Campylobacter spp.

, son pequeños bacilos gramnegativos curvos, oxidasa positivos, microaerófilos, que exhiben motilidad en
sacacorchos y colonizan el tracto intestinal de la mayoría de las especies de mamíferos y aves, en condiciones ideales,
Campylobacter produce crecimiento visible después de 24 h a 37 °C, pero las colonias bien formadas hasta las 48 horas; sin
embargo, pueden pasar hasta 72-96 horas de incubación para observar algunas cepas de crecimiento lento; las especies patógenas
de Campylobacter crecen a 37-42 °C, con una temperatura óptima de crecimiento de 41,5 °C;
son incapaces de crecer por debajo de los 30 °C, ya que carecen de los genes de la proteína de choque frío que desempeñan un
papel en la adaptación a las bajas temperaturas; estas bacterias no formadoras de esporas, no fermentan ni oxidan los hidratos
de carbono, sino que obtienen energía de la degradación de aminoácidos, o de los intermediarios del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos
¿Qué se necesita para hacer una PCR?
Seguir el procedimiento de una técnica de laboratorio no es tan diferente de una receta de cocina. Antes de nada, necesitamos
reunir los ingredientes. ¿Cuáles son? Los ingredientes esenciales para llevar a cabo una PCR son los siguientes:
ADN molde: Se trata del fragmento de ADN que queremos amplificar mediante la PCR.
Desoxirribonucleótidos-trifosfato: Como sabéis, el ADN está compuesto por 4 tipos de nucleótidos, formados por 4 bases
nitrogenadas: adenina, guanina, citosina y timina. Es de esperar, entonces, que estos 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato sean
indispensables para poder obtener nuevas moléculas de ADN
Cebadores (en inglés, primers): Los cebadores son oligonucleótidos, secuencias cortas de ADN, que se unen a la molécula
de ADN molde y sirven como punto de inicio para comenzar la síntesis de ADN. En la PCR necesitamos dos cebadores, cada
uno complementario a una cadena del ADN que buscamos amplificar. Estos oligonucleótidos determinan la región del ADN a
amplificar.
ADN polimerasas: Las reinas de esta técnica bioquímica. En la PCR se pueden utilizar diferentes ADN polimerasas, obtenidas
de varios organismos. Sin embargo, la más utilizada dada su efectividad, es la ADN polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus,
también llamada Polimerasa Taq. Esta polimerasa es idónea para la PCR por su resistencia a las altas temperaturas que se utilizan
en el proceso.
Iones divalentes de magnesio: En la PCR se utilizan iones de carga positiva como cofactores de la polimerasa. Estos cationes
son esenciales para la función de la ADN polimerasa. Normalmente se añade cloruro de magnesio para que al disociarse se libere
magnesio ( con carga +2).
Solución tampón: Una solución tampón es una disolución que es capaz de regular el pH, es decir, las condiciones de acidez o
basicidad, de nuestra PCR. Esto es muy importante, porque los cambios en el pH de la disolución pueden alterar los resultados
de nuestra PCR o evitar que se produzca, Buffer de reacción: para mantener unas condiciones de pH determinadas y continuas
durante todo el proceso.
Estos son los ingredientes básicos. Sin embargo, como en cualquier receta de cocina, necesitamos algo (un instrumento) para
procesar los ingredientes y conseguir los resultados que buscamos. En el caso de la PCR es muy importante regular las
condiciones de temperatura en las que se encuentran las reacciones. Para ello, se utiliza un “horno” especial, el termociclador.
Termociclador: Un termociclador es un aparato que regula la temperatura en cada ciclo de la PCR. Gracias a él es posible
realizar esta técnica en muchísimo menos tiempo, ya que para realizarla, se debe modificar la temperatura de la solución en varias
ocasiones.
¿Cómo funciona una PCR? La PCR se compone de varios ciclos, que se repiten unas 30 veces, dependiendo de la cantidad de
muestra que necesitamos. Cada ciclo comprende la desnaturalización de la doble hebra de ADN y la síntesis de la una nueva
cadena de ADN por cada cadena haya presente. De este modo, si comenzamos con una única molécula de ADN en la muestra,
obtendremos 2 en el primer ciclo, 4 en el segundo ciclo… ¡y 2 147 483 648 moléculas en el ciclo número 29!
En la primera parte del ciclo de una PCR, se desnaturalizan la moléculas de ADN de la muestra. Esto significa que las dos
cadenas que forman cada molécula se separan, dando lugar a dos moléculas de ADN monocatenario. Normalmente, este primer
paso se logra realizar mediante un aumento muy grande de la temperatura de la solución (aproximadamente a 95º).
El siguiente paso de un ciclo de la PCR implica unas moléculas muy
importantes, de las que hablaba antes, los cebadores. En este paso, se
disminuye la temperatura de la solución para favorecer la unión de los
cebadores al ADN monocatenario que habíamos obtenido en el proceso
anterior. Recordad que los cebadores se unen al ADN de forma específica,
así que solo amplificaremos la región de las moléculas que nos interese.
