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UNIVERSIDAD POLITCNICA SALESIANA

INGENIERA EN BIOTECNOLOGA DE LOR RR. NN.


MICROBIOLOGA

NOMBRE: Alejandra Medrano


Curso: 3 ero A

TEMA: Diferentes tinciones usadas en la microbiologa para lograr una


identificacin y caracterizacin del mundo procariota.

INRODUCCIN
Las bacterias son organismos unicelulares microscpicos cuyo tamao oscila
generalmente entre 0,5 y 5 m de longitud, debido a estas caractersticas para
poder mirarlas al microscopio adecuadamente y puesto que presentan poco
contraste al ser observadas debido a que son casi incoloras (transparentes), se
requiere a menudo prepararlas y una manera de hacerlo consiste en
someterlas a tinciones (coloraciones) para poderlas visualizar de una mejor
manera y poder identificar detalles de su estructura externa, interna y algunas
funciones fisiolgicas.
Para las tinciones bacterianas se utilizan colorantes, la tincin se da cuando el
colorante entra en contacto con un componente celular, en general, los
colorantes son sales en las que uno de sus iones tiene color y se denomina
cromforo. Los colorantes se clasifican en bsicos, cidos y neutros, segn sea
la carga del grupo cromforo. La nigrosina y la fucsina cida son colorantes
cidos; en tanto el azul de metileno, la fucsina bsica (carbolfucsina), el cristasl
violeta, la safranina, el verde malaquita y el rojo neutro son colorantes bsicos;
algunos colorantes con neutros, como el Giemsa, el Wright y el Leishman
(Rodrguez, et al, 2005).
La composicin qumica de una clula microbiana (as como el pH del material
que la rodea) determina el colorante tomado por la clula. Los colorantes
cidos se combinan con los componentes bsicos, mientras que los
componentes cidos se combinan con los colorantes bsicos, las bacterias
usualmente se tien con colorantes bsicos.
Las tinciones se pueden dividir en: simples, diferenciales y negativas, de
estructuras microbianas y de materias de reserva. La tincin simple consta en
la utilizacin de un solo colorante, en las tinciones diferenciales se emplean por
lo menos dos colorantes, que tien o reaccionan en forma diferente con las
bacterias, segn su estructura fsica o qumica. La tincin negativa en realidad
no tie a las bacterias, sino que tie su entorno, aumentando el contraste para
una mejor visualizacin. Las tinciones para estructuras bacterianas o para

materiales de reserva se basan en la afinidad de la estructura o del material de


reserva por un determinado colorante (Tortora, et al, 2007).

DESARROLLO
Las tinciones requieren previamente la preparacin de un extendido de
bacterias mejor conocido como frotis, el extendido del material se lo realiza
sobre un porta objetos; este se deja secar y luego se fija. En bacteriologa
generalmente la fijacin se la realiza calentando en la llama, lo cual coagula
protenas y adhiere el material a la lmina. En la fijacin qumica se pueden
emplear sustancias que coagulen protenas, como el metanol, aunque lo mejor
son los materiales que se combinan con el material, como la formalina, que
realiza enlaces peptdicos con los grupos aminos (Rodrguez, el al, 2005).
Una vez realizo el frotis se puede proceder a realizar la tincin que se requiera,
de acuerdo, a lo que necesitemos observar en las bacterias.

Tinciones simples
Esta es una tincin directa que utiliza solo un colorante, el cual debe ser rpido
para que la clula bacteriana se tia. Esta tincin permite destacar a la clula
bacteriana por completo para visualizar la morfologa general bsica de una
clula; al utilizar solo un colorante las clulas se tien todas de un solo color.
Los colorantes ms empelados son cristal violeta, azul de metileno y fucsina
fenicada, estos se diferencias en la velocidad y grado en que tien. El azul de
metileno tarde entre 30 y 60 segundos en teir, el cristal violeta es ms reactivo
y usualmente tarde solo unos 10 segundos, la fucsina fenicada es an ms
rpida, generalmente requiere unos 5 segundos (Ortega, UTN, 2009).
Procedimiento
El colorante se aplica al frotis durante un tiempo determinado y luego se lava; a
continuacin el portaobjetos se seca y se examina. En ocasiones se agrega
una sustancia qumica a la solucin para intensificar su coloracin; el aditivo se
denomina mordiente cuya funcin es aumentar la afinidad de una manera
biolgica por un colorante; otra es cubrir una estructura celular (como un
flagelo) para darle mayor espesor y facilitar la observacin despus de teido
(Tortora, et al, 2007).

