INSTITUTO TECNOLÓGICO “SAN IGNACIO DE LOYOLA”

QUIMICA INSDUSTRIAL 2do AÑO

MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y

ESCHERICHIA COLI POR LA TÉCNICA DE DILUCIONES EN TUBO MÚLTIPLE (NÚMERO MÁS
PROBABLE O NMP)

1.- OBJETIVOS:
 Determinar la calidad microbiológica de muestras de agua o alimentos mediante la
búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
 Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes
fecales.
2.- GENERALIDADES
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral
utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos
que funcionen como indicador de contaminación fecal. Estos deben de ser constantes,
abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de
los patógenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente.
El grupo coliforme constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente
intestinal para la mayoría de las especies que involucra, es constante, abundante y casi
exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicación fuera del
intestino también se observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como
indicador de contaminación fecal en agua; encontrándose que mientras mayor sea el
número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una
contaminación reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican,
por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que
recibe en el agua. Cuando los productos alimenticios han recibido un tratamiento térmico
(pasteurización, horneado, cocción, etc.), estos microorganismos se utilizan como
indicadores de malas prácticas sanitarias.

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3.- FUNDAMENTO TEÓRICO

Las bacterias del grupo coliformes se utilizan desde el inicio del siglo XX como
indicadoras de contaminación fecal. Fueron definidas siempre como bastoncillos gram
negativos, no formadoras de esporas, que pueden crecer en presencia de sales biliares o
de otros agentes tensoactivos y que fermentan la lactosa a 37°C, con producción de ácido
(ácidos orgánicos y aldehidos) y gas en 24 horas.
En las heces, están en la concentración de 10 8-1010 microorganismos por gramo.
Tradicionalmente los coliformes son clasificados en un grupo denominado coliformes
totales y dentro de este existe un subgrupo conocido como Coliformes Fecales.
Los coliformes totales son clasificados como bacilos gram negativos aerobios y anaerobios
facultativos no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas
después de incubación durante 24-48 horas a 35°C. Incluye los géneros Citrobacter spp.,
Klebsiella spp., Enterobacter spp., en este último se encuentra la E. coli, exclusiva de heces
animales homeotérmicos.
Los coliformes fecales constituyen un subgrupo de los coliformes totales, y se diferencian
de los anteriores por ser tolerantes a temperaturas más altas, creciendo a 44.5°C, (APHA,
1995). Se denominan termotolerantes por su habilidad de soportar temperaturas más
elevadas.
4.- FUNDAMENTO DE LA TECNICA NMP
La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más
Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la
lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 37°C durante 48 h., utilizando un
medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la
fase presuntiva y la fase confirmativa.

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el
cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren
presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de
carbono.
Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde
brillante (para determinar coliformes totales) el cual es selectivo y solo permite el
desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el
verde brillante, a una temperatura de 35°C

Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de

caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos, y se fundamenta
en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son
incubados a una temperatura de 44.5 por un periodo de 24 a 48 h.

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5.- REACTIVOS
• Caldo lactosado o caldo lauril sulfato de sodio
• Caldo verde brillante y bilis al 2 %.
• Caldo Medio EC
• Agua de dilución
• Agua peptona

6.- EQUIPOS Y MATERIALES:

 Mechero Bunsen
 Propipeta
 Gradillas
 Matras de 250 ml
 Vidrio de reloj
 Vasos precipitados de 250 ml
 Espátulas
 Probetas de 50 y 100 ml
 Tubos durham (tubo de vidrio con tapa rosca)
 Campanas de Durham
 Pipetas de 10.0 mL estériles
 Pipetas de 5.0 ml esteriles
 Pipetas de 1.0 mL estériles
 Asa bacteriológica
 Incubadora a 35° y 45° ± 2,0ºCa.
 Estufa para esterilizar material de vidrio a 160-180°Ca
 Autoclave

Antes de iniciar la practica, es crucial contar con bata de laboratorio y guantes para. Asimismo, se
debe asegurar la limpieza y desinfección de las superficies y utensilios a utilizar, manteniendo un
entorno de trabajo ordenado. Es fundamental manipular y utilizar herramientas limpias y en
buenas condiciones. Siguiendo estas precauciones simples y bajo supervisión del docente a cargo
se promueve un ambiente seguro y se garantiza mejores resultados.

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7.- PROCEDIMIENTO:
7.1.- PREPARACION DE LAS DILUCIONES
 Prueba presuntiva: caldo lauril sulfato de sodio o caldo lactosado, se disuelve la
cantidad indicada en las instrucciones del medio deshidratado (según sea
concentración simple 35,6 g o 71,2 g (doble) en 1000 ml de agua destilada.
Mezclar muy bien y calentar, sólo si es necesario, para disolver.
 Distribuir en volúmenes de 10 mL en 6 tubos de cultivo con campana Durham en
su interior.
 Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos
 Prueba confirmativa:
Preparar los tubos necesarios de acuerdo a la confirmación de las pruebas
presuntivas.
 Caldo Bilis verde brillante (para coliformes totales)
Se disuelve la cantidad indicada en las instrucciones del medio deshidratado en
agua destilada. Mezclar muy bien y calentar, si es necesario, para disolver.
 Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos de cultivo con campana Durham en su
interior.
 Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
 Caldo Medio EC (para coliformes fecales Escherichia coli)
se disuelve la cantidad de 37 g. del medio deshidratado en 1000ml agua destilada.
Mezclar muy bien para disolver.
- Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos de cultivo con tubos Durham en su
interior.
- Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

