INTRODUCCIÓN

Los microorganismos, si bien se pueden observar para su estudio gracias a la

microscopía óptica de campo claro, es necesario mejorar su visualización por medio de
la coloración del microorganismo (tinción positiva) o del medio (tinción negativa). Esto
requiere, por tanto, el uso de colorantes que, por medio de cargas, presenten afinidad
por ciertas estructuras del microorganismo.
Según el interés de estudio será el tipo de tinción a emplear. Es decir, para la
observación únicamente de la forma, tamaño y agrupación de los microorganismos,
bastaría con una tinción simple (uso de un único colorante ya que no hay necesidad de
ver una diferenciación entre estos). O para observar adicionalmente una diferenciación
en el uso adicional de un mordiente (que permita la fijación del color debido a lograr un
aumento de afinidad), decolorantes específicos y colorantes adicionales de contaste.
Un ejemplo de tinción diferencial es la Coloración Gram. Esta tinción, la cual es
la más utilizada, además de permitir observar la forma, tamaño y agrupación celular,
divide a las bacterias según su pared en dos grandes grupos: Gram positiva y Gram
negativa.
La tinción se basa en la afinidad entre la muestra biológica y el colorante,
existiendo colorantes de naturaleza ácida para teñir constituyentes celulares de cargas
positivas (como lo son las proteínas) y colorantes de naturaleza básica para teñir ácidos
nucleicos (bacterias poseen gran cantidad de ribosomas en su protoplasma). Adicional
a este fundamento básico, en una tinción diferencial, como lo es la coloración Gram,
existe el fundamento por el cual se permite la diferenciación. Este se basa en las
diferencias estructurales de las paredes bacterianas que determinan la retención o el
escape del complejo cristal violeta/yodo. Las bacterias Gram positivas poseen en su
pared un peptidoglucano más grueso además que el polímero presenta gran número de
uniones cruzadas dando lugar a una malla pequeña mientras que, en bacterias Gram
negativas, su pared es más delgada y presenta pocos entrecruzamientos teniendo un
tamiz grande. Estas características hacen que el grupo de Gram positivas, tras la
decoloración, sean las únicas que retengan el complejo coloreado y permanezcan de
color violeta, mientras que, las Gran negativas, queden incoloras hasta la adición del
colorante de contraste rojo para adquirir un color rosado.
Esta práctica tiene como objetivo, además de la identificación de la morfología y
disposición microbiana, conocer lo necesario para realizar una tinción simple y
diferencial y en la técnica para una coloración Gram. Técnica muy usada y muchas veces
la primera prueba a realizar con el fin de determinar el grupo al cual pertenece la
bacteria (Gram positivo o Gram negativo).
1. MARCO TEÓRICO

La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su

entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de
tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el
contraste.

En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de

microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación,
procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con
diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por calor es la
más utilizada para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el
portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una llama de
un mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de los
microorganismos, pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes como
etanol, formaldehido y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para preservar las
estructuras celulares.

Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tinción positiva es la más frecuente,

en ella un colorante se une a ciertas estructuras microbianas. Todos los colorantes
utilizados en microbiología tienen en común la presencia de grupos cromóforos, grupos
con dobles enlaces conjugados que son los responsables del color mediante la unión a
estructuras celulares por enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos, los que establecen
enlaces iónicos son los más frecuentes. Entre los colorantes que se unen por enlaces
covalentes destaca el reactivo de Schiff, utilizado para la tinción de DNA, donde el
colorante se une a la desoxi-ribosa. Por otra parte, en la tinción negativa se utilizan
compuestos que no penetran en las células, sino que impregnan el medio circundante.
Los microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro. No se trata de una
tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con cromóforos, ni se lleva a
cabo ninguna reacción entre estructuras celulares y los colorantes. En este caso el frotis
se hace con una gota de una solución de nigrosina o tinta china, ambos son productos
particulados, insolubles, que formarán una película opaca a la luz. En este tipo de tinción
se prescinde de la fijación por calor, se deja secar la preparación y se observan los
microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.
Tipos de tinción:

a) Tinción simple
La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma,
tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de

serFigura 1a. Tinción simple con cristal

un método muy sencillo y rápido (Fig. 1 a y b). Figura 2b. Tinción simple con safranina
violeta de Staphylococcus aureus. de Micrococcus luteus. Microscopio
Microscopio óptico de campo claro (100x). óptico de campo claro (100x).
b) Tinción diferencial

Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en la

aplicación de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso
intermedio que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o
entre determinadas células dentro de una población. La diferenciación puede ser
provocada por un agente químico o físico, permitiendo observar dos tipos de respuestas
diferentes a la tinción en una misma muestra. Las dos tinciones diferenciales más
utilizadas en bacteriología son la tinción de gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia.

Colorantes

Es una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera. De acuerdo con
su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extraídos de plantas
o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y
manipulados en el laboratorio. Químicamente, el colorante está constituido de un
componente cromóforo y un auxócromo.
 Fig.2.Los diferentes colorantes

Tinción diferencial de Gram

Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la
desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias
pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los
términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino
simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las

diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula
bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis
osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico.

Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano.La

pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada,
únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta
de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula
gram-negativa es peptidoglicano.

Descripción de la tinción de GRAM:

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de
cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para
quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las grampositivas
como las gramnegativas, están teñidas de azul.

El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El

ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra
en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo
tanto las células grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma
situación.

Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona,

sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos
(grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La
diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la
decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de
bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve
la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana
citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es
incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células
grampositivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano
y menos lípido), no son permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal
violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las
células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras.

Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de

contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina
básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas,
mientras que las grampositivas permanecen azules.
 Bacillus anthracis (Gram positivo) Pseudomonas aeruginosa (Gram
negativo)

Comparación de las envolturas celulares bacterianas

1. Membrana
citoplasmática

2. Peptidoglicano

3. Fosfolípidos

4. Proteínas

5. Ácido lipoteicoico

6. Espacio periplasmático

7. Membrana externa

8. Lipoproteína

9. Lipopolisacáridos

10. Porinas

Bacteria Gram-positiva
2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
2.1. Coloración Gram

Previamente a la coloración se hizo la preparación de un frotis, el cual consistió

en que, con un asa en anillo esterilizada por exposición a la llama del mechero, se
extendió una pequeña muestra sobre un portaobjetos (limpio y desengrasado) el cual
se dejó secar al aire para una posterior fijación por calor el cual se consiguió con una
suave exposición sobre la llama. La fijación fue hecha con el fin de evitar el arrastre de
los microorganismos por la aplicación de las soluciones y lavados posteriores.
Una vez teniendo el frotis ya fijado se aplicó el colorante cristal violeta dejándolo
actuar por un minuto. Un posterior lavado cuidadoso con agua corriente seguido de la
aplicación de lugol (yodo que actuaría como mordiente) Se dejó actuar por un intervalo
de un minuto volviéndose entonces, a lavar con agua. Se continuó el procedimiento con
la adición de alcohol-acetona (para decolorar) durante diez segundos y se lavó
posteriormente tres veces nuevamente con agua. Un último colorante fue añadido,
safranina, y se lo dejó actuar medio minuto para finalizar con el último lavado con agua.
Se dejó secar para luego observar al microscopio.
Se realizó esta coloración Gram para las siguientes muestras: Bacillus sp.,
Pseudomona sp., Saccharomyces sp (muestras provenientes de caldo y agar) y
Escherichia coli (proveniente de medio agar).