Acto seguido, se ajusta la temperatura de la solución de nuevo, para que
la ADN polimerasa pueda actuar a partir de los cebadores. La temperatura
en este paso es dependiente de la ADN polimerasa que se esté utilizando.
Por ejemplo, para la polimerasa Taq, la temperatura ideal está entre los 70 ºC
y los 80 ºC. En este paso, la polimerasa utiliza como molde las cadenas de
ADN monocatenario y va añadiendo al cebador los desoxirribonucleótidos-
trifosfato complementarios a la cadena molde, formando una nueva cadena.
Una vez se ha realizado un ciclo, se repiten los pasos de nuevo. De este
modo, las cadenas obtenidas en el primer ciclo se utilizan como molde en el
segundo ciclo, las obtenidas en el segundo se usan como molde en el tercero
y así consecutivamente.
Este es el tipo de PCR más sencillo. Sin embargo, existen muchas variaciones
de esta técnica que nos permiten obtener diferentes resultados
Reacción de amplificación
El siguiente momento crítico se produce durante la propia reacción de
amplificación del fragmento. Se trata de la repetición sucesiva de 3 simples
pasos, que conforman un ciclo de amplificación:
Desnaturalización. Separación de las 2 hebras que conforman el ADN
mediante la aplicación de calor (95 ºC).
Anillamiento. Colocación de los cebadores en la posición adecuada para
marcar el fragmento a copiar. La temperatura debe descender
aproximadamente a 60 ºC.
Elongación: Adición de los nucleótidos, uno a uno, por parte de la
polimerasa, desde la posición en la que se colocan los cebadores. Aquí la
temperatura debe rondar los 72 ºC.
Cada vez que se termina un ciclo de amplificación, se duplica la cantidad de
fragmento de ADN que teníamos en un principio. Si partimos de una única
copia del fragmento y hacemos 20 ciclos de amplificación, al final de la
reacción tendremos aproximadamente 1 millón de copias del fragmento
inicial.
6. Revelado de los resultados
Finalmente, para saber si se han realizado correctamente las copias de nuestro
fragmento, habría que revelar los resultados. Para ello, se pueden distinguir
dos tipos básicos de PCR:
• PCR convencional: habría que revelar cada muestra analizada
utilizando una técnica conocida como electroforesis en gel de
agarosa. Esta herramienta nos permite separar los fragmentos copiados en función de su tamaño. Si la muestra es
positiva a un microorganismo o tiene un gen que estamos buscando (por ejemplo, de resistencia a un determinado
antibiótico), aparecerá una línea en el gel correspondiente a nuestro fragmento de interés. Si, por el contrario, la muestra
es negativa, no se observará ninguna línea.
 PCR Master Mix es una solución concentrada 2X de ADN polimerasa Taq, dNTPs y todos los componentes necesarios para
una PCR, salvo la plantilla de ADN y los primers.
Máster Mix es una mezcla lista para usar para amplificar fragmentos de ADN seleccionados. Está diseñado para servir como
mezcla maestra para prácticamente todas las aplicaciones de PCR.
La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias.
Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así,
moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en
dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido).
La agarosa es un polímero lineal de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. El gel se
obtiene disolviendo la agarosa en un buffer de TAE o TBE y se funde usando un
microondas, hasta obtener una solución homogénea y transparente. La disolución
se vacía en un molde y se coloca un peine (el peine forma unos pozos donde se
depositan las muestras). Se deja enfriar para polimerizar para formar una matriz
porosa variando el tamaño del poro según la concentración de agarosa contenida
en la disolución. Además, la migración de los fragmentos de ADN variará
dependiendo del tamaño, conformación molecular (lineal, circular,
superenrollado), concentración de la agarosa en el gel, voltaje, dirección del campo
eléctrico, presencia de colorantes añadidos que se intercalan en el ADN (como el
bromuro de etidio y SYBR-green) y de la composición del buffer en el gel.

Medir la cantidad de agarosa dependiendo de la concentración a la que se quiera

obtener el gel. A más concentración, mayor resolución. Por ejemplo, un gel al 2%
sería 2 gramos de agarosa en polvo disueltos en 100 ml de tampón. Como podéis
comprobar, la concentración se obtiene mediante la relación peso/volumen
La electroforesis en gel de agarosa se utiliza comúnmente para separar moléculas
en función de su carga, tamaño y forma. Se trata de un medio de separación
especialmente eficaz para las biomoléculas cargadas como el ADN, el ARN y las
proteínas. A pesar de que la electroforesis en gel de agarosa sea una técnica simple
y fácil, posee dotes de separación eficaces.
El gel se fabrica disolviendo polvo de agarosa en una solución tampón hirviente.
A continuación, se deja enfriar la solución a 55°C y se vierte en un soporte, donde
se solidifica. Se sumerge después el soporte en un equipo de electroforesis de
electrodos que contiene solución tampón.