Facultad de Medicina. Escuela de Tecnología Médica. Sede Santiago.

Asignatura de Infectología 2023. Prof TM Marco Silva G.

TALLER N°3
PARED CELULAR Y ESTRUCTURAS BACTERIANAS (TINCIONES).

MÉTODOS DE OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

1.- Observación directa sin tinción o preparación al fresco:
Permite obtener información rápida, para la búsqueda de bacterias y
hongos. Además, informa acerca de la movilidad bacteriana y es un
examen de gran utilidad en la observación de sedimentos urinarios y
secreciones vaginales.
Técnica: Observación al fresco entre lámina (portaobjetos) y laminilla
(cubreobjetos):
a) Colocar una gota de suspensión bacteriana o muestra sobre una
lámina (portaobjetos) y cubrir con una laminilla (cubreobjetos).
b) Observar al microscopio con aumento mayor (40X)
2.- Observación con tinción o coloración: Corresponde a la observación
de bacterias fijadas y es la base para la realización de cualquier proceso
de tinción, permite el estudio en detalle de la morfología de las bacterias.
Una vez fijadas las muestras (con calor por ejemplo) se puede proceder a
efectuar la tinción.

En bacteriología se utilizan fundamentalmente tres tipos de tinciones:

2.1.- Tinción simple: Estas tinciones se denominan simples ya que sólo
permiten definir forma y agrupación. Usan un solo colorante (azul de
metileno, fucsina) y permiten observar muy bien la presencia de
microorganismos intracelulares como Neisseria.
2.2.- Tinciones dobles:
a) Tinción de Gram: Descrita y desarrollada por Christian Gram en 1884,
esta tinción es la más importante en Microbiología, pues permite
diferenciar a las bacterias en base a su afinidad tintorial: Gram
positivas y Gram negativas, morfología; Cocáceas, Bacilos,
Cocobacilos, Vibrios, Espirilos, Espiroquetas y visualizar su
agrupación:

Cocáceas en diplo: Diplococos

Cocáceas en cadena: Streptococcus spp.
Cocáceas en tétrada: Micrococcus spp.
Cocáceas en octógena: Sarcina
Cocáceas en racimo: Staphylococcus spp.

Esta tinción es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier
identificación bacteriana. Tiene gran utilidad clínica al revisar al
microscopio el Gram de la muestra en estudio, ya que orienta sobre las
posibles bacterias que están causando la infección.

Fundamento: El cristal violeta es un colorante que penetra la pared

celular de bacterias Gram positivas y negativas. Posteriormente se

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agrega el lugol, que es un mordiente o fijador y que forma un complejo

con el cristal violeta. Durante el proceso de descoloración con alcohol-
acetona, la gruesa pared de los Gram positivos impide la salida del
colorante manteniendo la coloración violeta. En cambio, por el alto
contenido lipídico de la pared de los Gram negativos, el alcohol-
acetona genera poros, por los cuales, escapa el cristal violeta, la
bacteria se descolora y se tiñe de color rojo con el colorante de
contraste (safranina o fucsina).
b) Tinción de Zielh-Neelsen: Es de gran importancia en Microbiología,
ya que permite evidenciar la presencia de bacilos ácido-alcohol
resistentes (BAAR), como Mycobacterium tuberculosis, agente causal
de la tuberculosis humana. También se utiliza en Parasitología para el
diagnóstico microscópico de Cryptosporidium spp. y Cystoisospora
belli que son coccidios patógenos que producen diarreas agudas.

Fundamento: La fucsina, que es un colorante básico, forma un

complejo con los ácidos micólicos de la pared de las micobacterias.
Este complejo es resistente a la descoloración con alcohol-ácido
(alcohol clorhídrico), permaneciendo de color fucsina a diferencia de las
otras bacterias que se descoloran. El azul de metileno se usa como
tinción de contraste.
TALLER

1. ¿Cuáles son las semejanzas y diferencias en la estructura de la pared

celular entre una bacteria Gram positiva y Gram negativa?

