UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL Y DE SISTEMAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA
AGROINDUSTRIAL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA APLICADA

PRACTICA DE LABORATORIO N° 1

DETECCIÓN DE CONTAMINACIÓN FECAL EN AGUAS

CICLO: 5
SECCION: C
TURNO: Mañana
DOCENTE: Ing. Angélica Miranda Jara

INTEGRANTES:

CODIGO NOMBRES Y APELLIDOS %PARTICIPACION

2017001564 Aracca Tamayo, Jesus 20 %

2017001742 Areche Negron, Antonio 20 %

2017004519 Camargo Blas, Antony 20 %

2017009977 Espinoza Alarcon, Ronaldo 20 %

2015236824 Fernando, Guevara Ventura 20 %

TOTAL 100 %

2019 - II
 I. INTRODUCCIÓN

El control de la calidad de las aguas es vital para la protección de la salud humana y la

biodiversidad en el ambiente acuático. Varios microorganismos son utilizados como

indicadores de contaminación fecal para este propósito, dentro de ellos los enterococos son

considerados buenos indicadores, porque sobreviven más tiempo ante condiciones adversas en

la naturaleza.

En relación con el estándar de calidad del agua. La presencia de más de un organismo

Coliforme por 100 ml es suficiente para que el agua se considere como no potable. Las

bacterias coliformes, como grupo, no tienen el mismo significado en los alimentos que en el

agua. Se han instituido normas de coliformes para determinados alimentos. Como es el caso de

la leche cruda certificada y la leche pasteurizada. Muchos bacteriólogos consideran que la

investigación del grupo coliforme en los alimentos tiene escasa significación y que únicamente

se debe valorar desde el punto de vista de la calidad, la presencia de Coliformes Fecales (E.

coli).

II.OBJETIVOS

 Determinar la presencia o ausencia de bacterias indicadoras, utilizando distintos

medios de cultivo.
 Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua.
 Organizar e interpretar los resultados

2
 III.FUNDAMENTOS

 Calidad de aguas

La calidad biológica de las aguas es un modo de definir la riqueza biológica y el valor

ambiental de las comunidades de seres vivos asociados al ecosistema de un curso fluvial, o de

un tramo concreto de él. Todos los seres vivos necesitan agua para su supervivencia, con una

adecuada calidad. Entre los contaminantes naturales del agua se encuentran virus, bacterias y

otras formas de vida; especies minerales disueltos; productos orgánicos solubles y sólidos

orgánicos e inorgánicos suspendidos. Un alto riesgo de contaminación representa el agua

potable que contenga material fecal. Uno de los problemas sanitarios más críticos en los países

de América Latina y el Caribe es la descarga incontrolada de aguas residuales domésticas sin

tratamiento, las cuales contaminan los recursos hídricos superficiales, subterráneos y las zonas

costeras. La eliminación inadecuada de excretas, dada por la ausencia o el deficiente sistema

de alcantarillado y tratamiento, están asociados a la contaminación del agua y causa

numerosas enfermedades, tales como el cólera, la amebiasis, la hepatitis, la fiebre tifoidea y

paratifoidea, entre otras[CITATION Jer13 \l 10250 ].

Las bacterias indicadoras

 Deben ser adecuadas para analizar todos los tipos de aguas.

 Deben ser inocuas para los seres humanos.

 Deben estar presentes siempre que hay contaminación fecal.

 Deben perdurar más en el agua que las bacterias patógenas entéricas.

3
 El nivel de la bacteria indicadora en el agua debe guarder una relacion directa con el grado

de contaminacion del agua:

Clasificación de bacterias indicadoras

Coliformes

Las bacterias Coliformes, un grupo de bacterias estrechamente relacionadas al suelo

(siembra), el agua y el tracto intestinal de los animales, se han utilizado como indicadores de

condiciones insalubres en la producción de alimentos y bebidas durante más de un siglo. Hoy

en día, el recuento de Coliformes es un indicador higiénico frecuente en varias industrias de

alimentos y bebidas.

El término Coliforme no tiene un estado taxonómico, pero los Coliformes se caracterizan

por ser barras anaerobias gramnegativas que no forman esporas, definidas por su capacidad

para fermentar la lactosa para producir ácido y / o dióxido de carbono gaseoso. Ejemplos de

géneros considerados como coliformes incluyen: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia y

Klebsiella.La Coliforme más conocida, Escherichia coli (E. coli), es un residente común de los

intestinos de los animales de sangre caliente, pero también se puede encontrar en el entorno

natural y transmitirse a las instalaciones de fabricación de alimentos, así como a fuentes de

agua potable. La mayoría de E. coli es inofensiva, pero algunas cepas pueden causar

intoxicación alimentaria grave y enfermedades.

