibilidad de la tinción de Gram para detectar N.
Ilustración 4: Neisseria gonorrhoeae.
gonorrhoeae es próxima al 100%. (Morales Parra, Recuperado
de:https://3.bp.blogspot.com/-
2013) Mte2iUfyNC8/W2VpjNWMAqI/AAAAAAA
AAJ4/fB9b_xThRkg42Mz3OE9z87xj3w5A

 Vaginosis bacteriana (VB): es un desorden del

ecosistema vaginal caracterizado por un
cambio en la flora vaginal (Lactobacilos) por
microorganismos anaerobios que incluyen G.
vaginalis, Mobiluncus sp. Estudios han demostrado
que la tinción de Gram tiene una muy buena
correlación con el diagnostico de vaginosis
bacteriana. (Morales Parra, 2013)
Ilustración 5: Gardnerella vaginalis.
Recuperado
de:https://www.shutterstock.com/es/i
mage-illustration/microscopic-
diagnosis-bacterial-vaginosis-vaginal-
secretions-751105378

 Tinción de Gram de tejido: la identificación de microorganismos en tejido es

esencial para reconocer un proceso infeccioso. Inicialmente, mediante la coloración

10
 de hematoxilina-eosina, se puede identificar el patrón de inflamación asociado y
luego, a través de tinciones basadas en plata y la tinción de Gram de tejido se
visualizan los microorganismos. La tinción de Gram no solo sirve para bacterias,
sino también para algunos hongos y parásitos. (Jiménez & Vélez, 2012).

2. METODOLOGÍA

2.1. MATERIALES

- Porta Objetos - Asa Bacteriológica

- Cubre Objetos - Microscopio
- Isopo Estirilizado - Vaso de Presipitación
- Papel Toalla - Agua Estancada
- Agua Destilada - Sarro Dental
- Alcohol - Medio de Cultivo (agar
- Mechero de Alcohol nutritivo).

2.2. REACTIVOS

- Cristal Violeta - Aceite de Inmersión o Aceite

- Yodopovirona (Lugol) de Cedro
- Alcohol Acetona - Azul de Metileno.
- Safranina

Antes de realizar los pasos para la tinción Gram debes prepararte para el trabajo en el

laboratorio de manera personal usando la correcta instrumentaria y debes preparar tu área

de trabajo y proceder a realizar tu prueba de tinción Gram.

11
TINCIÓN GRAM EN MEDIO DE CULTIVO

PASO 1: Esterilizar el asa

Microbiológica.

FOTOGRAFÍA 1

PASO 2: Con el asa

microbiológica tomar una
muestra de cultivo.
De cultivo

FOTOGRAFIA 2

12
 PASO 3: Colocar la muestra de cultivo
en un porta objeto para proceder agregar
los diferentes colorantes para la tinción
Gram.
(debes fijar la muestra con el mechero
antes de agregar los colorantes)

FOTOGRAFÍA 3

PASO 4: Agregar cristal de violeta a la

muestra para poner de manifiesto las
bacterias Gram-positivas. Dejarla por 60
segundos.

FOTOGRAFÍA 4

13
 PASO 5: Enjuagar con agua destilada
el cristal de violeta de manera que este
no se enjuague por completo.

FOTOGRAFÍA 5

PASO 6: Agregar yodopovirona

(Lugol) para atrapar el color cristal
violeta en la célula. Dejarla por 60
segundos.

FOTOGRAFÍA 6

14
 PASO 7: Enjuagar el lugol de manera
cuidadosa con agua destilada.

FOTOGRAFÍA 7

PASO 8: Agregar alcohol acetona para

quitar el exceso de cristal violeta pero

sin eliminarla por completo, hacerla de

manera rápida y cuidadosa.(máximo 10

segundos)

FOTOGRAFÍA 8

15
 PASO 9: Agregar safranina a la
muestra para darle el color rosado o
rojo a las bacterias Gram-negativas.
Dejarla por 45 segundos.

FOTOGRAFÍA 9

PASO 10: Enjuagar con el agua

destilada, cuidadosamente.

FOTOGRAFÍA 10

16
 Paso 11: Colacar la muestra en el

microscopio para observar las bacterias

Gram-positivas y Gram-negativas.

FOTOGRAFÍA 11

PASO 12: Observar a través del

microscopio y notar las diferencias entre

las Gram-positivas y las Gram-negativas

FOTOGRAFÍA 12

17
 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Luego de realizar el experimento de laboratorio siguiendo los pasos respectivos y con el

cuidado correspondiente (utilizando el medio de cultivo elaborado anterior mente: agar

nutritivo), se verificó la importancia de la tinción Gram, ya que permite la diferenciación

de las bacterias en estos dos grupos.

Las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, eran fácilmente distinguibles. Las bacterias

Gram-negativas según su fundamento teórico, poseen una pared celular delgada y una

segunda membrana lipídica, esto hace que no retengan el colorante cristal violeta, por lo

tanto, estas bacterias se tiñen de color rosa o rojo por influencia de la safranina. Mientras

tanto las bacterias Gram-positivas adoptan una tonalidad violeta.

