PREGUNTAS TEORÍA BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA.

1. MUTACIONES.
(ver esquema)

2. PURIFICACIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS (extracción ADN y ARN).

(ver tabla, lo preguntará tipo test)

3. PCR.
3.1. Qué es

La PCR es un método de diagnóstico directo, ya que detecta directamente al agente

infeccioso (su material genético). Además es una técnica de entre 100 y 1000 veces más
sensible que la detección de anticuerpos.

Es una herramienta de diagnóstico que permite amplificar y detectar con rapidez las
secuencias genéticas únicas de cada patógeno.

Los beneficios de este tipo de pruebas son numerosos a causa de que son
extremadamente sensibles, rápidas y proveen resultados en oras, antes que en días o
semanas requeridas por otros métodos convencionales.

Otra def: la reacción en cadena de la polimerasa es una técnica que permite sintetizar
grandes cantidades de ARN o ADN partiendo de cantidades ínfimas de ácido nucleico sin
necesidad de purificación previa. Se amplifica el ácido nucleico mediante replicación in vitro,
obteniéndose múltiples copias que nos proporcionan una cantidad suficiente de este para
poder realizar posteriormente otras técnicas de estudio de biología molecular.

3.2 Para qué sirve

Puede ser usada para detectar organismos infecciosos difíciles (o imposibles) de crecer
en el laboratorio (malaria) o peligrosos para su manejo (VIH/SIDA). Detecta también
organismos resistentes a múltiples medicamentos (tuberculosis).

La PCR permite detectar al agente infeccioso directamente, lo que permite reducir el

“período ventana” (período en el cual no podemos detectar una enfermedad porque los
anticuerpos frente a ella aún no han aparecido).

3.3 Cómo prepararías una muestra de PCR (componentes). (explicado en clase)

● Muestra de ADN molde con la región que queremos amplificar.
● PCR mix:
○ polimerasa
○ cebadores o primers: oligonucleótidos de cadena sencilla que se unen al
ADN molde y sirven de guía para que la polimerasa realice la síntesis de la
cadena complementaria al ADN molde.
○ desoxirribonucleótidos: trifosfatos (dNTPs): 4 tipos, una con cada una de las
cuatro bases nitrogenadas. Son los que va a incorporar la polimerasa para
formar la cadena complementaria.

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 ○ cloruro de magnesio: permite el correcto funcionamiento de la polimerasa.
Hay que controlar su concentración, ya que, a mayor concentración, menor
especificidad de la técnica.
○ tampón para regular el pH.

Componentes PCR mix:

- muestra de ADN (10 µl)
- premix (20 µl)
- dNTPs
- tampón 10x (1o veces más concentrado)
- agua estéril (20 µl)
- taq-polimerasa (lo añade el profesor)
- cloruro de Magnesio (a veces) (viene a parte)
- los cebadores no están en la PCRmix

3.4 Programa de PCR (fases).

(explicado en clase) (ver apuntes prácticas)
El termociclador es el aparato automático programable en que se realiza la PCR. Realiza
controles de temperatura en períodos cortos necesarios para que se lleven a cabo las
distintas etapas de la replicación del ADN.
1. Desnaturalización inicial a 94ºC durante 10 min: separa la doble cadena de ADN
molde.
2. Ciclos que se repiten de 30-40 veces, cada uno de los cuales duplica la cantidad de
ADN.
● 1) Desnaturalización a 94ºC durante 30-40 segundos.
● 2) Anillación o alineamiento de los primers a 50-65ºC (temperatura varía
según el tipo de primer) durante 30 segundos: los primers se unen a las
hebras de ADN molde por los extremos 3´ y 5´.
● 3) Elongación o extensión a 72ºC durante 30-60 segundos: la polimerasa se
une al primer y comienza a sintetizar la copia del fragmento de ADN que
queremos amplificar usando los dNTPs.
3. Elongación final a 72ºC durante 5 min: garantiza que todos los productos se formen
hasta el final.
4. Una vez sintetizadas las cadenas, se conserva la muestra la muestra temporalmente
a 4ºC.
5. Después realizaríamos la electroforesis.

