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Christel Benoit Vivas

Histoqumica Inmunohistiqumica Inmunohistoqumica enzimtica. PCR Hibridacin in situ Citometra de flujo. Electroforesis.

HISTOQUMICA
Tcnica de preparacin de los tejidos para poder ser observados al microscopio, el la cual tien con sustancias qumicas solubles en agua o aceites cada uno de los compuestos celulares. Es la tcnica ms utilizada para el diagnstico de las enfermedades de los tejidos extrados del cuerpo.

HISTOQUMICA

HISTOQUMICA

HISTOQUMICA

HISTOQUMICA

HISTOQUMICA

HISTOQUMICA

HISTOQUMICA

Azul de toluidina

H&E

Negro Sudn

Fontana Masson

Hematoxilina frrica

Cajal

Van Geison

Mucicarmn

PAS

Papanicolau

Zeihl Neelsen

Grocot

Rojo Congo con luz polarizada

PCR

PCR

La Reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls, es una tcnica de biologa molecular (descrita en 1985, 1985, por Kary Mullis), cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo, en teora, de una nica copia de ese fragmento. fragmento.

PCR
Esta tcnica sirve para amplificar ADN. ADN. Tras la amplificacin, resulta mucho ms sencillo identificar con una muy alta probabilidad virus y/o bacterias causante de una enfermedad, identificar personas (cadveres, criminales...) o hacer criminales...) investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. amplificado.

PCR
Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. cabo.

PCR
Su principio se basa en el uso de oligonucletidos sintticos que son complementarios a secuencias que flanquean una regin especfica de ADN molde. molde.

PCR
Por medio de ciclos de amplificacin repetidos, que comprenden cambios de temperatura que permiten el alineamiento de los oligonucletidos. oligonucletidos. En s, es un proceso qumico ms que un proceso biolgico, que permite diagnosticar las enfermedades a nivel

PCR
El proceso del PCR consta de un nmero de ciclos para amplificar al secuencia espcfica de ADN; cada ciclo tiene tres pasos sucesivos: 1. Desnaturalizacin 2. Renaturalizacin 3. Sntesis

PCR

Los componentes ms importantes para el PCR son la ADN polimerasa, los primers (oligonucletido corto que hibridiza con un blanco), dNTP (trifosfato desoxinucletido), el amortiguador y el ADN blanco.

PCR

Las condiciones de los ciclos trmicos son los siguientes: Desnaturalizacin Reconocimiento Extensin Nmero de ciclos 95Cx1min 55Cx1min 72Cx2min 40

PCR
Sus aplicaciones dentro de la odontologa han sido ampliamente desarrolladas, ya que debe conocerse la secuencia de base por amplificar o parte de esta. Permite implementar un tratamiento adecuado debido a la facultad de los diversos virus para permanecer latentes dentro del organismo.

PCR
El PCR ha sido utilizado para confirmar la presencia de agentes infecciosos en los tejidos humanos tales como el virus del papiloma humano (VPH), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de hepatitis B, citomegalovirus, virus del Epstein Barr y el virus del herpes simple.

PCR

Para que la tcnica funcione se necesita, abundante suministro de de bases de nucletidos y dos cebadores, cebadores, que son secuencias cortas de unos veinte nucletidos y que se usan para iniciar la reaccin (PCR). (PCR).

PCR

En primer lugar, se calienta la mezcla para separar las hebras de ADN (el ADN se abre) y a continuacin se enfra la solucin, lo que permite que los cebadores se peguen a las partes adecuadas de la hebra de ADN (chocan unas a otras hasta que encuentran el complemento exacto, y entonces se ensamblan, actuando como lmites de la regin de la molcula que va a ser duplicada).