Este tipo de bacterias son prácticamente incoloras, lo que representa una dificultad al

momento de querer observarlas a través de un microscopio, pero con ayuda de la tinción de

Gram se puede identificar a dos grandes grupos de bacterias las Gram-negativas y Gram-

positivas.

 El cristal violeta como colorante primario, este se adhiere a la pared celular

bacteriana, las Gram-positivas absorben en mayor cantidad este colorante, ya que en
su estructura tienen mayor proporción de ácido teicoico y las Gram-negativas
absorben el cristal violeta, pero en menor proporción.
 Cuando agregamos el Lugol, este se mezcla con el cristal violeta y contribuye con
su fijación. Estos compuestos se solidifican al interior de la bacteria se debe a que el
Lugol está compuesto de yodo molecular y KI (yoduro de potasio).
 Al agregar el alcohol acetona, elimina el exceso de cristal violeta. Deshidrata la pared
celular, lo que significa que las bacterias van a querer hidratarse. Las bacterias Gram-
positivas al poseer una capa más gruesa de peptidoglicano y un porcentaje mayor de
ácido teicoico van a absorber mayor cantidad de sustancias del medio extracelular.
A diferencia de la bacteria Gram-negativa, necesita menos cantidad para hidratarse.
 La safranina es un colorante de contraste, pone en manifiesto a las Gram-negativas,
y como consecuente adquieren el color rosa o rojizo.

18
Las Gram-positivas adoptan el color violeta y las Gram-negativas se tiñen de rojo, es decir,
está en función a la cantidad de colorante absorbido para poder hidratarse.

4. CONCLUSIONES
- Se escogió la información adecuada y luego de ser sintetizada se plasmó de manera
ordenada, buscando redactar solamente lo esencial; como resultado, la comprensión de:
que es, cómo funciona y la manera de llevar a cabo la Tinción de Gram.
- Con esta técnica se consigue la clasificación de dos grandes grupos, las Gram-positivas
y las Gram-negativas, tomando en cuenta su coloración. La tinción Gram nos indica que
la coloración que adopta tiene su fundamento en la pared celular bacteriana.
- En la práctica de laboratorio, se demostró la efectividad de la tinción de Gram, es
fundamental realizar todo el procedimiento de manera correcta y precisa; entonces, los
resultados son los esperados.

5. ANEXOS

Fotografía 1: Materiales para realizar la práctica de laboratorio.

- Fotografías, fuente propia.

19
 6. REFERENCIAS

Antonio, E. I. (07 de julio de 2015). SlideShare. Recuperado el 23 de Noviembre de 2019,

de Tincion gran: https://es.slideshare.net/edinberto/imforme-de-tincion-gran

Arenas, P. A. (2018). Hans Christian Gram y su tinción (Vol. 16).

Arteaga, J., Farfan, G., & Pinto, L. (Mayo de 2015). pdfs.semanticscholar.org. Obtenido

de IMPORTANCIA DE LAS TINCIÓN DE GRAM PARA LA

IDENTIFICACIÓN DE LA ESCHERICHIA COLI:

https://pdfs.semanticscholar.org/3601/ae0bba4b11042516d67c02fc74982e206a40.

pdf

Gil, M. (s.f de s.f de s.f). Lifeder.com. Recuperado el 23 de Noviembre de 2019, de Azul

de metileno: características, preparación, usos: https://www.lifeder.com/azul-de-

metileno/

Herenz, H. (s.f). Aceite de inmersión. praxisdienst. Recuperado el 23 de Noviembre de

2019, de

https://www.praxisdienst.es/es/Medica/Laboratorio/Dispositivos+laboratorio/Micro

scopios/Aceite+de+inmersion.html

Jiménez, G. A., & Vélez, A. (2012). Tinción de Gram de tejido: alcances y limitaciones.

MEDICINA & LABORATORIO , 18, 555. Obtenido de

https://www.researchgate.net/profile/Guillermo_jimenez_Jimenez/publication/2359

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Luis Esaú López-Jácome, *. M.-D.-C.-P.-G.-C. (Enero-Marzo de 2014). Las tinciones

básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en Discapacidad , Vol.

3(Num. 1).

20
Morales Parra, G. I. (Marzo de 2013). Artículo de revisión. La coloración de gram y su

importancia en el diagnóstico microbiológico. Revista Médica Electrónica Portales

Medicos. Obtenido de https://www.revista-portalesmedicos.com/revista-

medica/coloracion-gram-diagnostico-microbiologico/

Okdiario. (26 de Enero de 2017). Las Bacterias Gram Positivas. Okdiario. Recuperado el

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http://www.revistasbolivianas.org.bo/scielo.php?pid=S2304-

37682014001000005&script=sci_arttext&tlng=en

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