TSU BIOTECNOLOGÍA

BIOLOGÍA MOLECULAR
UNIDAD 4. ACT 11 Marcador 1
EQUIPO 3

INTEGRANTES:
• Carbajal Tapia Melissa Corine
• Gopar García Dafnne Lizeth
• Herrejón López Kristel Alejandra Marcador 2
• Lemus Cisneros Paola Janette
• Martínez Aguilar Patricia

GRUPO: “BIO 5A” MARZO 2021

 INTRODUCCIÓN
Los marcadores genéticos suelen ser mendelianos,
es decir se heredan según las leyes de Mendel,
aunque veremos que muchas veces están afectados
por el ambiente, otros caracteres. La composición
genética de un individuo, ya sea con respecto a una
o varias características, constituye su genotipo.
La apariencia externa y otras características
observables o mensurables de un organismo
constituyen su fenotipo. Aunque un alelo recesivo
no se exprese en el fenotipo, en un individuo
diploide los alelos materno y paterno existen de
manera independiente y como unidades discretas
formando parte del genotipo. (Curtis, 2008)
El hombre ha mejorado tanto especies vegetales, animales y microbianas a lo largo de la
historia basándose en la selección de los mejores fenotipos, el mejoramiento de las especies es
posible gracias a varios factores como la variabilidad genética entre los organismos, la eficacia
e intensidad de la selección aplicada, el tiempo necesario para realizar un ciclo de selección y
la heredabilidad del carácter que se quería aislar, es decir las diferencias de un cierto carácter
entre los individuos de una población, que se debe a diferencias en sus genes.

Cuando apareció la Biología Molecular se desarrollaron los marcadores molecular y genéticos

que empezaron a ayudar a eliminar tanto los inconvenientes de una selección basada en el
análisis del fenotipo, como en la identificación de especies y variedades de una forma más
rigurosa y repetitiva.
Los marcadores fenotípicos son
polimorfismos genéticos y epigenéticos que
contienen información sobre características
intrínsecas o extrínsecas de un ser
humano. (Freire, Phillips, Huidobro, &
Carracedo, 2019)

Los polimorfismos de ADN son una o más

formas alternativas (alelos) de un locus
cromosómico, que difieren en su secuencia de
nucleótidos o tienen un número variable de
repeticiones de unidades nucleotídicas.
Mapa genético del tomate basado en marcadores morfológicos.
(Griffiths et al, 2005)
Características.

Estos marcadores poseen bajo polimorfismo (2-4 alelos), están influenciados por el ambiente,
generalmente se expresan como dominantes, muchos se expresa en tejidos específicos o en una
etapa particular del individuo. (Díaz, 2016)

• Fácil y de bajo costo de uso y análisis.

• Se requiere una pequeña cantidad de ADN.
• Co-dominancia.
• Repetibilidad / reproducibilidad de resultados.
• Altos niveles de polimorfismo.
Un marcador genético es un segmento de ADN
con una ubicación física conocida en un
cromosoma.

Los marcadores genéticos representan

diferencias genéticas entre individuos o especies,
generalmente no representan genes blanco pero
actúan como señales o marcas ya que se
encuentran cerca de los genes de interés, la
mayoría no afecta el fenotipo de la característica
de interés ya que se encuentran cerca o ligados a
los genes que controlan la característica.
(Langarica, René, & Pérez, 2008)
Análisis de genotipos utilizando cinco marcadores de microsatélites polimórficos en el cromosoma
17p13. (Rolf Stucka, 2002)
Características.
Se encuentran en determinados lugares del genoma y que
están relacionadas con la herencia de una característica o
de un gen vinculado a ésta. (Moreno-Gonzales, 2010)