R: Las semejanzas entre las paredes celulares de ambas bacterias son:

- Ambas están compuestas principalmente de peptidoglicano, que es una estructura
compuesta de azúcares y aminoácidos que proporciona resistencia mecánica a la
célula.
- Ambas también contienen otros componentes, como ácidos teicoicos y lípidos, que
son importantes para la estabilidad y la función celular.
- En ambas, la pared celular actúa como una barrera protectora que protege a la célula
de factores estresantes ambientales.
Sin embargo, hay algunas diferencias clave entre las paredes celulares de las
bacterias Gram positivas y Gram negativas:
- Las bacterias Gram positivas tienen una capa gruesa de peptidoglicano que es
mucho más gruesa que la de las bacterias Gram negativas.
- Las bacterias Gram negativas tienen una capa fina de peptidoglicano que se
encuentra entre dos membranas lipídicas (la membrana externa y la membrana
interna). Esta estructura de doble membrana es lo que les da el nombre de "Gram
negativas".
- En las bacterias Gram negativas, la membrana externa contiene lipopolisacáridos
(LPS), que son importantes para la estabilidad y la función celular, pero también
pueden ser tóxicos para los organismos hospederos.
- La diferencia en la estructura de la pared celular es la razón por la cual las bacterias
Gram positivas y Gram negativas responden de manera diferente a los colorantes
de Gram utilizados en la técnica de tinción de Gram.

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2. ¿Qué funciones cumple la pared celular bacteriana?

R: - Proporcionar soporte y protección mecánica: La pared celular mantiene la forma

de la célula y protege su contenido interno contra agresiones físicas y mecánicas.
- Mantener la integridad de la célula: La pared celular es impermeable a muchas
moléculas grandes y protege la célula contra la lisis y la ruptura osmótica causada
por diferencias en la presión osmótica entre el interior y el exterior de la célula.
- Facilitar la adhesión y colonización: La pared celular puede ser modulada por las
bacterias para permitir la adhesión a superficies y la colonización de tejidos, lo que
puede ser importante en la formación de biopelículas y en la patogénesis
bacteriana.
- Participar en la interacción célula-célula: La pared celular es una importante interfaz
de comunicación entre las células bacterianas y puede ser utilizada por las
bacterias para intercambiar información y comunicarse entre sí.
- Protección contra compuestos químicos: La pared celular puede proteger la célula
bacteriana de la acción de enzimas, toxinas, productos químicos y compuestos
antimicrobianos, como los antibióticos.

3. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Gram y cuál de sus reactivos la

hace una tinción diferencial?

R: El fundamento de la tinción de Gram se basa en la diferencia en la estructura de la pared

celular entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias
Gram positivas es gruesa y contiene una gran cantidad de peptidoglicano, lo que hace que retenga
el cristal violeta y se tiñan de color violeta oscuro. En cambio, la pared celular de las bacterias
Gram negativas es más delgada y está compuesta de una capa de peptidoglicano rodeada por
una membrana externa de lípidos que no retiene el cristal violeta, pero sí retiene el colorante de
contraste safranina, lo que las tiñe de color rojo o rosado.
Por lo tanto, el reactivo que hace que la tinción de Gram sea una tinción diferencial es el alcohol o
acetona, ya que elimina el cristal violeta de las bacterias Gram negativas, mientras que no afecta a
las bacterias Gram positivas, permitiendo así la diferenciación de ambos tipos de bacterias.

4. ¿Cómo es la estructura de la pared celular de las micobacterias y que

propiedades le confieren a esta célula? ¿Se tiñen con el método de
Gram?

R: La estructura de la pared celular de las micobacterias incluye varias capas

distintas, que se disponen en orden desde el interior al exterior de la célula. Estas
capas incluyen:

- Membrana citoplásmica: es una bicapa lipídica que rodea el citoplasma de la célula.

- Capa de peptidoglicano: es una capa delgada que rodea la membrana citoplásmica y
contiene una pequeña cantidad de peptidoglicano.
- Capa de ácidos micólicos: es una capa gruesa y compleja que contiene una gran
cantidad de ácidos micólicos y otros lípidos complejos.
- Capa de arabinogalactano: es una capa intermedia de arabinogalactano que conecta
la capa de ácidos micólicos con la capa de peptidoglicano.
- Capa de polisacárido: es una capa de polisacáridos y lípidos que se encuentra en la
superficie externa de la célula y se cree que ayuda en la adherencia y colonización
de los tejidos.

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Las propiedades únicas de la pared celular de las micobacterias incluyen su

resistencia a muchos agentes químicos y antimicrobianos, así como a la
fagocitosis por parte de las células inmunitarias. Esto les permite sobrevivir en el
interior de las células huésped y causa dificultades para tratar infecciones por
micobacterias. Además, la estructura de la pared celular de las micobacterias
también puede contribuir a la capacidad de las micobacterias para formar
biopelículas y adaptarse a diferentes ambientes.

Las micobacterias no se tiñen bien con el método de Gram, ya que la capa de ácidos
micólicos y otros lípidos complejos de la pared celular puede interferir con la
penetración de los tintes utilizados en esta técnica. En cambio, las micobacterias
se tiñen mejor con técnicas de tinción especiales, como la tinción de Ziehl-
Neelsen, que utiliza un colorante rojo fuerte y calor para fijar el colorante en la
pared celular de las micobacterias.

5. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Ziehl Neelsen y para que se

utiliza?

R: Es de gran importancia en Microbiología,ya que permite evidenciar la

presencia de bacilos ácido-alcoholresistentes (BAAR), como Mycobacterium
tuberculosis, agente causal de la tuberculosis humana. También se utiliza en
Parasitología para el diagnóstico microscópico de Cryptosporidium spp. y
Cystoisospora belli que son coccidios patógenos que producen diarreas agudas.

Fundamento: La fucsina, que es un colorante básico, forma un complejo con los

ácidos micólicos de la pared de las micobacterias. Este complejo es resistente a
la descoloración con alcohol-ácido (alcohol clorhídrico), permaneciendo de color
fucsina a diferencia de las otras bacterias que se descoloran. El azul de metileno
se usa como tinción de contraste.

6. ¿Qué son los PAMPs y que funciones cumplen? Mencione 3 PAMPs

como ejemplo. ¿Cuáles son los principales receptores de PAMPs?

R: Los PAMPs (del inglés, Pathogen-Associated Molecular Patterns) son patrones

moleculares presentes en microorganismos, como bacterias, virus, hongos y
parásitos, que son reconocidos por el sistema inmunológico innato como señal de
presencia de un agente patógeno. Los PAMPs se encuentran en moléculas
conservadas en la superficie de los microorganismos, como lipopolisacáridos,
peptidoglicanos, ácidos nucleicos, lipoproteínas y manosas.

Los PAMPs cumplen una función importante en la activación del sistema inmunológico
innato, que es la primera línea de defensa del cuerpo contra los patógenos. Los
PAMPs son reconocidos por receptores específicos del sistema inmunológico
innato, llamados PRRs (del inglés, Pattern Recognition Receptors), que se
encuentran en diferentes tipos de células del cuerpo, incluyendo células
dendríticas, macrófagos y células epiteliales. La unión de los PAMPs a los PRRs
activa una serie de respuestas inmunitarias, como la producción de citocinas
inflamatorias, la fagocitosis de microorganismos y la presentación de antígenos a
las células T.

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Algunos ejemplos de PAMPs incluyen:

Lipopolisacáridos (LPS): Son moléculas presentes en la membrana externa de las
bacterias Gram negativas y se componen de un lípido y un polisacárido. Los LPS
son reconocidos por el receptor Toll-like 4 (TLR4) y son potentes inductores de la
respuesta inflamatoria.
Peptidoglicanos: Son componentes estructurales de la pared celular de las bacterias.
Los peptidoglicanos son reconocidos por varios receptores, incluyendo los
receptores NOD1 y NOD2, y desencadenan respuestas inmunitarias que incluyen
la activación de la inflamación y la producción de citocinas.
Ácidos nucleicos: Los ácidos nucleicos de los microorganismos, como el ADN y el
ARN, pueden ser reconocidos por varios receptores, incluyendo los receptores
Toll-like 3, 7, 8 y 9. Estos receptores activan respuestas inmunitarias que incluyen
la producción de interferones y la activación de células inmunitarias.

Los principales receptores de PAMPs son los PRRs, que incluyen los receptores Toll-
like, los receptores NOD-like y los receptores RIG-like. Estos receptores están
presentes en diferentes tipos de células del sistema inmunológico innato y se unen
específicamente a los PAMPs, lo que desencadena la activación de la respuesta
inmunitaria innata.

7. ¿Cuál es su función y donde se encuentran:

a) Ácidos lipoteicoicos: se encuentran en la pared celular de las bacterias Gram

positivas y tienen funciones en la adhesión a células hospedadoras y en la
activación del sistema inmunitario.
b) Ácidos teicoicos: también se encuentran en la pared celular de las bacterias Gram
positivas y están involucrados en la regulación de la permeabilidad de la
membrana y en la resistencia a ciertos antimicrobianos.
c) Fimbrias: son estructuras filamentosas que se encuentran en la superficie de
algunas bacterias y que les permiten adherirse a células o superficies.
d) Pilus: es similar a la fimbria, pero suele ser más largo y se utiliza para la
transferencia de material genético entre bacterias (conjugación).
e) Cápsula bacteriana: es una capa de polisacáridos que rodea la pared celular de
algunas bacterias y que les confiere protección contra el sistema inmunitario y
otros agentes externos.
f) Porinas: son proteínas que se encuentran en la membrana externa de las bacterias
Gram negativas y que permiten la entrada y salida de moléculas pequeñas.
g) Lípido A: es un componente del lipopolisacárido que se encuentra en la membrana
externa de las bacterias Gram negativas y que es un potente estimulador de la
respuesta inmunitaria.
h) Antígeno O: es un componente del lipopolisacárido de las bacterias Gram negativas
que es reconocido por el sistema inmunitario y que se utiliza en la identificación de
diferentes serotipos bacterianos.
i) Lipoproteína: es una proteína que se encuentra en la membrana celular de las
bacterias y que está involucrada en la estabilidad de la membrana y en la
interacción con el ambiente externo.
j) Plásmidos: son pequeños fragmentos de ADN que se encuentran en algunas
bacterias y que pueden contener genes que confieren ventajas adaptativas como
la resistencia a antibióticos o la capacidad de producir toxinas.
k) Proteína A: es una proteína que se encuentra en la superficie de algunas bacterias
y que se une a la región Fc de las inmunoglobulinas para evitar su acción.
l) Proteína M: es una proteína que se encuentra en la superficie de algunas bacterias y
que interviene en la adhesión a células y en la resistencia al sistema inmunitario .