PCR

Para terminar, se aumenta la temperatura hasta el valor en que puede actuar la polimerasa, y sobre la plantilla crece una hebra nueva complementaria

PCR

USOS


PCR

Huella gentica Test de Paternidad Diagnstico de enfermedades hereditarias Clonacin de genes Mutagnesis Anlisis de ADN fsil Genotipo de mutaciones especficas

PCR

CMF

La Citometra de Flujo (CMF) es una tcnica de anlisis celular multiparamtrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensin de partculas (generalmente clulas) alineadas y de una en una por delante de un haz de lser focalizado. El impacto de cada clula con el rayo de luz produce seales que corresponden a diferentes parmetros de la clula y que son recogidos por distintos detectores.

CMF

Estos convierten dichas seales en seales electrnicas que posteriormente sern digitalizadas para permitir la medida simultnea de varios parmetros en una misma clula.

CMF

Los parmetros son:




Relacionados con caractersticas intrnsecas de la clula, como su tamao y la complejidad de su ncleo y citoplasma.

Relacionados con caractersticas antignicas de cada clula (inmunofenotipo). Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una clula por medio de sus caractersticas antignicas y/o por sus caractersticas morfolgicas de tamao y complejidad.

CMF

Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una clula por medio de sus caractersticas antignicas y/o por sus caractersticas morfolgicas de tamao y complejidad.

CMF

CMF

LECTURA

Las seales producidas por la interaccin de las clulas con el haz de luz son de dos tipos: - Seales de dispersin. - Seales de fluorescencia.

CMF

LECTURA
a) Seales de dispersin: Resulta de la interaccin de la luz con una partcula que produce un cambio de direccin (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio. Las caractersticas morfolgicas que determinan la dispersin de la luz son fundamental-mente el tamao celular, la membrana, el ncleo y el material granular del interior de la clula, llamado complejidad.

CMF

LECTURA
En los Citmetros de Flujo se miden dos fracciones de dispersin: -La luz dispersada en ngulo cnico pequeo (0-10) que casi coincide con la direccin de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al tamao de la partcula que produce la dispersin. -La luz dispersada en ngulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna de la partcula. sus caractersticas morfolgicas de tamao y complejidad.

CMF

CMF

LECTURA
b) Seales de Fluorescencia: Un fluorocromo es una molcula qumica que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energa) y emite a una longitud superior (menor energa). El espectro de absorcin o excitacin es el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro de emisin es el rango sobre el que un fluorocromo emite luz.

CMF

LECTURA
Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitacin procedente del lser emite energa radiante. Debido a que parte de la energa se utiliza para la absorcin, la luz emitida es de menor energa que la luz de excitacin, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorcin y emisin se denomina Stokes shiff.

CMF

LECTURA
Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitacin procedente del lser emite energa radiante. Debido a que parte de la energa se utiliza para la absorcin, la luz emitida es de menor energa que la luz de excitacin, es decir la longitud de onda emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorcin y emisin se denomina Stokes shiff.

CMF

CMF

Caractersticas
La CMF es una tcnica sencilla que se aplica en la rutina diaria de muchos laboratorios clnicos y de investigacin, capaz de proporcionar resultados de forma rpida que pueden ser aplicables al diagnostico.

CMF

Caractersticas
Gracias a su gran especificidad es capaz de distinguir entre varias poblaciones celulares diferentes, y detectar una poblacin celular en una muestra en la que predominan otras poblaciones celulares mayoritarias. Pero la principal caracterstica de la CMF es que puede ofrecer informacin simultnea de varios parmetros de cada una de las clulas analizadas y la relacin entre los parmetros de una clula y los de otra clula tambin analizada.

CMF

Caractersticas
Permite el anlisis de dos parmetros de dispersin, SSC/FSC y tres de fluorescencia (en equipos con un solo lser), Fl1, Fl2 y Fl3, y de una cuarta fluorescencia en equipos con dos lsser.

CMF

Ventajas e inconvenientes

Debido a la necesidad de utilizar una suspensin de partculas (clulas, ncleos, cromosomas, etc), para ser ledos de una en una hace que se pierda informacin sobre la arquitectura de los tejidos que componen las clulas o de las propias clulas, as como la interaccin entre estas y el medio que las rodea (patrones nodulares o difusos de los linfomas).

