Universidad Nacional de Rosario

Facultad de Ciencias Agrarias

Guía de Trabajo Práctico:

Calidad Microbiológica del
Agua

Carrera: Licenciatura en Recursos Naturales

Dra. Florencia I. Pozzi

2022
 Trabajo Práctico:
Calidad Microbiológica del Agua
I. Objetivo
Determinar la presencia de Coliformes Totales y Fecales en agua potable y residual, por el método
del Número Más Probable (NMP), mediante la técnica de fermentación en tubos múltiples.

II. Fundamentación teórica

Las características del agua en su aspecto sanitario y en relación con el consumo humano, se
encuentran relacionadas con la comunidad de microorganismos que alberga y que afectan su
calidad. Algunos de estos microorganismos, ya sea por sí mismos o por la producción de toxinas,
pueden afectar la salud humana, causando enfermedades que se conocen como “enfermedades de
transmisión hídrica”.
Los microorganismos que llegan a las fuentes de aguas pueden provenir del suelo y de origen
intestinal. La vía más habitual de contaminación por microorganismos es la que se produce por el
ingreso de efluentes residuales de la actividad humana.
Podemos encontrarnos en muestras de agua con bacterias (aerobias o anaerobias), virus (virus de la
hepatitis) y protozoos (Giardia), que pueden sobrevivir al tratamiento, por lo que su uso o
reutilización (aguas residuales tratadas) puede representar un riesgo potencial para la salud pública.
En consecuencia, las condiciones microbiológicas del agua son fundamentales desde el punto de
vista sanitario. Por lo que además del estudio de las características fisicoquímicas del agua, se
requiere de un estudio microbiológico específico de la misma.

Enfermedad Bacteria Productora

Fiebre Tifoidea Salmonella typhi
Disentería Bacteriana Shigella dysenteriae
Cólera Vibrio cholerae
Diarreas Proteus morganii
Ictericia Hemorrágica Leptospira
Colibacilosis Escherichia coli

Coliformes (u organismos indicadores): Son bacterias en formas de varilla, no esporuladas, Gram

Negativas, aerobias o anaerobias facultativas, que fermentan la lactosa con producción de gas al ser
incubadas a 35°C por 48hs. En su mayoría pertenecen a las denominadas bacterias entéricas.
Su presencia indica contaminación fecal de la fuente de agua en estudio, ya que este tipo de
bacterias están asociadas con el tracto intestinal de humanos y animales, en donde se encuentran en
gran número. Al indicar contaminación fecal, indirectamente van a estar indicando posible
presencia de patógenos. De encontrarse bacterias coliformes en la muestra de agua, podemos decir
que esta no es apta para el consumo, ya que el agua debe estar exenta de patógenos de origen
entérico y parasitario intestinal, que son los responsables de transmitir enfermedades.
Los análisis de agua potable determinan simplemente la presencia y el grado de contaminación fecal
de la muestra de agua, mediante la detección de los denominados organismos indicadores o
coliformes. El organismo indicador más frecuentemente utilizado es Escherichia coli. Los
resultados positivos para E.coli no demuestran la presencia de organismos enteropatógenos, pero si
la posibilidad de su presencia.
Los métodos más comúnmente utilizados para detectar la presencia de coliformes en agua son:
Número más Probable (NMP) y Filtración en Membrana (FM).
Los requisitos que debe cumplir un organismo indicador son:
-Estar presente siempre que lo estén los patógenos de importancia.
-Encontrarse en mayor cantidad que los patógenos para proporcionar un margen de seguridad.
-Debe sobrevivir en el ambiente tanto tiempo como los posibles patógenos.
-Tiene que ser fácil de detectar, con una alta fiabilidad de identificación.
-Fáciles de aislar y crecer en condiciones de laboratorio.

Tres grupos de bacterias califican para este fin:

Aerobias mesófilas Coliformes Pseudomonas

Totales Fecales
Determinan la Incluye a todos los Coliformes de origen Indican deterioro de la
efectividad del coliformes, de exclusivamente calidad del agua o una
tratamiento de las cualquier origen intestinal recontaminación
aguas

Límites para la provisión de agua potable y descarga de efluentes cloacales. Ley 11.220:
Transformación del sector público de agua potable, desagües cloacales y saneamiento. Provincia de
Santa Fe.

