UNIVERSIDAD NACIONAL DE

FRONTERA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS

MICROBIOOGÍA DE LOS ALIMENTOS

GUÍA DE PRÁCTICAS

V CICLO

DOCENTE: BLGO. OSCAR JULIAN BERRIOS TAUCCAYA

SULLANA – PERÚ

2020
 PRACTICA 08

RECONOCIMIENTO DE COLIFORMES Y E. coli EN ALIMENTOS

I. INTRODUCCIÓN

Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando como
vehículo los alimentos, es necesario contar con microorganismos que funcionen como indicador de
contaminación e higiene. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal,
deben tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces de
desarrollarse extra intestinalmente.

El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las
características de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino también se
observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de contaminación
fecal en agua; conforme mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de
estar frente a una contaminación reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que
en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En
productos alimenticios que han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción,
etc.), se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias.

Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los
animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero también ampliamente distribuidas en la
naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales. Los coliformes se introducen en gran número
al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse la mayoría de
los coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, aún existen muchos
coliformes de vida libre. Los coliformes totales se usan para evaluar la calidad de la leche pasteurizada,
leche en polvo, helados, pastas frescas, fórmulas para lactantes, fideos y desayuno. Los coliformes
fecales se usan para evaluar los mariscos frescos. Por último, la E. coli se usa como indicador en quesos
frescos, quesillos, cereales, masas con relleno, alimentos infantiles, cecinas cocidas y verduras frescas.

II. OBJETIVOS

2.1. General

Reconocer las técnicas de identificación de coliformes y E. coli en alimentos.

 III. FUNDAMENTO TEÓRICO

La denominación genérica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas
características bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación
E. del agua y
los alimentos. coli

Coliforme significa con forma de coli, refiriéndose a la bacteria principal del grupo, la Escherichia coli,
descubierta por el bacteriólogo alemán Theodor von Escherich en 1860. Von Escherich la bautizó como
bacterium coli ("bacteria del intestino", del griego κολον, kolon, "intestino"). Con posterioridad, la
microbiología sistemática nombraría el género Escherichia en honor a su descubridor.

El grupo contempla a todas las bacterias entéricas que se caracterizan por tener las siguientes propiedades
bioquímicas:
1. Ser aerobias o anaerobias facultativas,
2. Ser bacilos Gram negativos,
3. No ser esporógenas,
4. Fermentar la lactosa a 37 °C en 48 horas, produciendo ácido láctico y gas.

Tradicionalmente se los ha considerado como indicadores de contaminación fecal en el control de calidad del
agua destinada al consumo humano en razón de que, en los medios acuáticos, los coliformes son más resistentes
que las bacterias patógenas intestinales y porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica
que el agua es bacteriológicamente segura.

Asimismo, su número en el agua es proporcional al grado de contaminación fecal; mientras más coliformes se
aíslan del agua, mayor es la gravedad de la descarga de heces.

Coliformes fecales

Los coliformes fecales son microorganismos con una estructura parecida a la de una bacteria común que se
llama Escherichia coli y se transmiten por medio de los excrementos. La Escherichia es una bacteria que se
encuentra normalmente en el intestino del hombre y en el de otros animales. Hay diversos tipos de Escherichia;
algunos no causan daño en condiciones normales y otros pueden incluso ocasionar la muerte: la
enterohemorrágica (EHEC), enteroinvasiva (EIEC), enteopatógena (EPEC), enterotoxigénica (ETEC) y
enteroagregativa (EAEC).

Formas patógenas de Escherichia y de otras bacterias (que por tener forma similar se denominan genéricamente
coliformes fecales) se transmiten, entre otras vías, a través de las excretas y comúnmente por la ingestión o el
contacto con agua contaminada. La Escherichia no sobrevive mucho tiempo en agua de mar, pero otros
coliformes fecales sí, por lo que suelen reportarse en conjunto.

IV. MATERIALES, REACTIVOS Y MUESTRAS

4.1. Materiales y equipos

4.1.1. Equipos:
 1. Balanza analítica.
2. Homogenizador de alimentos - STOMACHER
3. Autoclave.
4. pH metro.
5. Baño María.
6. Mechero Bunsen.
7. Incubadora.
8. Estufa.
9. Termómetro.
10. Cuenta colonias.

4.1.2. Materiales:

1. Probeta de 250 ml (1 por grupo de mesa).

2. Bagueta o agitador de cristal (1 por grupo de mesa).
3. Espátula (1 por grupo de mesa)
4. Pipeta de 1 y 10 ml (1 por grupo de mesa)
5. Placas Petri (3 por grupo de mesa).
6. Mortero (1 por grupo).
7. Tubos de ensayo (6 por grupo de mesa).
8. Campanas Durfham
9. Vaso Beaker de 1000 ml (1 por grupo de mesa).
10. Matraz de 250 ml (1 por grupo de mesa).
11. Plumón de tinta indeleble de punta fina. (Estudiante)
12. Bolsas para descarte de basura. (Estudiante)
13. Fósforos (Estudiante).
14. Toalla o tela de secado (que no desprenda pelusas) (Estudiante)
15. Detergente. (Estudiante).
16. Esponja o tela para el lavado de los materiales de vidrio.
17. Torundas.
18. Tabla de cortar.
19. Cuchillo de corte.
20. Embudo de cristal (1 por grupo de mesa).
21. Lupa Científica.