CMF

Ventajas e inconvenientes
La CMF presenta mltiples ventajas frente al microscpio de fluorescencia y las tcnicas citoqumicas, como: - Posibilidad de empleo de multiples marcajes frente a un solo marcaje de la citoqumica y la microscopia de fluorescencia. - Posibilidad de analizar un elevado nmero de partculas en un corto perodo de tiempo (5000 partculas/segundo).

CMF

Ventajas e inconvenientes
de cuantificar la intensidad antignica por medio de los canales medios de fluorescencia.
-Posibilidad -

- Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad mnima residual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normales como los basfilos.
-

CMF

Ventajas e inconvenientes
- Posibilidad de analizar poblaciones celulares y epitopos celulares. - Permite almacenar informticamente la informacin del anlisis para poderla utilizar en cualquier momento y reanalizar anlisis hechos con anterioridad. - Posibilidad de cuantificar las molculas antignicas presentes en un grupo celular

IHQ

Inmunohistoqumica
Tcnica utilizada para el diagnstico de diferentes enfermedades adems de permitirnos identificar el origen celular de una manera ms precisa de los diferentes tipos de neoplasias, determinando los fenmenos de benignidad o malignidad en las neoplasias y que permite identificar diferentes antgenos especficos de cada uno de los grupos celulares caractersticos.

IHQ

Las tcnicas de inmunohistoqumica (IHQ), se basan en la reaccin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac), y consisten en incubar el Ag que queremos detectar, (en este caso la PrPCJD ), frente a un Ac (anti-PrPCJD); y mediante un sistema de amplificacin junto con el empleo de un sistema revelador; esta unin pueda ser visualizada al microscopio ptico

IHQ

Corresponde a un grupo de tcnicas de inmunotincin que permiten demostrar una variedad de antgenos presentes en las clulas o tejidos utilizando anticuerpos marcados. Estas tcnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse especficamente a los correspondientes antgenos. Esta reaccin es visible slo si el anticuerpo est marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o produce coloracin.

IHQ

Inmunohistoqumica convencional Inmunofluorecencia Inmunoperoxidasa

IHQ

IHQ

En las tcnicas de inmunofluorescencia se utilizan como marcadores compuestos de fluorescena que bajo luz ultravioleta emiten luz de longitud de onda visible, que depende de la naturaleza del compuesto. El isotiocianato de fluorescena emite luz verde amarillenta intensa. Estas tcnicas necesitan muestras en fresco y congeladas, sin fijacin convencional, pues los antgenos estn presentes en superficies celulares o son muy lbiles a la fijacin en formalina. .

IHQ

La inmunofluorescencia directa, es decir con anticuerpos conjugados con fluorescena, se aplica corrientemente en el diagnstico de las enfermedades cutneas en donde tiene indicacin y utilidad muy precisas como en enfermedades ampollares, vasculitis y mesenquimopatas . Esta tcnica pese a ser muy sensible, presenta inconvenientes como la falta de permanencia de la fluorescencia, requiere de microscopa especializada y el detalle morfolgico es pobre. Para documentar cada caso, es necesario fotografiar la reaccin.

IHQ
Anticuerpo ME7 IB4 IB3 IA8 RO73 611 1755 SP30 SP40 3F4 PrP Nott KG9 Antgeno Scrapie fibrillas Fuente Dr. J. Hope (Edinburgo)

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Hamster prion Dr. S. Prusiner(California)

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Pptido sinttico Pptido sinttico Dr. H. Diringer(Berlin) Prof.B. Anderton(London)

"
Pptido sinttico Pptido sinttico PrP bovina recombinante Dr. Kascsak(New York) Prof. R.J. Mayer Dr. C. Birket(crompton)