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8. ¿Qué son las biopelículas o biofilms y cuál es su importancia en salud?

R: Las biopelículas o biofilms son comunidades microbianas complejas que se

adhieren a superficies y se encuentran en ambientes acuosos. Están compuestas
por microorganismos que se unen a una matriz extracelular que ellos mismos
secretan y que puede contener proteínas, polisacáridos y ADN. Las biopelículas
pueden formarse en una amplia variedad de superficies, incluyendo dispositivos
médicos, prótesis, dientes, tuberías y superficies de contacto con alimentos.
La formación de biopelículas es importante en la salud, ya que las bacterias que las
componen pueden ser mucho más resistentes a los agentes antimicrobianos y a
las respuestas inmunitarias que las bacterias en estado libre. Las biopelículas
pueden ser especialmente peligrosas en el contexto médico, ya que pueden
formarse en catéteres, sondas y otros dispositivos médicos, lo que puede llevar a
infecciones crónicas difíciles de tratar. Además, las biopelículas pueden ser
responsables de infecciones asociadas a la atención médica (IAAS), que son una
importante causa de morbimortalidad en todo el mundo.
Las biopelículas también pueden formarse en los dientes, lo que puede llevar a la
caries dental y a la enfermedad periodontal. Además, las biopelículas pueden
formarse en las superficies de los alimentos, lo que puede llevar a la
contaminación microbiana y a la alteración de las propiedades organolépticas de
los alimentos.
En resumen, las biopelículas son comunidades microbianas complejas que pueden
formarse en una amplia variedad de superficies y que pueden ser difíciles de tratar
y erradicar. Por lo tanto, la prevención y el control de las biopelículas son
importantes para la salud pública y la seguridad alimentaria.

9. ¿Qué es la endospora bacteriana, qué microorganismos tienen

capacidad para formarla y cuál es su importancia en salud?

R: La endospora bacteriana es una estructura de resistencia altamente resistente que

se forma en el interior de algunas bacterias. Las endosporas son capaces de
resistir condiciones extremas, como la exposición a altas temperaturas, radiación,
agentes químicos, presión y desecación. Estas estructuras pueden permanecer
latentes durante largos períodos de tiempo hasta que las condiciones adecuadas
permiten que la bacteria se reactive y salga de su estado latente.
Las bacterias que tienen la capacidad de formar endosporas incluyen algunas
especies de Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Sporolactobacillus y otros géneros
bacterianos.
La formación de endosporas es importante para la supervivencia de las bacterias en
condiciones adversas. Las endosporas pueden sobrevivir durante décadas o
incluso siglos en ambientes hostiles, lo que les permite colonizar nuevos lugares y
sobrevivir a los cambios ambientales.
Sin embargo, desde el punto de vista de la salud, las endosporas pueden representar
un problema en algunos casos. Por ejemplo, algunas especies de Clostridium
pueden formar endosporas que producen toxinas potencialmente mortales, como
la toxina botulínica y la toxina tetánica. Estas toxinas pueden causar enfermedades
graves en humanos y animales. Además, algunas endosporas pueden contaminar
alimentos y causar enfermedades transmitidas por alimentos.
En resumen, la formación de endosporas bacterianas es un mecanismo importante
para la supervivencia de algunas bacterias en condiciones adversas. Sin embargo,
en algunos casos, las endosporas pueden representar un riesgo para la salud
humana y animal debido a la capacidad de algunas bacterias para producir toxinas
potencialmente mortales o contaminar los alimentos.

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Bibliografía:

• Murray P., Ken S. Rosenthal, Michael A. Pfaller.(2009).

“Microbiología Médica”. S.A. Elsevier. España. 6ª Ed. Capítulo 2.
Págs: 9 - 21

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