7.2.- ENSAYO PRESUNTIVO

Muestra.
Antes de efectuar los cultivos, la botella con la muestra y las diluciones, deben ser agitadas
vigorosamente, con movimientos hacia arriba y hacia abajo.
Diluciones de las muestras
- Dilución 1:10. Tomar para ello 1 mL de la muestra y depositarla en un tubo de ensayo con 9
mL de agua de dilución estéril.
- Dilución 1:100. Tomar para ello 1 mL de la dilución 1:10 y depositarla en un tubo de ensayo
con 9 mL de agua de dilución estéril.
- Si se desean más diluciones se efectúan de igual forma, de acuerdo a la cantidad de
microorganismos esperados.

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Inoculación:
las muestras se inoculan de acuerdo al siguiente procedimiento:
- Antes y después de realizar las inoculaciones, la boca del frasco de la muestra deberá ser
flameada con objeto de evitar contaminación.
- Inocular 3 tubos de fermentación con 10 mL de caldo lauril sulfato de sodio concentración
simple, con 0,1mL de muestra, (dilución de 0,001 ó 10-3)
- Inocular 3 tubos de fermentación con 10 mL de caldo lauril sulfato de sodio concentración
simple, con 1 mL de la muestra. (dilución de 0,01 ó 10-2)
- Inocular 3 tubos de fermentación con 10 mL de caldo lauril sulfato de sodio concentración
simple, con 10 ml de la muestra. (dilución de 0,1 ó 10-1)
Realizar la inoculación como muestra la siguiente figura:

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- Incubar todos los tubos a una temperatura de 37 °C durante 24 - 48 h.

- Después de 24 h de incubación efectuar una primera lectura para observar si hay tubos
positivos, es decir, con producción de ácido, si el medio presenta turbidez y producción de gas
en la campana Durham. Al hacer esta verificación es importante asegurarse que la producción
de gas sea resultado de la fermentación de la lactosa en cuyo caso se observará turbidez en el
medio de cultivo y no confundir con burbujas de aire. Para evitar este tipo de confusiones es
recomendable revisar las campanas Durham antes de proceder a la inoculación y desechar
aquellos que contengan burbujas de aire ó de alguna manera eliminar éstas y así poder
utilizarlos.
- De los tubos que en esta primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas
confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales.
- En caso de no apreciarse alguno o todos los cambios mencionados en el resto de los tubos,
continuarán en incubación 24 h más.
- Después de 48 ± 2h a partir de la inoculación, se hace la lectura final.
- Si pasadas estas 48 h tampoco se aprecia turbidez ni producción de gas, los tubos se toman
como negativos.
- Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA
DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada.
- Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarán
convenientemente y se procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATIVA para Coliformes
Totales y Fecales.

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7.3 .- ENSAYO CONFIRMATIVO PARA COLIFORMES TOTALES

- A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva,
agitándolos previamente para homogeneizar, inocular con tres asadas a los tubos conteniendo
caldo Lactosa Bilis Verde Brillante.
- Incubar durante 48 ± 3 h a 35 ± 0,5 °C.
- Examinar los tubos a las 18 ± 1 h y 48 ± 3 h de incubación y anotar el número total de tubos
que presenten formación de gas en cualquier cantidad.
- Dentro de 48 ± 3 h constituye un ensayo confirmativo positivo.
- Si se observa turbidez y producción de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo
anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP.
- Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: Se
consideran negativos, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del cálculo del NMP.
7.4.- ENSAYO CONFIRMATIVO PARA COLIFORMES FECALES
- Someter a ensayo confirmativo todos los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva con caldo LST a las 24 y 48 h de incubación a 37°C
- Homogenizar los tubos positivos del ensayo presuntivo por agitación o rotación suave. Los
tubos con caldo EC deben estar a temperatura ambiente antes de la inoculación.
- Transferir una asada completa del cultivo viable desde los tubos positivos del ensayo
presuntivo, a un tubo de fermentación con caldo EC.
- Incubar durante 24 horas a 44±0,5°C, observar presencia de turbidez y gas.
- Si se observa turbidez y producción de gas:
La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos positivos para
posteriormente hacer el cálculo del NMP.
Si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez: Se reporta la AUSENCIA
DE COLIFORMES FECALES.

DILUCIONES DE LA MUESTRA DE ALIMENTO PARA DETECCIÓN DE CONTAMINACIÓN

Cuando se tiene una muestra de alimento líquida y sólida se procede a elaborar una solución
madre que consiste en colocar el material cubierto con el microorganismo en un recipiente
que contiene 100 ml de agua destilada estéril o agua peptona, una cantidad de 10 gr. cuya
suspensión resultante se debe agitar por 1 minuto, para obtener la suspensión concentrada
del inóculo. Luego de esta solución madre proceder a la inoculación para su incubación en los
tubos de prueba presuntiva y confirmativa.

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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

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