Tinciones diferenciales
A diferencia de las tinciones simples, las tinciones diferenciales reaccionan de
distinta manera dependiendo la clase de bacterias, por lo tanto pueden ser
empleadas para establecer una distincin entre ellas. Estas tcnicas utilizan
ms de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tincin.

Los colorantes ms utilizados son el azul de metileno, cristal violeta, safranina,


son catinicos y se combinan fuertemente con componentes celulares
cargados negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacaridos cidos
(las envueltas externas de los microorganismos estn por lo general cargadas
negativamente) (Ortega, UTN, 2009).
Las tinciones diferenciales utilizadas con ms frecuencia para las bacterias son
las tinciones de Gram y de cido-alcohol resistencia.

Tincin Gram
Fue desarrollada por el cientfico dans Hans Christian Gram en 1884. Es uno
de los procedimientos de tincin ms tiles porque permite clasificar las
bacterias en dos grandes grupos: grampositias y gramnegativas.
Los principios de la tincin de Gram estn basados en las caractersticas de la
pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a
cada microorganismo. La pared celular de las bacterias gramnegativas est
constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular
externa, mientras que las bacterias grampositivas poseen una pared celular
gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular
externa as pues, la composicin qumica y el contenido de peptidoglicano en la
pared celular de las bacterias gramnegativas y grampositivas explica y
determina las caractersticas tintoriales (Lpez, et al, 2014).
Procedimiento
El frotis se cubre con colorante violeta bsico, por lo general cristal violeta, se
lo denomina colorante primario, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de
la pared celular bacteriana. Despus de un breve lapso se escurre el colorante
violeta, se lava el extendido, se lo cubre con lugol (yodo), un mordiente e
impide la salida del cristal violeta para la formacin del complejo cristal violetayodo que satura los espacios de la pared. Cuando se lava el yodo, tanto las
bacterias gramnegativas como las grampositivas se tornaran de violeta oscuro
o prpura. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de
alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared celular y cierra los poros de la
misma tambin destruye la membrana externa de las bacterias gramnegativas.
Las bacterias grampositivas al tener un gran contenido de peptidoglicano
retienen con mayor fuerza este complejo. Por ltimo se adiciona safranina la
funciona como colorante secundario sirve para teir las bacterias que no
pudieron contener cristal violeta-yodo. Luego se vuelve a lavar el extendido, se
lo seca y se lo examina con el microscopio (Lpez, et al, 2014).
Las bacterias Gram positivas se observan de color azul obscuro a morado,
mientras que las Gram negativas se observan de color rosa a rojo y as
bacterias Gram positivas se observan de color azul obscuro a morado, mientras
que las Gram negativas se observan de color rosa a rojo

Tincin cido-alcohol resistencia (Zehiel-Neelsen)


Ilustracin 1Fotomicrografa donde se observa bacterias Grampositivas en
hemocultivo (derecha) y Gramnegativas (izquierda) en hemocultivo
(aumentado 100x).