IHQ EJEMPLOS DE MARCADORES INMUNOHISTOQUIMICOS Anticuerpo celular CD1a CD4 CD8 CD30 CD45 S100 HMB-45 AE1 AE3 DESMINA GFAP CEA AFP REN VIM Antgenos detectados clula de Langerhans linfocito T de auxilio linfocito T citotxico clula de Reed-Sternberg leucocitos CD68 macrfagos clulas de Schwann melanocitos citoqueratinas de bajo peso molecular citoqueratinas de alto peso molecular clulas musculares gla antgeno carcino-embrionario alfa-fetoprotena receptores nucleares de estrgenos sarcomas

IHQ

IHQ

Tipos de pretratamiento 80-11% min. 80-11% cido frmico durante 5-60 min. 4M thiocyanato de guanidina (TG) 2h Proteinasa K 10 ug/ml, 15 min., 37C min. 37C Pepsina 10%, 30 min., 37C 10% min. 37C Autoclave hidroltica, 2. 5mM HCl, 10 min., 121C min. 121C Autoclave hidratada, agua destilada, 10 min. 120C min. 120C 30% cido frmico, 1 mim microondas 30% 96% cido frmico, 60 min., 4M (TG), 2h 96% min. Combinaciones entre ellos

IHQ

En las tcnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas ms frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio (color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamene al anticuerpo primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos (secundarios) o sustancias como biotina o protena A.

IHQ

Las tcnicas inmunohistoqumicas enzimticas permite una localizacin ms precisa de las reacciones, ya que la tincin es permanente, estable, puede contrastarse y puede ser evaluada con microscopio de luz. El material as estudiado puede archivarse por aos sin prdida de la intensidad de la reaccin. Los anticuerpos monoclonales ha permitido aumentar la especificidad, sensibilidad y gama de esta tcnica.

IHQ

Desventajas: presencia de reaccin inespecfica, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales, algunos reactivos son potencialmente carcingenos y su manipulacin debe ser cuidadosa, requieren estandarizacin precisa y estricto control de calidad. Existen diversos tipos de tcnicas, cuya indicacin depender del anticuerpo a utilizar (monoclonal o policlonal), material disponible (fresco, congelado o fijado en formalina) y antgenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmticos o nucleares).

IHQ

Estas tcnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente positivos y negativos. El control negativo se obtiene realizando la misma tcnica, pero con omisin del paso de incubacin con anticuerpo primario. Existen sistemas automatizados que permiten la tincin de un gran nmero de casos simultneamente con la ventaja de pasos definidos y estandarizacin de las variable usuales con costo relativamente bajo y en mucho menor tiempo.

IHQ

La

inmunohistoqumica

tiene

utilidad

diagnstica en identificacin de diferenciacin y de marcadores pronsticos de neoplasias (marcadores tumorales). Por ejemplo, es posible la identificacin de los productos de oncogenes y de genes supresores de tumores con anticuerpos monoclonales, especialmente contra c-erbB-2, bcl-2, p21, Rb1 y p53; la identificacin de marcadores de diferenciacin como HMB-45 para melanocitos (melanoma), AE1 para carcinomas, vimentina para sarcomas y CD45 para leuocitos (linfomas).

IHQ

Un elemento importante a considerar es la ptima preservacin del tejido y por ende de los antgenos. La mayora de los antgenos se conservan adecuadamente despus de la fijacin en formalina e inclusin en parafina. Algunos son ms lbiles y slo se detectan en cortes de congelacin.

IHQ

Uno de los problemas actuales con estas tcnicas no es la tcnica en s, manual o automatizada, o la posibilidad de acceder a los numerosos anticuerpos existentes, sino la interpretacin de los resultados. Los errores de interpretacin disminuyen a nivel aceptable cuando el patlogo y sus colaboradores tiene experiencia en estas tcnicas y los resultados se analizan a la luz de los dems hallazgos clnico-patolgicos.

CULTIVOS

Los cultivos celulares constituyen, desde 1950, el sistema ms empleado para el aislamiento y propagacin de la mayora de los virus, hongos y bacterias. Los cultivos de clulas in vitro consisten en un sistema formado por clulas provenientes de un rgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composicin qumica definida y en condiciones de temperatura, pH, aireacin y humedad controladas.

