PRE – INFORME Preparación de muestras y Coloraciones

Objetivo General
 Reconocer los diferentes tipos de muestras y técnicas que se pueden aplicar para la
observación en el estudio microbiológico de organismos y tejidos celulares de interés.

Objetivos Particulares
 Comprender la aplicación y funcionamiento de los distintos tipos de colorantes para el
estudio de muestras particulares, pudiendo diferenciar las coloraciones simples y las
coloraciones compuestas.
 Preparar distintas muestras en las que se usen las técnicas de preparación y fijación
(química o física) aprendidas.

MARCO TEÓRICO

El proceso histológico empieza con la obtención de la muestra a observar, esta puede ser
animal o vegetal, en el primer caso se puede usar o extraer una parte del tejido, pero también
hay formas de realizar fijaciones en el animal completo para posteriormente hacer un corte
de la zona de interés. Para la observación de muestras existen diferentes tipos de preparación
de las mismas, así como coloraciones específicas o preferenciales según lo que se quiera
analizar, la técnica y método elegido dependerá del resultado final que se desee.

1. Tipos de muestras

1.1 Muestras Frescas

También se puede denominar montaje directo húmedo, en este caso, la muestra que se desee
observar se pone de manera directa sobre el portaobjetos y se dispone el cubreobjetos sobre
la superficie de la muestra. Una recomendación es en el caso que la muestra sea muy espesa,
se puede diluir con solución salina para poder tener mejores imágenes de los elementos que
la componen (Corrales y Caicedo, 2020).

1.2 Muestras Fijas

La fijación de muestras, es el procedimiento en el que se fija en una posición la estructura
tanto interna como externa del microorganismo a estudiar. No es un método de estudio in
vivo, los fijadores tienen como uno de sus objetivos evitar la autolisis y preservar las
cualidades del tejido hasta dónde sea posible desde el momento de la obtención de la
muestra, hasta su observación. Se pueden dividir en dos categorías: físicos y químicos
(Megías, 2019)

- Fijadores físicos: usan el frío y el calor, ya sea con una congelación rápida del tejido
o la exposición a una alta temperatura.

- Fijadores químicos: se basan en soluciones acuosas con moléculas fijadoras que

forman enlaces químicos con las moléculas de la muestra evitando su degradación,
los dos más usados son la inmersión donde la muestra se sumerge en la solución
 fijadora y la perfusión donde la aplicación del fijador se da a través del sistema
sanguíneo de un animal o de una estructura para analizar.

1.3 Muestras Coloreadas

Las muestras coloreadas o con tinción, se definen como aquellas en las que se usan
colorantes, ya sean naturales (principalmente con uso histológico) o sintéticos (la mayoría de
los usados para estudiar bacterias son sintéticos). Los colorantes poseen grupos cromóforos,
los cuales son grupos con enlaces dobles conjugados que otorgan color y pueden reaccionar
y crear enlaces iónicos o covalentes con las células. Por lo general se tiñe el tejido de interés,
pero a veces se realizan tinciones negativas, en las que se colorea el fondo, no el objetivo,
usando colorantes como la tinta china y la nigrosina (Contreras, 2013)

2. Tipos de coloraciones

2.1 Coloración simple

Podemos definir la coloración simple como el método en el que tomamos una muestra de
interés, y la teñimos con un solo colorante (por esto es simple). Ya sea que usemos azul de
metileno, safranina o cristal violeta, nuestro microorganismo de interés tendrá entonces una
sola tonalidad, ya sea azul, rojo o violeta respectivamente basándose en la composición
diferencial que tienen las células respecto al medio en el que se observen y por lo cual su
comportamiento frente al tipo de colorante también lo será. Con la coloración simple
podemos diferenciar la morfología, agrupación y tamaño celular (Contreras, 2013).