En lugar de buscar una especie específica, la prueba de Coliformes ofrece una visión más

amplia de los organismos en los ingredientes, los productos terminados y el entorno de

producción en general. De esta manera, los coliformes sirven como "organismos indicadores",

4
y las pruebas de su presencia en general en lugar de un género o especie individual pueden

significar que existen condiciones antihigiénicas que pueden albergar organismos patógenos.

Si un área de muestra está bajo control, el número de estos organismos indicadores estaría

contenido en cantidades relativamente pequeñas.

En particular, algunos Coliformes se han referido históricamente como Coliformes fecales,

pero desde entonces la investigación ha demostrado que la terminología más apropiada y

actual es la de los Coliformes termotolerantes debido a su tendencia a crecer y fermentar la

lactosa a una temperatura elevada. Mientras que las pruebas de Coliformes termotolerantes se

utilizaron una vez para estimar el número de E. coli en una muestra, algunas E. coli patógenas

(especialmente E. coli O157: H7) no crecen bien a estas temperaturas elevadas, por lo que la

práctica no tiene más que detenido[ CITATION Seg20 \l 10250 ].

Enterococos

El enterococo es un microbio (bacteria). Normalmente vive en los intestinos y en el aparato

genital femenino. La mayoría de las veces, no causa problemas. Pero el enterococo puede

provocar una infección si penetra en las vías urinarias, el torrente sanguíneo, las heridas de la

piel u otros sitios estériles. La vancomicina es un antibiótico que se utiliza a menudo para

tratar estas infecciones. Los antibióticos son medicamentos que se emplean para matar a las

bacterias. Los microbios enterococos pueden hacerse resistentes a la vancomicina y por lo

tanto no los mata. Estas bacterias resistentes se denominan enterococos resistentes a la

vancomicina (ERV). Los ERV pueden ser difíciles de tratar debido a que hay menos

antibióticos que pueden combatir las bacterias. La mayoría de las infecciones por ERV ocurre

en hospitales[CITATION Mil20 \p 25-27 \l 10250 ].

5
Métodos clásicos empleados en la identificación y enumeración de coliformes

Técnica de fermentación en tubos múltiples

La técnica de fermentación en tubos múltiples (FTM) para enumerar coliformes se ha usado

durante alrededor de 80 años como método de monitoreo de la calidad del agua. El método

consiste en inocular una serie de tubos con diluciones decimales de la muestra de agua. La

producción de gas, formación de ácido o abundante crecimiento en los tubos después de 48 h

de incubación a 35 ºC constituyen resultados presumiblemente positivos. Todos los tubos con

reacción presumiblemente positiva son inmediatamente sometidos a pruebas de confirmación.

La formación de gas en caldo lactosado bilis verde brillante en los tubos de fermentación tras

48 h de incubación a 35 ºC constituye una prueba de confirmación positiva. La prueba de

coliformes fecales usando medio Escherichia coli (EC), puede aplicarse para determinar

coliformes totales y fecales, la producción de gas después de 48 h de incubación a 44,5 ºC en

caldo EC se considera un resultado positivo. Los resultados de la técnica FTM se expresan en

términos del número más probable (NMP) de microorganismos presentes. Este número se

estima estadísticamente del número medio de coliformes en la muestra. Como consecuencia

de lo anterior, esta técnica ofrece una enumeración semicuantitativa de coliformes y la

precisión de la estimación es bastante baja y depende del número de tubos usados para el

análisis. Esta técnica carece de precisión en términos cualitativos y cuantitativos y el tiempo

requerido para obtener los resultados es mayor que el necesario cuando se utiliza la técnica de

filtración por membrana (FM), la cual ha reemplazado en muchos casos a la técnica de FTM

debido a la sistematicidad de los exámenes de agua potable. Sin embargo, la FTM resulta muy

6
útil cuando se analizan muestras muy turbias o coloreadas en las cuales no es posible utilizar

la filtración por membrana[CITATION Mil20 \p 28 \l 10250 ].

Técnica de filtración por membrana

La FM está completamente aceptada y aprobada como procedimiento para el monitoreo de

la calidad del agua en muchos países. Este método consiste en la filtración de la muestra de

agua a través de una membrana estéril con un poro de diámetro igual a 0,45 µm, el cual retiene

las bacterias. Esta membrana se incuba sobre la superficie de un medio selectivo y

posteriormente, se enumeran las colonias típicas crecidas sobre la membrana.Los medios de

cultivo más utilizados para el análisis de agua potable son el medio m-Endo-Type en América

del Norte y el medio Tergitol-TTC en Europa.Las bacterias coliformes forman colonias rojas

con brillo metálico en medio Endo-Type que contiene lactosa (incubación 24 h a 35 ºC para

coliformes totales) o colonias amarillonaranjas en medio Tergitol-TTC (incubación 24 y 48 h

a 37 y 44 ºC para coliformes totales y termotolerantes respectivamente). Otros medios muy

utilizados son el agar McConkey y el medio Teepol. Comparaciones entre diferentes medios

han mostrado que el agar m-Endo produce mayores conteos que el agar McConkey o el

Teepol[CITATION Mil20 \p 28-29 \l 10250 ].