Esta es otra tincin diferencial importante, que diferencia bacterias en grupos


distintivos, que se fija de modo firme solo a bacterias que poseen ceras en la
pared celular, que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con
alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se
denominan cido-alcohol resistentes, permitiendo diferenciar a las bacterias en
dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la decoloracin con alcoholcido y aquellos que no lo son (Tortora, et al, 2007).
Esta tincin es muy utilizada para identificar a las bacterias del gnero
Mycobacterium, que comprende dos patgenos importantes: Mycobacterium
tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis, y Mycobacterium Leprae, el
agente causal de la lepra. Tambin se utiliza para identificar cepas patgenas
de gnero Nocardia (Tortora, et al, 2007).
Procedimiento
Se aplica el colorante el colorante rojo carbolfucsina al frotis y se calienta
suavemente el portaobjetos durante varios minutos. El calentamiento aumenta
la penetracin y la retencin del colorante. Luego se enfra el portaobjeto y se
lo lava con agua. A continuacin se aplica al extendido cido-alcohol, un
decolorante que elimina el color roja de las bacterias que no son cido-alcohol
resistentes. Las bacterias cido-alcohol resistentes retienen el color rojo porque
la corbolfucsina es ms soluble en los lpido de la pared celular que en los
cido-alcohol resistentes. En las bacterias que no son cido-alcohol resistentes
las paredes carecen de componentes lipdicos y la carbolfucsina se elimina con
facilidad durante la decoloracin, lo que deja a las clulas incoloras. Luego el
frotis se colorea con azul de metileno, que acta como colorante de contraste.
Las bacterias que no son cido-alcohol resistentes aparecen azules despus
de la aplicacin del colorante de contraste (Lpez, et al, 2014).

Ilustracin 2 Fotomicrografa de una muestra de


expectoracin donde se observan bacilos de color rojo
fucsia. (Micobacteryum spp) (aumentado 100x)

Tinciones especiales
Las tinciones especiales se utilizan para colorear y aislar partes especficas de
bacterias, como endosporas, flagelos y detectar la presencia de cpsulas, en
ocasiones se utiliza como mtodo de diagnstico.

Tincin para endosporas (esporas)


Koneman, et al (2006). Las endosporas son estructuras esfricas u ovaladas
formadas dentro de ciertas especies bacterianas que representan un estado
latente o de reposo en el ciclo del crecimiento del microorganismo (p. 183).
Estas endosporas se forman dentro de la clula y protege a la bacteria de
condiciones medioambientales adversas. Aunque las endosporas son
relativamente inusuales en clulas bacterianas se pueden presentar en
especies de los gneros Clostridium y Bacillus. Las endosporas no se tien con
los mtodos comunes como la tincin simple o la tincin Gram, debido a que
los colorantes no penetran sus paredes, la envuelta de las endosporas es ms
compleja e impermeable que la envuelta de las clulas vegetativas, en las que
se forma (Universidad de Granada, 2012).
La tincin ms utilizada para este fin es la tincin de Schaeffer-Fulton para
endosporas, la cual se realiza de la siguiente manera.
Procedimiento
Se aplica el colorante primario verde de malaquita al frotis con calor y se lo
calienta hasta la emisin de vapores durante alrededor de 5 minutos. El calor
ayuda a que el colorante atraviese la pared de la endospora. Luego se lava el
preparado con abundante agua durante unos 30 segundos para poder eliminar
el verde malaquita de todas las partes de la clula menos de la endosporas. A
continuacin se aplica sobre el extendido safranina, un colorante de contraste,
para teir las partes celulares distintas de las endosporas. En un extendido
preparado adecuadamente se visualizan endosporas teidas de color verde
dentro de clulas rojas o rosadas (Tortora, et al, 2007).
El verde de malaquita es un colorante dbilmente bsico (tiene una carga
positiva dbil) y por tanto, se une dbilmente a la bacteria. Penetra en las
clulas vegetativas. Cuando se calienta la preparacin tambin penetra las
endosporas.

Ilustracin 3Esporas teidas de verde y clulas


vegetativas teidas de rosa. (Bacillus cereus)
(aumentado en 100x)