4.2. Reactivos

1. Solución Salina Peptonada (Agua peptona)

2. Caldo Brila (volumen de 10 mL en cada tubo conteniendo tubos de fermentación)
3. Caldo E. C. (volumen de 10 mL en cada tubo conteniendo tubos de fermentación)
4. Caldo triptona
5. Agar EC
6. Agua Destilada Estéril.
7. Alcohol 96° (Estudiante).
8. Solución clorada al 5%.

4.3. Material biológico

Diferentes tipos de alimentos sólidos y líquidos.

 V. PROCEDIMIENTO

5.1. Preparación de la zona aséptica

1) Desinfectar la zona de trabajo con disolución comercial de hipoclorito de sodio.

2) Encender el mechero.

5.2. Dilución de la muestra de alimentos

1) Mantener en refrigeración hasta 24 horas después de tomada la muestra.

2) Antes de abrir los envases se debe desinfectar con alcohol al 70% y agitarse para homogenizar. Si
es un material sólido se debe utilizar un mortero estéril para fragmentar el alimento.
3) Se preparan diluciones del alimento de 10-1 hasta 10-3.
4) La dilución 10-1 se prepara midiendo 1 gramos (sólido) o 1 ml (líquido) de la muestra en un frasco
que contenga 9 ml de solución salina peptonada o agua peptonada.
5) Transferir 1 ml. de la dilución 10-1 a un tubo que contenga 9 ml del diluyente (agua peptonada o agua
destilada) para obtener la dilución 10-2 y así sucesivamente hasta formar la dilución 10-3.

Cada dilución sucesiva disminuirá 10 veces la concentración anterior. Los tubos deben estar bien rotulados.

5.3. Siembra en caldo Brila – Prueba presuntiva

1) Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones del alimento y traspasarlos en tres tubos que contengan 9
ml de cultivo caldo Brila, por cada dilución. Cada tubo debe de contener en su interior campana Durand
de fermentación de forma invertida.

2) Incubar los tubos a 35 °C – 37 °C por 24 horas a 48 horas.

3) Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que presentan producción de gas en las campanas Durham (prueba
presuntiva) de cada dilución.
4) Para obtener el Número Más Probable (NMP), proceder de la forma siguiente:
a. Ver en cada una de las tres diluciones seleccionadas el número de tubos que presentan gas.
b. Buscar en la tabla del NMP y anotar el NMP que corresponde al número de tubos positivos de cada
dilución.
5.4. Siembra en caldo triptófano – Prueba confirmativa

1) Tomar los tubos positivos de la prueba presuntiva.

2) Introducir la asa bacteriológica tres veces en los tubos positivos y transferirla a tubos de ensayo que
contienen previamente 10 ml de caldo triptófano.
3) Esterilizar el asa cada vez que se utilice.
4) Incubar a 44,5 °C (bacterias termotolerantes) durante 48 horas.
5) Transcurrido las 48 horas, adicionar reactivo de Kovac’s (2-4 gotas).
6) Si se observar la formación de un halo rojo en la parte superior del medio de cultivo, es positivo para
fecales y si no, es negativo.

5.5. Identificación de E. coli

1) Transferir un asa (de los tubos positivos al reactivo de Kovac’s) a caja Petri con Agar EC
haciendo siembra por estría de los tubos positivos con anillo rojo.
2) Por cada dilución habrán dos cajas de Petri con Agar EC
3) Incubar a 44,5°C durante 48 horas observar colonias de color entre azules y rojo-azules.

5.6. Tratamiento de residuos

Los cultivos ya utilizados deben esterilizarse usando la autoclave, los medios sólidos pueden ser
desechados con los residuos orgánicos y los líquidos a la tarja.

VI. FORMATO DE PRESENTACIÓN DE RESULTADOS

1. Esquematice los procedimientos de la práctica.

2. Revisar resultados de prácticas realizadas con relevancia a la práctica.
3. Analice y discuta los resultados.
4. Responda el cuestionario.
5. Referenciar la literatura científica consultada.

VII. CUESTIONARIO

1. ¿Qué otros microorganismos parte de los coliformes podrían producir una prueba presuntiva positiva?
2. Explique el significado de término “grupo coliforme”. ¿Qué importancia tiene en microbiología de
alimentos? ¿Cuáles bacterias los integran?
3. Fuera de las Coliformes. ¿Qué otra bacteria son indicadores de contaminación?
4. ¿Qué importancia tiene saber el número de microrganismos en una muestra de alimento?