Amplificacin de DNA in

vitro:
PCR (Polymerase Chain
Reaction)

Laboratorio de Gentica
BIOL 3300L

Objetivos
Conocer:

Los fundamentos de la tcnica de amplificacin de

DNA por PCR

Usos y aplicaciones del PCR

Ventajas y desventajas del PCR

Mtodos de secuenciacin de DNA

PCR
Polymerase Chain
Es la amplificacin
de DNA in vitro por medio de la
Reaction
polimerizacin en cadena de DNA utilizando un

termociclador.
El

propsito del PCR es hacer muchas copias de un

fragmento de DNA.

Se

realiza la amplificacin de un segmento especfico

de DNA, teniendo poco material disponible.

Polimerasa Chain Reaction:

Reaccin en Cadena de la
Polimerasa

Fue diseada por el Dr.

Kary Mullis en 1987.

Gan el premio Nbel de

Qumica en 1993 por su
invento.

Utilizo el PCR para

amplificacin del gen de
-hemoglobina humana, y
el diagnostico prenatal de
anemia falciforme.

Termociclador
La

PCR se realiza
en un Thermo
Cycler
Termociclador.
Es

una mquina
que calienta y enfra
la reaccin en
periodos cortos de
tiempo.

El proceso de PCR incluye 3 pasos

bsicos que se repiten 25 veces o ms:
1. Desnaturalizacin: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla
en hebra sencilla.
-Tpicamente se usa una temperatura de 95C - 97C, por 15 a 40 segundos el
tiempo depende del tamao del genoma-

2. Apareamiento o anneling:

Los cebadores primers previamente diseados,

reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan
en lugares especficos por complementariedad de
bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55C
por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo
puede variar entre cebadores segn sea el caso.

3. Polimerizacin o Extensin.
Una Polimerasa de DNA extiende los primers, en el
espacio comprendido entre ambos primers, y coloca
dinucleotidos trifosfatados (dNTPs) de 5a 3 leyendo el
DNA de 3a 5. De estas forma sintetiza la secuencia
complementaria de las hebras de DNA molde
Se efecta a 70C por 1 minutos (puede variar segn
sea necesario)

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

En el PCR hay una amplificacin

exponencial

Reactivos necesarios para

Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH
PCR:
8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.

MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se

usa 25mM -Es un cofactor para la funcin de la
polimerasa dNTPs (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP,
dCTP, dTTP.
-La concentracin de dNTPS, es proporcional al tamao
del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a
amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb,
necesitamos ms concentracin de dNTPS para el de
5500pb.
-Generalmente, se usa una concentracin de 200M de
cada uno.

Reactivos necesarios para

PCR:
Cebadores primers: Son secuencias cortas

de nucletidos 20-24 nucletidos de longitud,

complementarias a una regin del DNA que se
quiere amplificar. -Se usa a concentracin de
1MDNA molde: El DNA a amplificar puede tener
desde 50 a 2,000 nucletidos de longitud.
El mnimo va de 10-100 ng. y el mximo entre
400-500 ng.
Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades
por reaccin.

ADYUVANTES DE LA PCR

Son elementos que mejoran el rendimiento y la

especificidad de la PCR.

Se usa DMSO, glicerol o BSA.

El adyuvante ms utilizado es el BSA. A

concentraciones por encima de 0.8 g/l el BSA
incrementa la eficiencia de la PCR ya acta como
una protena captadora de iones que pueden ser
inhibidores de la Taq polimerasa

Polimerasa

En un principio, la polimerasa de DNA que

se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero

esta es sensitiva a alta temperatura, por lo
que haba que aadir enzima fresca al
comenzar el tercer ciclo.

Se

reemplazo la enzima por la de la

bacteria Thermus aquaticus conocida
como Taq pol

Anlisis de la Muestra

La deteccin del producto de la PCR se realiza

normalmente mediante corrido electrofortico.

Dependiendo del tamao de la amplificacin y la

resolucin que deseemos utilizaremos diferentes
medios
(agarosa,
poliacrilamida)
a
distintas
concentraciones.