Tincin para flagelos


Los flagelos bacterianos son apndices para locomocin y en algunos casos
para adhesin como en Campylobacter, son demasiado pequeos como para
ser vistos en microscopio sin tincin. Existe un procedimiento complicado que
consta en la utilizacin de un mordiente y el colorante carbolfucsina para
aumentar los dimetros de los flagelos hasta que se tornen visibles (Rodrguez,
et al, 2005).
Un mtodo muy aplicado es el de Leifson es utilizada en laboratorios pero no
de rutina, se emplea fucsina bsica en alcohol etlico solucin A, cido tnico
en agua destilada solucin B, cloruro de sodio en agua destilada solucin C.
para preparar el colorante de Leifson se mezclan cantidades iguales de la
solucin A, B y C para fijar el extendido no se debe emplear la flama, debido a
que esta puede destruir los flagelos, se debe secar al aire. Humedecer el
extendido con el colorante de Leifson y dejar reposar a temperatura ambiente
durante unos 10 minutos y por ltimo lavar con abundante agua. Los flagelos
se tien bien de color rojo en aquellas clulas que no presentan flagelos
extremadamente delicados (Ortega, UTN, 2009).
La clula bacteriana puede tener uno o ms flagelos dispuestos en distinta
manera y en base a eso se clasifican en: Polar: flagelo en un extremo, lofotrico:
penacho de flagelos en un extremo, anfitrico: flagelos en ambos extremos y
peritrico: flagelos alrededor de toda la clula.

Ilustracin 4 Los flagelos aparecen como extensiones ondulantes de los extremos de la clula
bacteriana Spirillum volutans. En relacin con el cuerpo de la clula los flagelos con mucho ms
gruesos de lo normal por la acumulacin de capas de colorante por el tratamiento de la muestra
con el mordiente

Tincin negativa
Este mtodo es ideal para para observar inclusiones refrctiles que no se tien
fcilmente, tales como granulos de azufre, cido poli--hidroxibutrico o
cpsulas bacterianas. La tincin de cpsulas es ms difcil que otras tinciones

debido a que los materiales capsulares son hidrosolubles y pueden


desprenderse o eliminarse durante los lavados rigurosos.
Procedimiento
Para demostrar la presencia de cpsulas se puede mezclar las bacterias en
una solucin que contenga una sustancia coloidal fina de partculas oloreadas,
por lo general se emplea tinta china o nigrosina, que proporcione un fondo que
contraste, las partculas de carbn no penetran la clula bacteriana, sino que
tien su entorno y la bacteria aparecer como un cuerpo refrctil sin teir. Para
poder observar a las bacterias se emplea una tincin simple con un colorante
que puede ser la safranina. Debido a su composicin qumica las cpsulas no
aceptan la mayora de los colorantes biolgicos como la safranina, y as
aparecen como halos que rodean cada clula bacteriana teida (Rodrguez, et
al, 2005).

Ilustracin 5Las cpsulas de estas bacterias


(Klebsiella pneumoniae) se ven como reas
claras alrededor de las clulas teidas.

Conclusiones
Las tinciones son procedimientos tiles para una correcta observacin de
bacterias al microscopio, permiten observar estructuras internas, externas
incluso funciones, lo cual brinda la oportunidad de poder describir, caracterizar,
distinguir entre bacterias para poder identificarlas en base a un parmetro.
Segn las estructuras de inters que deseemos observar o la morfologa bsica
en general de la bacteria se emplean diferentes tipos de tinciones, que se
desarrollan especficamente a los requerimientos deseados.
Existen tinciones como: las simples en las cuales se observa la morfologa
bsica, diferenciales que permiten establecer distinciones y especiales con las
cuales se pueden observar estructuras especficas.
En general las tinciones son herramientas de ayuda para poder trabajar con
bacterias conociendo su estructura y por lo tanto caractersticas.
BIBLIOGRAFA

Rodrguez, E; Gamboa, M; Hernndez, F; Garca, J. 2005. Bacteriologa


general: Principios y Prcticas de Laboratorio. Editorial Universidad de
Costa Rica. Costa Rica.
Tortora, G; Funke, B; Case, C. 2007. Microbiologa. Editorial Medicina
Panamericana, Buenos Aires. Argentina.
Koneman, E. et al. 2006. Koneman diagnstico microbiolgico. Editorial Mdica
Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
Ortega, M. 2009. Tincin y observacin de microorganismos. Universidad
Tcnica Nacional. Santa Fe. Argentina. [en lnea]
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologi
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Lpes, L. et al. Las tinciones bsicas en el laboratorio de microbiologa.
Medigrafic. Mxico. [en lnea]
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
Universidad de Granada. 2012. Prctica online de Microbiologa para
farmacuticos. Granada. Espaa. [en lnea].
http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/tinciones/endosporas