• Su número es ilimitado.
• Tienen alto nivel de polimorfismo.
• No están afectados por el ambiente.
• Se distribuyen a lo largo de todo el genoma.
• Muchos son codominantes.
• No muestran efectos de interacciones y pleiotropía.
• Pueden detectarse en cualquier tipo de tejido y en
cualquier etapa de desarrollo del individuo.
• Estos marcadores detectan variaciones en la secuencia
de nucleótidos del ADN: inversión, inserción,
duplicado o eliminación
 Morfológicos

Marcadores Clásicos Citológicos

Isoenzimas

Bioquímicos Proteínas

Marcadores
Genéticos
RFLP
Basado en
VNTR
hibridación
Microsatélites (SSR)

Marcadores de AND
(Moleculares)
AFLP ISSR
Basado en DAF SRAP
PCR RAPD
AP- PCR
Marcadores clásicos

Marcadores morfológicos. Son características fenotípicas

de fácil identificación visual (forma, color, tamaño o altura).
Estos marcadores contribuyeron significativamente al
desarrollo teórico del ligamiento genético y a la construcción
de las primeras versiones de mapas genéticos.

Ventajas: Desventajas:

• Su evaluación requiere, generalmente, de • Requieren un conocimiento práctico del

equipo sencillo. cultivo o de la especie vegetal (o de
• Constituyen la medida más directa del ambos).
fenotipo. • Están sujetos a influencias ambientales.
Marcadores citogenéticos. Este tipo de marcadores se limitan a un grupo de polimorfismos
físicos, a causa de que se consideran principalmente el número y forma de los cromosomas.
(posición del centrómero y longitud de los brazos) y se evalúa también el patrón de bandeo G-C,
el cual consiste en determinar, por medio de un colorante específico, dónde se encuentran
altas concentraciones de guanina y citosina en la heterocromatina. (Ríos, Mejía, & Álvarez,
2009)

Actualmente existen técnicas citogenéticas

como las llamadas FISH (hibridación in
situ por fluorescencia) y GISH
(hibridación in situ del genoma) en las que
se hace uso de tintes para marcar regiones
diferentes de ADN.
Marcadores bioquímicos. Incluyen proteínas y aloenzimas o
isoenzimas que identifican polimorfismos físicos mediante las
variantes estructurales de una misma enzima. Estos marcadores se
basan en proteínas de diferente peso molecular o punto
isoeléctrico, distinguibles en el patrón de bandas resultantes de la
electroforesis. La expresión de estos marcadores puede depender
del tejido analizado o la edad determinada en los individuos de
estudio. (Ríos et al., 2009)

Ventajas. Desventajas.

• Posee una expresión enzimática co-dominante,
que puede diferenciar los individuos
homocigotos de los heterocigotos. Tejido
• Bajo número de loci y variantes alélicas
detectables.
• Requiere de un tamaño de muestra grande y
que el tejido sea fresco.
• Están sujetos a influencias ambientales.
Marcadores de AND(Moleculares)

Se definen como un fragmento de ADN que revela mutaciones / variaciones, que se pueden usar
para detectar polimorfismo entre diferentes genotipos o alelos de un gen para una secuencia
particular de ADN en una población o grupo de genes.

Los marcadores de ADN constituyen la nueva generación de marcadores moleculares y

solucionaron el problema de la carencia de marcadores que tenían las isoenzimas, pues son capaces
de generar una cantidad virtualmente infinita de marcadores. (Liang, 2012)

Ventajas. Desventajas.

• Son estables y pueden detectarse en cualquier • Se necesitan de un equipo

tipo de tejido. técnicamente más complejo.
• No son afectados por el medio ambiente y
generalmente carecen de pleiotropía y efectos
epistáticos.
Basado en hibridación (Southern blot). Explora las variaciones en la longitud o tamaño de los
fragmentos de ADN ocasionadas por la restricción del genoma mediada por una enzima particular
(endonucleasa).

Dentro de esta técnica se encuentran los marcadores RFLP (polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restricción) y los microsatélites (marcadores genéticos para estudiar la herencia de
los genes en las familias) y los VNTR (secuencias adyacentes que se repiten en número variable).