Desnaturalización 94º (10 min)

● *50-65º: anillación de los primers 30 s (depende de la pareja de primers)
● *72º: elongación 30s 1min
● *72º: elongación final 5min
● 4º: almacenamiento temporal
*X30-40: cada ciclo se duplica la cantidad

3.5 Pasos

Partiendo de una muestra con un sustrato ADN de cualquier origen, la PCR consiste en la
repetición cíclica de tres etapas por el siguiente orden:

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 1. Desnaturalización.

Consiste en la separación de cada una de las dos cadenas del ADN sustrato, efecto
que se consigue al incubar la muestra a alta temperatura (93-97º). Las dos cadenas
complementarias permanecerán separadas libres en la disolución hasta que la
temperatura baje lo suficiente (37-60º) para permitir la renaturalización.

2. Hibridación o anillamiento.

En presencia de altas concentraciones de oligonucleótidos sintéticos

(denominados “primers” o cebadores), complementarios a secuencias específicas
del ADN sustrato, el descenso de temperatura previamente citado permite la
hibridación de dichos cebadores a sus secuencias complementarias en el ADN
sustrato. Para la amplificación de una región de “ADN diana”, son necesarios por
tanto, dos cebadores (uno de ellos complementario a una de las cadenas 5´ -3´) y el
otro a la antiparalela (3´ -5´), en zonas que flanqueen el segmento de ADN que
queremos amplificar. Estos cebadores están definidos por tanto por la secuencia del
ADN sustrato y podemos diseñarlos nosotros.

3. Síntesis de ADN (polimerización).

Este paso consiste en la extensión, en dirección 5´ o 3´, del complejo cebador-ADN

sustrato. La ADN polimerasa incorpora desoxinucleótidos monofosfato (dNMPs),
a partir de los trifosfato (dNTPs) presentes en la disolución. Se utiliza generalmente
la denominada Taq polimerasa (extraída de la bacteria termófila Thermus
aquaticus) enzima que posee una temperatura óptima de funcionamiento de 72º.

3.6 Aplicaciones

La PCR es una técnica de múltiples aplicaciones: desde la biología molecular y la medicina

forense hasta el diagnóstico de enfermedades infecciosas y genéticas.

En el diagnóstico de enfermedades infecciosas es muy útil por:

● la rapidez del resultado.

● la especificidad. Se puede determinar no solo si hay infección si no el
microorganismo que la produce.
● la sensibilidad, que permite determinar niveles de infección menores que con otras
técnicas utilizadas en microbiología.

4. TÉCNICAS DE ELECTROFORESIS EN GEL.

4.1 Definición de la técnica (diapositiva 17, tema 4): carga y tamaño.

La electroforesis es una técnica que permite separar compuestos en función de su tamaño

al aplicarles un campo eléctrico.

Otra def: Método de separación molecular en el que el ADN, el ARN o las proteínas se
separan en una matriz de gel según su peso molecular, gracias a la aplicación de un campo
eléctrico para atraer las moléculas a través del gen en una dirección determinada.

3
Teniendo en una mezcla fragmentos de ADN de diferentes tamaños, para su separación se
utilizarán como soporte, geles de determinados polímeros*.

Los geles se diferencian en el tamaño del poro y se comportan como un tamiz que separa
las moléculas en función de su tamaño, carga y polaridad. Estos geles se utilizan
fundamentalmente para la separación de ácidos nucleicos y proteínas.

*Los polímeros más utilizados para la preparación de los geles como soportes en la
electroforesis son:

○ agarosa

○ poliacrilamida

Los geles de agarosa presentan menor resolución que aquellos de poliacrilamida que
permiten separar moléculas de ADN más pequeñas.

A mayor tamaño de molécula → menor migración: los fragmentos de ácidos nucleicos

quedarán más cercanos al origen del soporte.

Recordar que casi todas las biomoléculas poseen una carga eléctrica, y esta varía según el
pH del medio; por esto, se desplazan en un campo eléctrico.

4.2 Electroforesis en gel de agarosa (diapositiva 18)

Usada principalmente para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN o ARN así
como cuantificar el tamaño de dichos fragmentos; o proteínas así como hacerlas pasar por
un gel poroso aplicando un campo eléctrico. El campo eléctrico hace que las moléculas se
desplacen por el gen en una dirección determinada según su carga (la carga dependerá del
pH del medio). El gel presenta poros, de forma que las moléculas avanzarán más o menos
según su tamaño.