3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
3.1. Escherichia coli
Esta bacteria entérica que hábitat el intestino grueso reacciona negativamente
con la tinción, es decir, no retiene el complejo de fucsina/yodo perdiendo la
coloración azul-violeta.
Su pared celular es delgada y pobre en peptidoglucano y cuenta con una
segunda membrana rica en lipoproteínas que es soluble en solventes orgánicos
perdiéndola con la mezcla acetona/alcohol.
Con la adición del colorante contrastante (safranina) este organismo se tiñe de
rosa.
Figura N° Colonia E. coli
De forma como una barra con
extremos curvados (Bacilos) y
de color rosa, indicando que
son Gram -. Aumento 100x
3.2. Saccharomyces sp
Las levaduras son hongos no bacterias, y la composición de su pared celular es
principalmente de quitina, sin embargo, pueden reaccionar con la tinción de
Gram, como se ve en la siguiente figura, en casi su totalidad, la levadura logra
retener el complejo fucsina/yodo al igual que las gram positivas.
Figura N° Levaduras de
Saccharomyces, de forma
redonda y color azul violeta,
actuando como gram positivas.

3.3. Bacillus sp
Contrario a E. coli, estas bacterias reaccionan positivamente a la tinción
reteniendo el complejo fucsina/yodo, indicando una mayor cantidad de
peptidoglucano constituyendo capas en la pared celular y presentando el color
azul violeta de las gram positivas.
Algunas bacterias de este género presentan endoesporas, que pueden ser
indicadoras de que estos organismos fueron sometidos a condiciones de estrés.

Figura N° Basillus sp.

Bacterias con forma de bacilo,
de ahí su nombre, y de color
azul violeta (gram +). Aumento
100x
 3.4. Pseudomona sp
Al igual que las bacterias E. coli, este organismo reacciona de manera negativa
a la tinción (gram negativa) y de forma de barra como un bacilo.

Figura N° Pseudomonas teñidas

de rosa y forma de bacilo.
Aumento 100 x.

4. CONCLUSIONES
 La E. coli y Pseudomona sp son bacterias que reaccionan negativamente sin
retener perdiendo el complejo fucsina/yodo. Por lo tanto, son bacterias
gram negativas que se tiñen de color del colorante contraste. Además,
presentan forma de bacilo.
 Bacillus sp es un grupo de bacterias que reaccionan positivamente
reteniendo el complejo fucsina/yodo y conservando el color azul-violeta.,
por lo tanto, bacterias gram positivas.
 Saccharomyces sp. A pesar de ser un hongo y tener una pared celular
compuesta de otras biomoléculas retiene el colorante debido a la
composición de esta, por lo tanto, se tiñe de azul violeta como una gram
positiva.
5. RECOMENDACIONES:
 Primero debemos rotular las láminas y hacer una división en cada una, para
quepa 2 muestras, y así poder diferenciarlas.
 Evitar que los microorganismos presentes en el ambiente (piel, pelo, aire, ropa,
etc.) contaminen nuestras muestras.
 Al momento de sembrar en nuestras placas estar cerca del mechero para tener
un ambiente esteril y no haya contaminación en nuestro medio de cultivo.
 No someter demasiado las muestras al fuego de la llama ya que podrían
quemarse y empeorar la visualización de resultados.
 Seguir el uso de las coloraciones en orden para la correcta tinción de las muestras
y acatar el tiempo que debe actuar cada una.
 Usar agua potable como medio de lavado para las láminas.
 Se necesitará el aceite de inmersión para poder tener una mejor vista de las
muestras (aumentos 100x)

6. BIBLIOGRAFIAS
 fitoterapia PTA en, general. 2015 Dec 18. Bacterias gram+ o bacterias gram- : porque es
importante saber que bacteria es. [accessed 2019 Sep 29].
https://antibioticosnaturales.com/bacterias-gram/.

 Izquierda células azules cocos gram positivos en par, células rojas derecho a bacilos
gramnegativos, gram negativas varilla. 123RF. [accessed 2019 Sep 29].
https://es.123rf.com/photo_45490528_izquierda-células-azules-cocos-gram-positivos-
en-par-células-rojas-derecho-a-bacilos-gramnegativos-gram-.html.