Práctica N° 10

Análisis microbiológico de aguas

I. Introducción
La demanda de agua dulce aumenta cada vez debido al crecimiento de la
población, la urbanización, las industrias, y por el aumento de la producción
(UNESCO, 2015). A la par se debe brindar fuentes de agua dulce de buena calidad a
las personas de todo el mundo, sin embargo, se observa que en los diferentes
países existe una carencia de servicios básicos de saneamiento, por esa razón se ha
incrementado enfermedades gastrointestinales que tienen relación con la mala
calidad del agua. Esta agua se convierte en un vehículo de transmisión de
enfermedades ocasionadas por patógenos como bacterias, virus, protozoos y otros
organismos que ocasionan problemas de salud pública.
Para garantizar un agua segura a la población se ha elaborado guías, reglamentos,
normas y protocolos de monitoreo y vigilancia del agua para consumo humano.
Para esto la calidad del agua es la condición de ausencia de cualquier sustancia
nociva que afecta las propiedades del agua y la salud del consumidor.
Ministerio de salud (2011) señala que el agua apta para el consumo humano, es
toda agua inocua para la salud que cumple los requisitos de calidad establecidos
en el Reglamento DS 031-2010 S.A. asimismo en el Artículo sesenta señala que los
parámetros microbiológicos y otros organismos Toda agua destinada para el
consumo humano, debe estar exenta de: 1. Bacterias coliformes totales,
termotolerantes y Escherichia coli, 2. Virus; 3. Huevos y larvas de helmintos,
quistes y ooquistes de protozoarios patógenos; 4. Organismos de vida libre, como
algas, protozoarios, copépedos, rotíferos y nemátodos en todos sus estadios
evolutivos; y 5. Para el caso de Bacterias Heterotróficas menos de 500 UFC/ml a
35°C.

Fuente: MINSA, (2011)

1.1 Microorganismos relacionados con la contaminación en el agua

Para asegurar que el agua que consume una población es de buena calidad y
en la cantidad adecuada se debe verificar la calidad microbiológica para esto se
debe realizar:
 El análisis del agua de la fuente
 El análisis del agua inmediatamente después del tratamiento
 El análisis del agua en sistemas de distribución y/o el agua almacenada en
las casas.
Así misma vigilancia y monitoreo de la calidad porque:
 Los patógenos se hallan en forma discreta y no en solución
 Se encuentran siempre adheridos a los sólidos sus pendidos del agua
 La probabilidad de infección por patógenos depende de la invasibilidad y
virulencia del patógeno y de la inmunidad del individuo.
 En contraste con los agentes químicos, la dosis-respuesta del patógeno no
es acumulativa.

Grupo Coliformes
Son un grupo de bacterias en forma de bacilo, de la familia de los
Enterobacteriaceae, Gram negativas, aerobias y anaerobias facultativas que no
forman esporas y que fermentan la lactosa produciendo ácido y gas a 37°C en
un espacio de 24 a 48 horas (Gonzales, 2016).
Se utilizan como indicadores de contaminación en el agua, porque se
encuentra en el tracto digestivo de seres humanos y animales (Madigan,
Markinko & Parker, 2010).
Protozoos
Microrganismos eucariotas de vida libre, unicelulares y pluricelulares, viven en
colonias la mayoría son acuáticos. La preocupación por la presencia de estos
protozoos en el agua se debe a su gran impacto en salud y a sus mínimas dosis
infectivas. Algunos de ellos son: Entamoeba hystolitica, Giardia lamblia y
Crytosporidium.
Virus
Existen algunos virus que producen enfermedades gastrointestinales, sin
embargo no se encuentran normalmente en el tracto gastrointestinal del ser
humano.
Dosis Infectiva de Patógenos y parásitos relacionados con el agua

Agente Dosis Min. infectiva

BACTERIAS
 Salmonella spp. 104-107
 Shiguella spp. 101-102
 Escherichia coli 106-108
 Vibrio cholerae 103
VIRUS
V. Hepatitis A
PROTOZOARIOS 1-10
 Giardia intestinalis
 Cryptosporidium 101-102
 Entamoeba coli 101 quistes
HELMINTOS 101 quistes
Ascaris 1-10 huevos
1.2 Métodos de detección de organismos indicadores de contaminación en el
agua
Organización Panamericana de la Salud, (2004)
1.2.1 Técnicas por tubos múltiples

El método del NMP por tubos múltiples se fundamenta en un modelo de

cálculo de probabilidades. De acuerdo con la alternativa de siembra elegida,
se selecciona la tabla de NMP correspondiente para obtener los recuentos
de coliformes.

La técnica de fermentación en tubos múltiples es una alternativa para la

determinación de coliformes totales y termotolerantes y se recomienda
para el análisis de muestras de agua superficial que sirve como fuente de
abastecimiento. Es muy útil en el caso de aguas superficiales con una alta
densidad de partículas o coloreadas, que no pueden ser fácilmente
procesadas por la técnica de filtración con membrana. También se propone
este método para el análisis de agua potable, para lo cual se recomienda la
siembra de una serie de 10 tubos con volúmenes de 10 mililitros ó 5 tubos
de fermentación con volúmenes de 20 mililitros.

La técnica de fermentación en tubos múltiples para la determinación de

coliformes totales y termotolerantes consta de dos fases: la fase presuntiva y
la fase confirmatoria Organización Panamericana de la Salud, (2004).
1.2.2 Técnicas de filtración por membrana

La técnica de filtro de membrana se fundamenta en la filtración de un

volumen determinado de muestra (100 mililitros o volúmenes menores
según la densidad bacteriana esperada) a través de un filtro de membrana
de 0,45 micrómetros de diámetro de poro, el cual es colocado sobre un
medio de cultivo específico y luego incubado a la temperatura adecuada.