 Caldo lactosado 
El caldo lactosado es un medio de cultivo líquido, no selectivo, utilizado principalmente

como medio de pre-enriquecimiento en el aislamiento de cepas de Salmonella provenientes del

análisis microbiológico realizado a alimentos procesados, productos lácteos o agua

 Caldo azida

7
 El Caldo Azida Dextrosa se emplea para la detección y enumeración de

enterococos/estreptococos en agua, aguas residuales, alimentos y otros materiales. El medio

contiene azida sódica, que inhibe el crecimiento de la flora acompañante en bacterias Gram

negativas y permite el crecimiento de enterococos[ CITATION Ano19 \l 10250 ].

 Prueba presuntiva
Consiste en un procedimiento de criba en el que una reacción negativa excluye la presencia

del grupo coliforme y una reacción positiva indica su posible presencia. Dispondremos de un

matraz con 50 ml y dos series de tubos conteniendo 10 y 1 ml respectivamente de caldo

MacConkey, y provistos de una campaNa de recogida de gases (campana Durham). Mediante

pipetas estériles, se siembran el matraz y las dos series de tubos con un volumen igual de agua

ya homogeneizada debido a ello el medio deberá prepararse a doble concentración. Después

de la siembra, será necesario una buena homogenización de los tubos que se llevaran a incubar

durante 24 h a 37ºC.

IV.MATERIALES

MATERIALES DESCRIPCION REPRESENTACIÓN

MATERIA PRIMA

8
 1L=1000 ml
leche fresca de vaca

Cultivo lácteo comercial 100lts

UTENSILLOS

100 °C

Termómetro

Olla o tazón especial 1 lt = 1000 ml

100 ml
Frascos de vidrio con tapa
estériles

9
Cuchara de Madera 1

Medida: 250ml
Vaso medidor (ml)

EQUIPOS

Cocina a gas 1

Cámara de refrigeración refrigeración

10
Cámara de incubación Incubación

Algodon Desinfectante

Agua destilada 100 ml

11
 9 ml
Campana durham

Matraz erlenmeyer 500 ml

Espatula 1 por grupo

Materiales de laboratorio proporcionado por la universidad:

Caldo lactosado

12
Purpura de bromocresol

Incubadora

Autoclave

Balanza analitica

Probeta

13
 Gradilla

Safranina

Lugol

Cristal violeta

Alcohol acetona

Vestimenta de laboratorio:

14
 Guardapolvo

Cofia o gorra

Cubrebocas o mascarilla

Guantes

V. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS

Para cada tipo de bacteria ya sea Coliforme (Bacterias gram negativas, aerobias

facultativas, que fermentan la lactosa con producción de ácido o gas) o enterococos fecales
15
(bacterias gram positivas, anaerobias aerotolerantes que carecen de citocromos y hacen

fermentación láctica), se realizaran 2 pruebas una presuntivas y otra confirmativas.

Prueba presuntiva

 Para la detección de bacterias coliformes se usa caldo lactosado con campana de

Durham y purpura de bromocresol como indicador de pH.

 Para los enterococos fecales se usa el caldo de azida Rothe.

 El azida es un inhibidor de la enzima citocromo c oxidasa, impide el funcionamiento

de la cadena transportadora de electrones por lo tanto el azida no inhibe el crecimiento

de los enterococos fecales.

16
 Se parte en una muestra de agua 100 ml que queremos determinar si está contaminada.

 Se inoculan tubos de 10 ml de medio con 3 volúmenes diferentes de agua, 10 ml, 1ml,

0.1 ml.

17
 Se hacen 3 réplicas es importante tener en cuenta que el medio que sea inoculado con
10 ml de agua tiene que prepararse a doble concentración.

 El mismo paso se repite para los enterococos fecales.

18
  Los tubos se introducen una incubadora de 37 grados centígrados durante 24 y 48
horas

Análisis de Resultado

 Prueba presuntiva coliforme

Después de la incubación, si la muestra existe en coliformes se producirá gas que quedará

atrapado dentro de la campana. El medio habrá mirado de Violeta amarillo debido a la

acidificación por la fermentación. Por tanto, si en los tubos aparece gas atrapado en las

campanas y el medio ese color amarillo se considera positiva.