Pasos fundamentales:

1. Preparación del gel (con bromuro de etidio o gel red→fluorocromos).

Normalmente utilizamos agarosa al 1%. Para ello necesitamos 100ml de tampón

TBE y 1g de agarosa, que calentaremos al microondas para favorecer que la
agarosa se disuelva. Se deja enfriar a 55ºC (a menos de 40ºC el gel solidifica) y se
añade el bromuro de etidio. El bromuro de etidio tiene que añadirse en frío, en caso
contrario podría desprender gases y se trata de un compuesto cancerígeno.
Posteriormente añadimos el gel al soporte, colocamos el peine (para formar los
pocillos) y lo dejamos solidificar.

2. Carga de la muestra en el gel.

Se cargan en los pocillos que hemos hecho en el gel con el peine. Normalmente se
carga en el primer pocillo el patrón con el que compararemos las muestras.

3. Desarrollo de la electroforesis.

Se pone en marcha el sistema y se lleva a cabo la separación. Se puede añadir azul

debromofenol o xilenocianol para ver cómo avanzan las muestras.

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 4. Tinción del gel con bromuro de etidio (solo si no se preparó el gel con ello) y
posterior revelado con radiación UV.

Es importante fragmentar el ADN. Las moléculas de ADN tienen que ser cortadas por
enzimas de restricción (son muy grandes para avanzar en el gel).

Se emplean geles de agarosa (concentración entre 0,3% y 2%), más porosos que los de
poliacrilamida.

Se hace en horizontal y submarina.

Las muestras se aplican en pocillos practicados dentro del gel.

Se separan por tamaño (pares de bases). La carga y la forma es la misma.

En el primer pocillo se carga el patrón (una muestra con tamaños conocidos de ADN)

El avance del frente de electroforesis se observa por el azul del bromofenol.

Una vez finalizada la electroforesis podemos detectar el ADN con:

a. Compuestos fluorescentes que se unen específicamente a los ácidos nucleicos.

b. Por autorradiografía, si el ADN estaba radiactivamente marcado.
c. *Con bromuro de etidio. Es el método habitual para detectar el ADN en los geles
de agarosa. El gel se sumerge en una disolución acuosa de EtBr y se ilumina con
radiación UV (generalmente el gel se prepara ya con EtBr o GelRed)

4.3 Cómo preparar el gel con bromuro de etidio (explicado en clase)

*

5. TEMA 5:
5.1. Define el Southern Blot y el Northern Blot. (diapositiva 20-25)

Southern Blot:
● DEF: Técnica utilizada para la detección de secuencias de ADN y su cuantificación
relativa.
● Se emplea para detectar secuencias de ADN cromosómico.
● Pasos:
1. Digestión de las moléculas con endonucleasa de restricción para fragmentar
el ADN de partida y obtener fragmentos de ADN de menor tamaño.
2. Electroforesis para separar los fragmentos de restricción con soportes de
agarosa comunes. Los fragmentos van del polo negativo (-) al positivo (+), ya
que tienen carga negativa por los grupos fosfato. Los fragmentos de ADN
presentan una velocidad de migración inversamente proporcional a su
tamaño.
3. Transferencia de ADN a un filtro de nitrocelulosa o nailon. Los fragmentos
quedarán inmovilizados en distintas posiciones en función de su tamaño.

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 4. Hibridación de los fragmentos monocatenarios de ADN diana fijos en el filtro
de nitrocelulosa, que se asociarán con sondas monocatenarias de ADN
marcadas según la complementariedad de sus bases nitrogenadas.
5. Detección y visualización de la sonda unida a la cadena de ADN muestral
por exposición a rayos X o a una película sensible a la luz, según si el
marcaje es radiactivo o con fluorocromos.
● Está basado en reacciones de hibridación que:
○ son específicas.
○ permiten detectar y aislar moléculas de ADN (southern) o ARN (northern).
○ se necesita:
- una secuencia diana.
- una sonda marcada.