Anlisis de la Muestra
La posterior visualizacin se puede realizar con
bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de
plata, fluorescencia, radioactividad
Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas (primers
inespecficos se pegan a
varios sitios)

Anlisis de la Muestra

En algunos casos, los productos

amplificados poseen secuencias que son
reconocidas por endonucleasas
Hibridacin, Southern Blot

Se puede amplificar directamente de:

ADN genmico

cDNA (RT-PCR)

Aplicaciones
Deteccin de agentes infecciosos como: hepatitis B
y C, papiloma virus, HIV, entre otros
Anlisis de DNA de cualquier organismo vivo o
muerto, anlisis de fsiles

Mutagnesis dirigida (cambios en la informacin

contenida a travs de primers con mutaciones)

Investigacin forense

Pruebas de paternidad

Aplicaciones
Criminalstica

Ejemplo de un caso de
criminalstica resuelto
utilizando electroforesis en
gel vertical de acrilamida.

Si se observan los patrones

bandas podr comprobarse
como los perfiles obtenidos
en las manchas de sangre
encontradas en el sombrero
(Hat) y pantaln (Jeans) del
sospechoso (S) coinciden
con el perfil gentico de la
vctima (V)

Utilidad del PCR

Ventajas del PCR

A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener

una cantidad considerable para el estudio que se vaya a
realizar.

El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y

anlisis.

Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o

muerto.

Sus aplicaciones son mltiples: medicina forense,

diagnsticos, anlisis prenatales, etc.

Desventajas del PCR

Se puede reproducir solamente partes del genoma en

donde se conoce por lo menos una mnima secuencia de
20 40 pb.

Se necesitan primers especficos que sean

complementarios al fragmento que se desea sintetizar.

La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN

Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo

investigador o de cualquier otro)

Materiales Para PCR

Termociclador Thermo cycler

Microcentrfuga

Micropipetas de 2, 20 y 200 ul

Microtubos para PCR, estriles

Puntas estriles

Agua destilada, desionizada y

estril

ADN molde (ADN en estudio)

Primer Forward y Reverse

dNTPs (dATP, dTTP, dCTP,

dGTP de [25 M] c/u)

10X buffer para PCR (Solucin

amortiguadora para PCR)

MgCl2 (25 mM)

BSA

Polimerasa Taq

Fenotipo Puertorriqueo

Herencia del DNA

mitocondrial

Amplificaremos una region hipervariable. Genoma de

16571 pares de bases: Hebra pesada (H), Hebra liviana
(L). Primer Directo H34, primer reverso L15829

Procedimiento para extraccin

del DNA genmico
(previamente
realizado)
Se realiz un frotis bucal

El contenido del hisopo swab se resuspende en 1000ul de NaCl 0.9%

Centrifugar por 5 minutos a 7K

Descarta sobrenadante

Resuspender el precipitado pellet en 500ul de chelex al 10%

Incubar a 100C por 20 minutos

Centrifugar por 5 minutos a 7K

Tomar el sobrenadante ( DNA en solucin)

Dejar la muestra a -20 grados hasta cuando se va a trabajar con ella

Nota: El chelex acta como agente desestabilizador de membranas y quelante.

Diagrama de la extraccin del DNA genmico

(previamente realizado)

Procedimiento para amplificar el

DNA (PCR)

Aada los siguientes reactivos en el orden indicado:

Cantidad (ul)

Mix 1
17.3

Mix 2
2.7

Componente

10.3

Agua estril (dH2O)

3.0

MgCl2 25mM

0.5

BSA 100X

1.5

2.5 Mm de dNTPs

1.0

Primer H34. 5-3

1.0

Primer L15829. 3-5

2.5

Buffer 10X

0.2

Taq pol

5.0

DNA en estudio

Total: 25 ul

Condiciones para reaccin en el

termociclador:

1 ciclo : 94C por 2.5 minutos.

32 ciclos: 94 C por 30 segundos
54 C por 1 minutos
72 C por 70 segundos
1 ciclo: 72 C por 10 minutos

Lleve a reaccionar en el termociclador.

Secuenciacin de DNA
Mtodo enzimtico de terminacin de cadena
(mtodo dideoxi de Sanger)
Polimerizacin interrumpida de ADN
Se lleva a cado polimerizacin de ADN en
presencia de derivados dideoxi que detienen
la polimerizacin en diferente momento,
obtenindose fragmentos de diferente tamao.
Se examinan en electroforesis, se lee
secuencia directamente del gel

Mtodo dideoxi de Sanger

Mtodo dideoxi de Sanger

(2)

Mtodo dideoxi de Sanger

(3)

Mtodo secuenciacin
automtica

Electroferograma de la
secuenciacin automtica

Geles de secuencia

Secuencia automtica

Secuencia Manual

Direcciones de animaciones
Direccin PCR
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisa
mples/molecularbiology/pcr.html
Direccin de secuenciacin
http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03EstructuraDelGenoma/animaciones/
secuencia.swf