19
  Prueba presuntiva para enterococos fecales

Si el caldo se ha vuelto turbio debido al crecimiento bacteriano se considera positiva. La

turbidez se aprecia mejor si se agita levemente y compara con otro no inoculado

20
Pruebas confirmativas

 Para las coliformes, consiste el crecimiento un caldo verde brillante conteniendo

lactosa, sales biliares y verde brillante esos dos últimos compuestos inhiben el

crecimiento de bacterias no entéricas.

21
 A partir de cada tuvo positivo de la prueba presuntiva se inocula 0.1 ml en caldo con

verde brillante. Es importante anotar que tuvo de caldo lactosado se inoculan cada tubo

con verde brillante ya que esta prueba se utiliza para confirmar que los tubos

presuntamente positivos lo son en realidad.

22
 Para los enterococos fecales, las pruebas son de varios tipos, pero la más común es

la tinción de Gram.

 Los caldos de la prueba confirmativa de coliformes se introducen en un incubador

37 grados centígrados durante 24 horas.

23
Análisis de resultados

 Para coliformes.

Sí en los tubos aparece gas atrapado en las campanas se considerará positiva.

 Para enterococos fecales.

24
Si se observa enterococos Gram positivos en cadenas, se considera positiva.

25
Para estimar la concentración de celulas de la muestra original se aplica la tecnica estadistica
del numero más probable, para ello se cuenta los positivos por replica y teniendo en cuenta la
concentración de donde proviene se busca el resultado en la tabla del estadistico.

26
 VI. ANALISIS Y DISCUSIONES

En la prueba

0 0 1 3 <0.5 9 presuntiva
0 1 0 3 <0.5 13
que se llevó a
1 0 0 4 <0.5 20
cabo 1 0 1 7 1 21 pudimos
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36 notar la
1 2 0 11 3 36 presencia de
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 36 coliformes
2 1 0 13 3 37
después de
2 1 1 20 7 44
2 2 0 21 4 89 observar
2 2 1 23 10 47
3 0 0 23 4 149 COLIFORMES
3 0 1 39 7 120
3 0 2 34 15 130
3 1 0 43 7 379 ENTEROCOCOS FECALES
3 1 1 73 14 210
3 1 2 120 30 230
3 2 0 93 15 340
3 2 0 130 30 440
3 2 1 210 33 470
3 3 2 240 36 1300
3 3 0 440 72 2400
3 3 1 1100 150 4300
3 3 2 >2400 - -

27
burbujas o gas en el fondo de la campana de Durham, debido a la fermentación lactosa con

producción de ácido y de gas a 37°C que producen los coliformes. En cuanto a los enterococos

fecales la prueba también resulto positiva por lo turbio que se torno el caldo, debido a que el

caldo de acida no inhibe la aparición de enteroccos fecales.

Finalmente para confirmar la presencia o crecimiento de coliformes y enterococos se

utilizaron caldo verde brillante y tinción de gram respectivamente; dando como resultado final

positivo para ambas bacterias; y que no todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se

hizo necesario desarrollar pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como

indicadores de contaminación[ CITATION Pra13 \l 10250 ].

VII. CONCLUSIONES

Como conclusión hemos podido determinar que la práctica de laboratorio observada,

concuerda con la teoría averiguada, además, atreves de las investigaciones nos hemos dado

cuenta que los coliformes son más resistentes que las bacterias patógenas intestinales y porque

su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia indica que el agua es

bacteriológicamente segura.

Además, también evidenciamos y comprobamos que la acidez disminuye el contenido de

microorganismos y que la materia orgánica la aumenta.

La presencia de bacterias coliformes en el agua no garantiza que beber el agua causara una

enfermedad. Más bien su presencia indica que existe una vía de contaminación entre una

fuente de bacterias y el suministro de agua. Las bacterias que causan enfermedades pueden

utilizar estas vías para entrar en el suministro de agua.

28
 VIII. RECOMENDACIONES.

En caso de realizar el experimento se recomienda las siguientes acciones:

 Ingresar al laboratorio puesto los utensilios personales como el guardapolvo, los

guantes, las mascarillas, la cofia, entre otras.

 Tener todo los materiales requeridos y necesarios por la guía para no tener

inconvenientes en la práctica.

 Siempre tener mucho cuidado con los equipos, reactivos y materiales que estamos

utilizando, en los equipos como la balanza analítica, estufa eléctrica; y en los

materiales como bureta, soporte universal, pinza de bureta, matraz Erlenmeyer,

probeta de 500 ml, vaso precipitado de 10 ml y 100 ml, entre otras.

 De forma general, hay que familiarizarse con los elementos de seguridad

disponibles (debe conocerse la localización de extintores, mangueras, duchas de

seguridad y lavaojos) y estar al tanto de las salidas principales de emergencia, las

cuales deben respetarse y evitar que sean invadidas por objetos innecesarios.

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 Bibliografía

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