BENEMÉRITA UNIVERSIDAD

AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
NRC: 21601

REPORTE PRÁCTICA “TÉCNICAS DE TINCIÓN

DIFERENCIALES”

ASHLEY ZEMPOALTECA TELLEZ

EDGAR TONIX VÉLEZ
Introducción

Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el

laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más
de un siglo han ayudado a resolver problemas de etiología microbiana. Hay una
gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los
diferentes agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos.
Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a
las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram
positivas. En microbiología clínica resulta de gran utilidad, ya que a partir de
muestras clínicas directas provenientes de sitios estériles se puede saber de manera
rápida las características de la muestra y hacer una diferencia de los potenciales
microorganismos causantes de una infección.
Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la
pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a
cada microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas está
constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa,
mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa
constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa;
así pues, la composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared
celular de las bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las
características tintoriales. La tinción de Gram se basa en colocar como colorante
primario cristal violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared
bacteriana. Posteriormente, se coloca Lugol, el cual sirve como mordiente e impide
la salida del cristal violeta que satura los espacios del peptidoglicano de la pared
bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual
deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la
membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble
a la acción de solventes orgánicos.
Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano,
retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram negativas no lo
pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se coloca
safranina, la cual funciona como un colorante secundario y sirve para teñir las
bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta.

Objetivo.
• Aprender el fundamento y la técnica de la tinción de Gram para determinar
la morfología microscópica de diferentes cepas bacterianas.

Desarrollo Técnica de Tinción de Gram.

1. Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa
bacteriológica una
pequeña muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre
un
portaobjetos. Extender esta suspensión y dejar secar.
2. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero.
3. Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el
colorante y
lavar con chorro suave de agua corriente.
4. Cubrir el frote con lugol, dejarlo actuar por un minuto. Escurrir y lavar.
5. Decolorar el frote con alcohol-acetona, de 5-30 segundos. Escurrir y lavar.
6. Cubrir el frote con safranina y dejarlo actuar por 30 segundos. Escurrir y lavar.
7. Dejar secar al aire.
8. Observar el frote con objetivo de inmersión.
9. Determinar la morfología microscópica y la respuesta a la Tinción de Gram de
cada
cepa empleada.

Resultados.
En esta muestra se presentan microorganismos en forma de bacilos, pero se puede apreciar que
están en forma de “fila”, por lo cual podemos deducir que son Estreptobacilos. Presentan una
coloración morada, así que son Estreptobacilos Gram (+).

En la segunda imagen podemos ver un conjunto de cocos, los cuales están en forma de racimo, así
que son Sthapylococcus y presentan una coloración morada, por lo cual son Gram (+).
Cuestionario.
1. ¿Qué es un frotis y para que se utiliza?
Un frotis consiste en la extensión de una muestra de fluido corporal (humano o
animal) sobre un portaobjeto y es utiliza para observar las características
morfológicas de las células de la muestra a estudiar.
2. ¿Qué es un colorante? ¿Cómo está constituido? ¿Cómo es que se combina con
los diferentes compuestos celulares?
Sustancias que se emplean para dar color a las estructuras que componen los
tejidos animales y vegetales, es decir, para teñir las células, y sus compartimentos,
y la matriz extracelular.
Químicamente, el colorante está constituido de un componente cromóforo y un
auxocromo. El cromóforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene
una absorción característica en la región ultravioleta o visible; dicho de otra forma,
es la capacidad que tiene la molécula para que sus electrones absorban energía
o luz visible, se exciten y emitan diversos colores de acuerdo con la longitud de
emitida como resultado del cambio en el nivel energético.
Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan
con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas
proteínas.
3. ¿Qué factores intervienen para que los colorantes se combinen con los
componentes celulares?
• Pureza del colorante.
• Concentración del colorante
• pH
• Conservación del colorante
• Técnica Empleada
• Temperatura
• Cantidad de la muestra.
• Realizar correctamente el frotis.
• Soluciones mordientes Tiempos de Tinción
• Composición del medio.
4. ¿Qué es un mordente? Menciona 3 ejemplos.
Los mordientes intensifican la tinción porque aumentan la afinidad de la célula por
el colorante. Se usa cuando la afinidad química entre el componente celular y el
colorante es baja; también se pueden utilizar para producir un engrosamiento de
ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su delgadez
no podrían ser visualizados de otra forma.
1. Yodo.
2. Alcohol etílico.
3. Alumbre potásico.
5. ¿Cuál es el objetivo de calentar en la tinción de esporas?
La espora es una estructura deshidratada que contiene un 15 % de calcio y ácido
dipicolínico. Por ello, la mayoría de las técnicas de coloración de esporas se basan
en la aplicación de calor para que el colorante pueda penetrar la gruesa
estructura. Una vez que la espora se tiñe, esta no puede eliminar al colorante. En la
técnica de Shaeffer-Fulton el verde de malaquita entra a las células vegetativas y,
al aplicar el calor, penetra en la endospora y también en las exosporas.
Conclusión.
Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología como la tinción de Gram
ya que juegan un papel importante al permitir saber de manera rápida las
características de la muestra y hacer una diferencia de los potenciales
microorganismos causantes de una infección. Así que se puede decir que las
tinciones son herramientas elementales, vigentes y de uso universal que son una
parte importante para la determinación de un agente microscópico, algo
fundamental en esta área que se cursa.