Northern blot:
● DEF: Se trata de una técnica análoga al southern donde los fragmentos de ácido
nucleico diana utilizados serán de ARN en lugar de ADN.
● Aquí no se fragmentan las cadenas de ácidos nucleicos por endonucleasas de
restricción por el menor tamaño de las moléculas.
● La separación electroforética del material de partida conlleva una serie de
precauciones.
○ El ARN se degrada con mayor facilidad que el ADN y tiende a formar
estructuras secundarias, por tanto, debemos tener cuidado de mantenerlo en
forma monocatenaria utilizando agentes desnaturalizantes como formamida
o formaldehído, y nunca soluciones alcalinas que lo degraden.
● Para asegurarse de la integridad del ARN antes de la transferencia, se visualizan los
fragmentos de ARN ribosómico con EtBr (bromuro de etilio).
● Posteriormente se transfieren los fragmentos a una membrana de nitrocelulosa para
llevar a cabo la electroforesis, de forma similar al Southern Blot y con las
precauciones anteriores.

5.2 Diferencias entre ambos (diapositiva 20-25)

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5.3 Tipos de marcaje de sondas (explicado en clase)

6. TEMA 6:
6.1 Etapas de clonación (diapositiva 15, 16 y 17)

1. Formación de ADN recombinante:

● En este proceso se usan endonucleasas de restricción, enzimas que
cortan la secuencia del vector elegido y la del ADN exógeno que se va a
clonar, formando extremos complementarios entre las dos moléculas de
ADN.
● Ambos fragmentos se unirán por bases nitrogenadas complementarias
mediante otra enzima llamada ADN ligasa.
● El producto final será un ADN recombinante.

2. Transferencia del ADN a la célula huésped.

Dependiendo de si la célula huésped es bacteriana o eucariota, este proceso se
llama transformación o transfección respectivamente. Existen distintos métodos
de transferencia:
● Transformación por choque térmico:
La célula huésped (bacteria) se trata con iones metálicos como el calcio para
alterar su pared, facilitando así la inserción del ADN recombinante. El
proceso requiere un aumento de temperatura.

● Infección por fagos y virus:

El ADN recombinante pasa del interior de un virus a la célula hospedadora
invadida.

● Electroporación:
Consiste en dar descargas eléctricas a la célula huésped, alterando la
estructura de su membrana, mediante la apertura de poros que facilitan el
paso del ADN recombinante al medio intracelular.

● Transformación por liposomas.

El ADN recombinante se incorpora a vesículas lipídicas y mediante su fusión
con la membrana plasmática de la célula hospedadora, se incorporará a su
interior (endocitosis).

● Microinyección

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 Se realiza con la ayuda de microagujas, microjeringas y un microscopio
electrónico que permita visualizar el proceso. Así el técnico especialista de
laboratorio podrá incorporar el ADN recombinante a una célula huésped.

3. Selección de las células huésped.

● Para aislar en el cultivo celular únicamente a las células transformadas con el ADN
recombinante se pueden insertar genes que proporcionan resistencia a un
antibiótico, de manera que al poner en el medio de cultivo este antibiótico, las
células no transformadas morirán.

6.2 Vectores de clonación (diapositiva 11, 12 y 13)

● Bacteriófago λ:
Permite clonar segmentos de ADN más largos.
Alrededor de ⅓ del genoma no es esencial y se puede reemplazar por ADN foráneo.
El ADN se empaqueta en partículas de fago cuando tienen un tamaño entre 40000 y
50000 pares de bases.

● Cósmidos:
Plásmidos recombinantes con características de plásmidos y bacteriófago λ.
Permiten clonación de fragmentos de ADN largos.
Tienen:
- origen de replicación plasmídico.
- uno o más marcadores seleccionables.
- un número de sitios de rrestricción únicos para insertar el ADN foráneo.
- un sitio cos (una secuencia de ADN del bacteriófago λ) que se necesita para
el empaquetamiento.

● Otros:
- BAC: cromosoma artificial bacteriano. Derivado del plásmido F, insertos de
150-300 kb. Usado en la secuencia de genomas.
- Vectores de eucariotas. Permite obtener las máximas ventajas de genes
eucariotas.
- Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs):
- plásmidos + secuencia replicadora + centrómero de levadura +
(telómero levadura)
- puede incorporar más de 500kb de ADN

7. TEMA 8
7.1. Qué son los cultivos celulares, aplicaciones y tipos
● DEF: Modelo de estudio in vitro constituido por células que pueden crecer y
mantenerse en suspensión o en monocapa por más de 24 horas en condiciones
controladas.