2.2 Coloración compuesta o diferencial

En este tipo de tinciones se utiliza más de un colorante de manera combinada, donde los
elementos celulares tenidos se van a diferenciar según el tipo de colorante que se fije según
la estructura que presente, pues no todas las células tienen la misma composición química,
gracias a esto se logra hacer una clasificación entre los microorganismos. Las más comunes
son la tinción de Gram, que se explicará más adelante y la tinción de Ziehl-Neelsen
(Corrales y Caicedo, 2020).

3. Ejemplo de cada tipo de coloración (simple y compuesta)

3.1 Coloración simple - Azul de metileno

Es una coloración simple ya que no se utiliza otro colorante además del azul de metileno,
generalmente se usa para determinar la morfología de bacterias. Su mecanismo de acción se
debe a que en su estructura molecular presenta como centro activo un nitrógeno cargado
positivamente presentando atracción hacia aniones como los grupos fosfatos presentes en las
estructuras bacterianas, dicha asociación permite la observación de estructuras teñidas de
azul de diferente intensidad (Corrales y Caicedo, 2020).

3.2 Coloración compuesta - Tinción de Gram

Esta coloración es útil en el estudio y observación de bacterias, las cuales se podrán
diferenciar según su coloración, forma y agrupamiento; esta es una técnica desarrollada por
Christian Gram en 1884, donde gracias a la composición de la pared bacteriana pudo hacer
una clasificación de bacterias gram negativas, que tienen una capa fina de peptidoglicanos y
presencia de membrana celular externa y gram positivas que tienen una capa gruesa con
mayor cantidad de peptidoglicanos y no tiene membrana celular externa, estas características
determinan el tipo de tinción obtenida con la aplicación de la técnica de Gram, facilitando
así su diferenciación.

Esta tinción es compuesta ya que se requieren de diferentes colorantes y reactivos para la

obtención de la imagen deseada, el procedimiento contiene los siguientes componentes como
lo explica Corrales y Caicedo (2020):

 Violeta de gram: El cristal violeta será el colorante primario, este tiene gran afinidad
por los peptidoglicanos presentes en la pared bacteriana adhiriéndose a estos y
brindando una tonalidad violeta oscura gracias a los grupos metilo de su estructura
responsables en gran medida de la formación del complejo con el yodo del lugol
posteriormente.

 Lugol de gram: Es una mezcla homogénea de yoduro de potasio y yodo, este último
reaccionará en la tinción en forma de iones; se utiliza en la preparación como
mordiente, es decir que impedirá la salida del violeta de gram gracias a la formación
de un complejo entre el cristal violeta con el yodo.

 Solución de alcohol-acetona: esta solución tiene dos funciones fundamentales

dentro de la tinción de Gram, por una parte causa la deshidratación de la pared
bacteriana al capturar las moléculas de agua y promoviendo así el cierre de sus poros
y por otro lado disuelve la membrana externa de las bacterias gram negativas, que al
estar constituidas principalmente de elementos lipídicos será soluble en solventes
orgánicos como la solución alcohol-acetona, teniendo un efecto decolorante al
promover la salida del colorante cristal violeta.

 Fucsina de gram: La fucsia será el colorante secundario en la preparación, jugando

un papel de colorante de contratinción, pues va a dar color a aquellas bacterias que
no retuvieron en su estructura el complejo cristal violeta-yodo, es decir, que hará
visibles a las bacterias Gram negativas por la formación de un complejo coloreado
rojo.

Al final y en la práctica de laboratorio se podrán diferenciar las bacterias gram positivas al

adquirir una tonalidad violeta y las gram negativas al adquirir una tonalidad magenta.

Bibliografía
- Contreras Garrido, A. (2013). Preparación y tinción de muestras. Universidad de
Valencia.
- Corrales Ramírez, L. C., & Caycedo Lozano, L. (2020). Principios físicoquímicos de los
colorantes utilizados en microbiología Principios físicoquímicos de los colorantes. Nova,
18(33). https://doi.org/10.22490/24629448.3701
- Megías M, Molist P, Pombal MA. (2019). Atlas de histología vegetal y animal. Técnicas
histológicas. Recuperado de: http://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/1-introduccion.php