Límites para la provisión de agua potable:

Límites para la descarga de efluentes cloacales:

Desarrollo del Trabajo Práctico

III. Materiales y Sustancias

-Muestras de aguas: Potable (Rosario) y Residual (Zavalla)
-Tiosulfato de sodio.
-Mechero Bunsen
-Cerillos o encendedor
-7 tubos de 18x150mm conteniendo 9ml de agua de dilución estéril.
-7 pipetas de 1ml, estériles.
-15 tubos de 18x150mm con campana Durhan, conteniendo Caldo Lauril Sulfato estéril de
concentración sencilla (ver Anexo A).
-15 tubos de 18x150mm con campana Durhan, conteniendo Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante
estéril (ver Anexo A).
-10 tubos de 18x150mm con campana Durhan, conteniendo Caldo E.C. estéril (Ver anexo A).
-5 tubos de 18x150mm conteniendo Agar nutritivo inclinado estéril.
-Agitador de tubos Vortex
-Gradillas para tubos de 18x150mm.
-Ansa Bacteriológica.
-Estufa a 35°C.
-Baño Incubador para coliformes fecales a una temperatura constante de 44°C.

IV. Técnica

TOMA DE MUESTRAS:

a) Agua potable:

1) 2) 3)

Dejar correr agua Flamear Tomar la muestra

Importante: Al suponerse la presencia de cloro en el agua, se agregará a la muestra 100mg de
tiosulfato de sodio por cada litro de agua.
 b) Agua Residual: Llenar los recipientes (vidrio) con agua del lugar de muestreo.
Etiquetarlos (fecha y lugar).
Sellarlos y Conservarlos en refrigeración.
Analizar en el día.

PRUEBA PRESUNTIVA:

Todas las operaciones deben realizarse en absolutas condiciones de asepsia.

Resumen de la metodología utilizada en la Figura 2.

1- Preparar diluciones: con una pipeta estéril tomar 1ml de la muestra original y llevarlo a uno de
los tubos que contiene 9ml de agua de disolución estéril, se obtiene así una dilución 10 -1. Agitar el
tubo y tomar de esta dilución con otra pipeta estéril una alícuota de 1ml y llevarlo a otro tubo con
9ml de agua de dilución estéril. So obtiene así una dilución 10 -2. Proceder de la misma manera para
obtener una dilución 10 -3. Continuar con las diluciones hasta que sea necesario. (Fig. 1)
Importante: Al preparar las diluciones, hay que tener en cuenta la fuente de la que proviene la
muestra de agua, ya que si es de origen residual y se presume muy contaminada deberemos hacer
una mayor cantidad de diluciones, debido a que, en caso de no hacerlo, todos los tubos
posiblemente den resultados positivos, lo cual no es recomendado para la técnica.

Fig. 1. Preparación de diluciones a partir de la muestra de agua.

2- Incubar asépticamente tubos de fermentación conteniendo 9ml de caldo lauril sulfato, con 1ml de
cada una de las ultimas 3 diluciones de la muestra, por quintuplicado. El resto de las diluciones se
conserva en refrigeración por si se requiere su utilización posterior.
3-Incubar los tubos a 35°C durante 24-48hs.
4- después de 24hs de incubación, efectuar una primera lectura para observar si hay tubos positivos,
es decir, con turbidez y producción de gas en el interior de la campana Durham. En esta
verificación es importante asegurarse que la producción de gas sea resultado de la fermentación de
la lactosa, en cuyo caso se observará turbidez en el medio de cultivo, no confundir con burbujas de
aire (revisar campanas antes de realizar la incubación).
5-De los tubos que den positivos en la primer lectura, puede realizarse las pruebas confirmatorias
para coliformes totales y coliformes fecales. En aquellos tubos donde no haya crecimiento, se
continuarán incubando por 24hs más.
6-Luego de las 48hs de incubación se hace la lectura final. Si pasada las 48hs tampoco se aprecia
crecimiento ni producción de gas, los tubos se toman como negativos.

Interpretación de la prueba presuntiva:

 Si el total de tubos son negativos: El examen se da por terminado. Reportando la ausencia
total de coliformes totales y fecales en la muestra analizada.
 Todos aquellos tubos que den positivos: Se anotarán convenientemente y se procederá a
realizar la prueba confirmatoria para coliformes totales y fecales.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES:
1- Cada tubo positivo de la prueba presuntiva es agitado para homogeneizar, inocular con tres
asadas los tubos que contienen 10ml caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB).
2- Incubar durante 48hs a 35°C.
3- Luego de las 48hs observar la presencia de turbidez y gas

Interpretación de la prueba confirmatoria para coliformes totales:

 La prueba se considera negativa: Si en el tubo no se observa producción de gas, aun cuando
se observe turbidez. Estableciéndose el Código 0, 0, 0 para el cálculo del NMP.
 La prueba se considera positiva: Si se observa turbidez y producción de gas en el tubo,
debiendo anotar el número de tubos para posteriormente hacer el cálculo del NMP.
 Si los tubos dan todos negativos o todos positivos, con base en los grados de dilución
analizados, considerar la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución
menores (mayores volúmenes de muestra) o mayores (menores volúmenes de muestra)
respectivamente.

PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES:

1- A cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitarlos para
homogeneizar, inocular con tres asadas los tubos que contienen 10ml de caldo E.C. (Escherichia
coli)
2- Incubar durante 24hs a 44.5°C y luego de eso período, observar turbidez y gas.

Interpretación:
 La prueba se considera positiva: Si se observa en el tubo turbidez y producción de gas.
Debiendo anotar el número de tubos positivos y establecer el código para posteriormente
hacer el cálculo del NMP.
 La prueba se considera negativa: Cuando en el tubo no se observa producción de gas, aun
cuando se observe turbidez. Estableciéndose el Código 0, 0, 0 para el cálculo del NMP.
 Si los tubos dan todos negativos o todos positivos: con base en los grados de dilución
analizados, considerar la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución
menores (mayores volúmenes de muestra) o mayores (menores volúmenes de muestra)
respectivamente.

Fig. 2 Determinación de NMP de coliformes a partir de muestras de agua.

CÁLCULOS:
De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmatorias para Coliformes Totales y Fecales,
establecer los códigos correspondientes para calcular por referencia en las tablas estadísticas (Fig.3,
Fig. 4, Fig. 5) el NMP de Coliformes Totales y Fecales en 100ml de agua. Teniendo en cuenta la
cantidad de tubos (+) es posible definir el número característico. Este número está compuesto por 3
cifras, las cuales provienen de las diluciones consecutivas.

En general se tiene:

Los resultados obtenidos se expresan de la siguiente manera:

NMP DE COLIFORMES TOTALES: ____________/100mL

NMP DE COLIFORMES FECALES: ____________/100mL

Fig. 3. Ejemplo de Código NMP: 3, 1, 1

 Fig. 4. Ejemplo de tabla de resultados: Coliformes Totales y Fecales

Fig. 5. Tabla para el cálculo del NMP de coliformes, para 3 tubos con diferentes diluciones con tres repeticiones.

V. Cuestionario
1- a) ¿Cuáles son los límites máximos permisibles de coliformes fecales en agua potable y residual
(cloacal)? b) De acuerdo con los resultados obtenidos, las muestras de agua analizadas ¿Se
encuentran dentro de los límites establecidos?
2-Mencionar 5 enfermedades transmitidas por el agua, indicando el agente etiológico
correspondiente.
3- a) ¿Por qué se utilizan organismos indicadores para determinar la calidad del agua, en cuanto a su
composición microbiológica? b) ¿Qué indican directa e indirectamente la presencia de coliformes
en agua?
4- Teniendo en cuenta los siguientes códigos obtenidos por la técnica fermentación en tubos
múltiples para coliformes totales: 300 y para colifirmes fecales 101 (coliformes fecales)
(Diluciones: 0,1ml, 0,01ml y 0,001ml respectivamente) ¿cómo procederías para determinar el NMP
de Coliformes Totales y Fecales? 5- ¿Qué métodos de determinación de coliformes en agua
conoces? Nómbralos.

Anexo A: Preparación de medios y soluciones.

MEDIOS DE AISLAMIENTO:
-Caldo lauril sulfato (CLS).
Triptosa 20.0g
Lactosa 5.0g
Cloruro de sodio (NaCl) 5.0g
Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 2.75g
Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) 2.75g
Lauril sulfato de sodio 0.1g
Agua para llevar a 1000 mL
Añadir la triptosa y el cloruro de sodio al agua, calentar para disolver y añadir el lauril sulfato de
sodio. Disolver el resto de los componentes por separado y agregarlos a los anteriores mezclando
suavemente para evitar la formación de espuma.

-Caldo bilis lactosa verde brillante:

Peptona 10.0g
Lactosa 10.0g
Bilis de buey (deshidratada) 20.0g
Verde brillante (1% m/m en solución acuosa) 13 mL
Agua para llevar a 1000 mL

-Medio EC:
Triptosa o tripticasa 20.0g
Lactosa 5.0g
Mezcla de sales biliares 1.5g
Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4) 4.0g
Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 1.5g
Cloruro de sodio (NaCl) 5.0g
Agua para llevar a 1000 mL
Distribuir el medio de simple concentración en volúmenes indicados en cada tubo que debe
contener un tubo de fermentación invertido (Durham). Colocar en autoclave y esterilizar. Disolver
los componentes por separado y agregarles agitando suavemente y esterilice.

Bibliografía:
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis
Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
Madigan, M.T.; Martinko, J.M.; Parker, J. (2004). Brock: Biología de los Microorganismos. 10ª Edición. Ed.
Pearson Education.
http://www.upemor.edu.mx/labo/tarchivos/archivos/HEAL/practica_7.pdf
http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p18.pdf