El método de filtración con membrana para la determinación de

coliformes totales y termotolerantes está aceptado por el Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater (American Public
Health Association-American Water Works Association, 1999), que lo
propone como una alternativa para la determinación de los coliformes
totales y termotolerantes. Este método se recomienda para la
determinación de bacterias en muestras de agua potable y agua de origen
subterráneo OPS, (2004).

1.2.3 Técnica Presencia-ausencia

Es un procedimiento simplificado de la técnica de fermentación en tubos

múltiples para la determinación cualitativa de coliformes en agua destinada
al consumo humano. La prueba de presencia-ausencia considera la siembra
de 100 mililitros de muestra en el caldo P-A y está fundamentada sobre el
principio de que los coliformes deben estar ausentes en 100 mililitros de
agua potable. Esta prueba consta de dos fases: una presuntiva y otra
confirmativa. Si el resultado del análisis es positivo, puede ser necesaria la
determinación cuantitativa en una nueva muestra.
 El método de presencia-ausencia es una alternativa para la
determinación cualitativa de coliformes totales y termotolerantes. Es más
simple y económica que las técnicas de tubos múltiples y de filtro de
membrana, que son pruebas cuantitativas OPS, (2004).

II. Objetivo

Determinar la calidad microbiológica de diferentes muestras de agua mediante el

método por tubos múltiples.

III. Materiales y métodos

III.1Materiales

Materiales Reactivos Equipos

Muestreo Botella de vidrio Agua destilada Ph metro
200 ml de campo
Guantes
Balde limpio
Sogilla
Análisis Coliformes Tubos de ensayo Solución salina Mechero
totales Gradilla peptonada (aguas Bunsen
residuales y aguas Incubadora
Pipetas 0,1 ml; superficiales)
1ml; 10 ml Caldo lauril triptosa
Pipeteador Caldo verde
Asa de siembra brillante bilis

Análisis Coliformes Tubos de ensayo Caldo EC Mechero

termotolerantes Gradilla Reactivo de Kovacs Bunsen
Incubadora
Asa de siembra

III.2Metodología
1. Tomar la muestra de agua con una botella de vidrio o plástico autoclavable
de 250 ml. y guantes estériles.
2. Si el agua en estudio es potable se debe añadir 0,1 ml de tiosulfato de
sodio 1,8%
3. (OMS, 1988) menciona que los tres tipos de agua que se pueden analizar
son: Agua de una corriente de agua (ríos), aguas con poco o sin
movimiento (reservorios, lagunas, lago) o agua depositada (tanque). Agua
de un pozo excavado o algo semejante, donde el acceso presenta una
mayor dificultad. Agua de un grifo en un sistema de distribución o de una
bomba de mano.
4. Al tomar la muestra de río introducir la botella en contra de la corriente y
a una profundidad de 20 cm aproximadamente. En pozo utilizar un balde y
soga limpia y libre de contaminación (esterilizado). En caso de un grifo
abrir y dejar correr el agua por unos minutos luego abrir la botella y
 colocarlo debajo del chorro de agua, cerrar y llevar de inmediato al
laboratorio.
Coliformes totales
Prueba Presuntiva
5. Para el análisis de agua potable, se recomienda la siembra de una serie de
5 tubos con volúmenes de 10 mililitros, 1 ml y 0,1 ml. Vaciar esta cantidad
en cada tubo de fermentación con caldo lauril triptosa.
6. Incubar a 37º C por 24 o 48 horas.
Prueba confirmativa
 Después de la incubación separar los tubos positivos.
 Con el asa de siembra previamente estéril sacar un inoculo de los
tubos positivos (producción de gas en tubos Durham) a los tubos
nuevos con caldo verde brillante bilis e incubar a 24 o 48 horas a 37º C.

Figura Nº 1

Coliformes termotolerantes

 Pasado este tiempo, separar los tubos positivos para transferir un

inoculo a los tubos con caldo EC.
 Nuevamente incubar por 24 o 48 horas a 44,5 º C.
 Finalmente, pasado este tiempo retirar los tubos de la incubadora,
separar los tubos positivos (producción de gas en tubos Durham).
 Agregar reactivo de Kovacs para confirmar la presencia de E. coli con
un anillo rosa.
 Una vez realizado los análisis de coliformes totales prueba confirmativa
y coliformes termotolerantes registrar los tubos positivos y asignar un
código. Figura Nº2
Ejm.:
 El código obtenido identificarlo en la tabla del número más probable.

7. Para el caso de agua superficial o residual se debe proceder a realizar

dilución, tomando 10 ml de la muestra y mezclar con 90 ml de agua de
dilución (solución salina peptonada o suero fisiológico).
8. Luego tomar una 3 serie de 5 tubos al cual se le agrega 10ml de muestra a
cada tubo, 1ml a la otra serie de 5 tubos y 0,1 ml a los 5 tubos restantes.
9. Luego de terminar de llenar las muestras incubar a 37 º C por 24 o 48
horas.
10. Repetir todo el proceso similar al del agua potable.

IV. Resultados y conclusiones

Cuestionario
1. ¿Cuál es el propósito de los análisis microbiológicos del agua?
2. Investigue los métodos de control de calidad del agua para consumo humano
3. Describa las características de los microorganismos coliformes
4. Explique la reacción de Kovacs

Referencias
1. Organización panamericana de la salud. 2004. Manual para análisis básico del
agua de bebida. CEPIS. Lima.
2. Ministerio de salud 2010. Reglamento de la calidad del consumo humano.
Lima
3. La Organización de las Naciones Unidas para la Educación, la Ciencia y la
Cultura. 2015. Agua para un mundo sostenible. Programa mundial de
evaluación de los recursos hídricos. Italia.

Anexo