CULTIVOS

La definicin operacional de los cultivos celulares en tres tipos - cultivo primario, cepa celular y lnea celular - depende del origen y tiempo de sobrevida de las clulas in vitro. Los cultivos primarios se preparan a partir de tejidos normales, jvenes, que tienen un cariotipo normal y una capacidad de crecimiento in vitro limitada a 2 3 subcultivos (Ej: pulmn fetal humano, prepucio de recin nacido, amnios humano, etc.) y son ms difciles de obtener.

CULTIVOS

En el otro extremo, las lneas celulares provenientes de tejidos tumorales, con cariotipos heteroploides, pueden subcultivarse en forma contnua y son fciles de mantener in vitro ( Ej: HEp-2, Hela, Vero, RK, etc.). Las cepas celulares tienen una constitucin cromosmica normal y permiten 20 a 50 subcultivos (MCR-5).

MET

La aplicacin de tcnicas de microscopia electrnica ha permitido observar la morfologa de la mayora de los virus que se conocen. En ciertos casos dicha morfologa es caracterstica (adenovirus, rotavirus, coronavirus) y permite la identificacin de la partcula viral, aunque habitualmente la observacin de su morfologa slo sugiere una familia o grupo viral.

MET

El uso de microscopa con tincin negativa mejora la visualizacin de las partculas virales presentes en una muestra. El empleo de la microscopa electrnica tiene algunas limitaciones, como la necesidad de una alta concentracin de partculas virales en la muestra, la disponibilidad de un microscopio electrnico y de un operador experimentado.

MET

Se puede mejorar este mtodo realizando inmunomicroscopa electrnica, en la cual se agregan anticuerpos especficos a la muestra que aglutinan y concentran los virus, haciendo ms fcil de visualizar y permitiendo identificar la partcula viral, pues la reaccin antgeno-anticuerpo es especfica.

Electroforsis

Se pueden detectar algunos virus con genoma segmentado por electroforesis del cido nucleico, observando su patrn de migracin en geles de agarosa o poliacrilamida. El diagnstico de rotavirus representa un buen ejemplo del empleo de esta tcnica, dado que su genoma es RNA segmentado, lo que ha permitido desarrollar un mtodo simple y rpido para su deteccin en deposiciones, que se usa rutinariamente en diversos laboratorios.

Electroforsis

En los virus que no tienen un genoma fragmentado (adenovirus, herpes simplex, citomegalovirus, VRS, etc.) pueden usarse enzimas de restriccin (endonucleasas) que cortan el genoma en secuencias especficas, originando varios segmentos que conforman un patrn de movilidad electrofortica caracterstico que permite identificar al virus y sus variantes genticas . Esta tcnica se usa extensamente en investigacin para estudiar variacin antignica (RFLP: restriction fragment lengh polymorfism)

Electroforesis

Electroforesis

Electroforesis

HIS

Esta tcnica se basa en la capacidad de las molculas de cido nuclico de una hebra de reconocer, por apareamiento de bases, a hebras de cido nucleico que poseen secuencias nucleotdicas complementarias. La deteccin del hbrido puede realizarse usando sondas de cidos nucleicos marcadas. Hay sondas radioactivas en que se visualiza la formacin del hbrido mediante una autorradiografa; otras sondas son biotiniladas, detectndose la formacin del hbrido mediante una reaccin inmunoqumica.

HIS

Otras veces se detectan los hbridos por la diferente velocidad de migracin en geles de electroforesis (heteroduplex). Algunos ensayos se pueden realizar por la tcnica de hibridacin en filtro, que emplea como soporte un filtro de nitrocelulosa sobre el cual se realiza la reaccin. La hibridacin in situ se realiza en un corte de tejido o sobre una monocapa de cultivo celular. Esta ltima tcnica constituye en la actualidad un buen mtodo de diagnstico para el virus papiloma.

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