● Se utilizan medios de cultivo artificiales y condiciones físico-químicas (pH,

temperatura, presión osmótica, presión parcial de 02 y C02; y fisiológicas
controladas (hormonas, factores de crecimiento, densidad celular, etc)

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 ● Aplicaciones:
○ metabolismo celular
○ actividades intracelulares
○ interacciones celulares
○ análisis genético
○ investigación aplicada (toxicología, farmacología, virología, inmunología y
medicina)

● Tipos:
○ de órganos
○ explantes (fragmentos de tejidos u órganos que se adhieren a la placa)
○ células (más utilizado)
■ según su origen: primario y secundario
■ según su duración: directo, semidirecto, corto y largo

7.2 Factores que influyen en el cultivo celular (condiciones fisicoquímicas) (diapositivas 25 y

26; de la 26 solo nombrar)

● pH y capacidad tamponadora
El pH óptimo de crecimiento para la mayoría de tipos celulares es de 7,4 (7,2-7,6)
que se mantiene gracias a una solución tamponadora como el bicarbonato o el
HEPES, y se controla con un indicador, de manera que el cambio de color de este,
es motivo de cambio de medio.

● Osmolaridad
Se suelen utilizar medios isotónicos o ligeramente hipotónicos con respecto a las
células cultivadas. Las células crecen bien con osmolaridades de 260-320 mOsm/kg.

● Temperatura
Influye en la tasa de crecimiento celular. Suele utilizarse la temperatura fisiológica de
37ºC.

● Viscosidad
Tiene papel protector frente a la tripsinización y agitación del cultivo celular. Suele
depender del contenido en suero.

● Tensión superficial
Debe ser baja.

● Sales minerales
● Tampón e indicador de pH
● Aminoácidos
● Vitaminas
● Glucosa
● Suplementos orgánicos de bajo peso molecular
● Hormonas y factores de crecimiento (suero)

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 Los sueros más frecuentemente utilizados en los medios de cultivo son el
suero fetal bovino o de ternera, aunque también se utiliza suero humano para
el cultivo de líneas celulares humanas.
El suero siempre debe utilizarse descomplementado (calentándolo hasta
56ºC antes de ser añadido al medio de cultivo) para evitar la lisis celular.
● Inhibidores del crecimiento de los contaminantes más frecuentes (bacterias,
levaduras y hongos)

7.3 Mantenimiento de cultivos (diapositivas 34 y 35)

Para controlar tanto el crecimiento como la viabilidad de las células se realizan una serie de
procedimientos:
● Realizar un control periódico mediante microscopía.
Cada 1-3 días aproximadamente, se examina la apariencia y el crecimiento de las
células al microscopio invertido.

● Cambiar de medio de cultivo.

Cada 2-3 días se renueva el medio para retirar los productos de desechos
generados y proporcionar nuevos nutrientes→ indicador de pH.

● Realización de pases o subcultivos.

Al alcanzar la confluencia. Se hace recuento de células viables y se inicia de nuevo
el crecimiento. En cultivos en monocapa, las células han de despegarse de la
superficie (por método mecánico con un rascador o método enzimático por
tripsinización).

Conservación de células (por congelación):

Procedimiento similar a la realización de un subcultivo. Normalmente congelar una densidad
celular de unas 106cel/ml.
Los pasos son:
● Obtener suspensión celular
● Lavar con medio de cultivo y contar células viables (vivas)
● Centrifugar y sustituir medio por volumen adecuado de FBS y 10% de DMSO
(Generar alícuotas de 1ml)
● Congelación progresiva
○ -20ºC durante 24h
○ -80ºC 24h
○ Nitrógeno líquido (-196ºC) indefinido. A partir de las líneas celulares
conservadas a -80ºC o en nitrógeno líquido, se pueden iniciar cultivos
secundarios.

8. SECUENCIACIÓN DEL GENOMA

(ver apuntes)
9. DIFERENCIAS ADN Y ARN
(ver tabla)

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