PCR (técnica de reacción en cadena de la polimerasa). La técnica de PCR, es una tecnología

utilizada para multiplicar (sintetizar) in vitro fragmentos específicos de ADN con la finalidad de
detectar una secuencia o gen de interés en el genoma del individuo en estudio.

Dentro de esta metodología se encuentran los marcadores llamados RAPD (ADN polimórfico
amplificado al azar), AFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados), AP-PCR
(reacción en cadena de la polimerasa iniciada al azar) y DAF (amplificación de huellas del ADN),
entre otros. (Solís & Torres, 2015)
 TÉCNICAS PARA IDENTIFICACIÓN DE
CARACTERÍSTICAS FÍSICAS ENTRE
INDIVIDUOS
Estas técnicas se basan en la determinación de características
bioquímicas y/o fisiológicas.
◦ Constituyen la primera herramienta para la comparación de
microorganismos que incluye la determinación de actividades
enzimáticas, la capacidad metabólica y los determinantes
antigénicos o susceptibilidad a agentes bactericidas.
◦ Con este tipo de métodos no se pueden identificar genes,
polimorfismo o mutaciones que determinen la expresión de las
características visibles en medios de cultivos, pruebas bioquímicas y
de susceptibilidad. (Angarita, Torres, & Díaz, 2017)
Las proteínas y las isoenzimas constituyen la primera generación de marcadores moleculares.

• Las proteínas son los productos primarios
de los genes y se forman mediante los
procesos de transcripción y traducción, por
lo que se ven menos influidos por el
ambiente.
• Las isoenzimas fueron descubiertas por
Hunter y Markert en 1957 y son diferentes
variantes moleculares de una misma enzima
presentes en una especie, las cuales
desempeñan la misma actividad pero
pueden tener diferentes propiedades. (Solís
et al., 2015)
 ISOENZIMAS
Las isoenzimas pueden presentar varias formas alélicas en ese locus en particular, las cuales se
conocen como aloenzimas. En su mayoría estas aloenzimas son selectivamente neutras y se utilizan
como marcadores hereditarios para cuantificar las frecuencias alélicas y genotípicas de los individuos,
que son los estimadores básicos de la composición genética de una población.

Las isoenzimas han sido aplicadas exitosamente en los

análisis genéticos para evaluar y entender cuestiones de
biología evolutiva como sistemas de reproducción y
patrones de entrecruzamiento, relaciones entre fenotipo
y ambiente, filogenias, variabilidad y endemismos,
diversidad en plantas clonales y apomícticas,
interacciones planta-insecto, relaciones entre morfología
o citología y polimorfismo en una amplia variedad de
taxa silvestres y cultivados.
Pasos de un estudio isoenzimatico:

1. Elección del material a analizar y realización del muestreo.

2. Extracción de proteínas.
3. Separación de las proteínas por electroforesis.
4. Visualización de los isoenzimas por tinción.
5. Interpretación de los resultados.
1. Elección del material a analizar y realización del muestreo

Puede llevarse a cabo sobre cualquier tejido del vegetal. Es necesario tener en consideración que las
variantes electroforéticas de proteínas y de enzimas poseen especificidad tisular y ontogénica. Es
importante emplear muestras de tejidos comparables, y en un estado similar de desarrollo, que
resulten representativos de la población en estudio. El órgano cuyo composición química resulta
más estable frente a factores externos, es la semilla. De los órganos vegetativos, los tallos
lignificados, desarrollados durante el período de crecimiento precedente, son los más estables.
(González , 2021)

2. Extracción de proteínas

Consiste en la liberación de las enzimas de los orgánulos celulares. Para evitar su desnaturalización,
hay que mantener durante todo el proceso de extracción temperaturas en torno a 4º C, y un pH
constante en el que él enzima sea activo. Para solubilizar las proteínas es necesario romper los
tejidos en presencia de una solución tampón que vehiculice dichas proteínas una vez solubilizadas.
Formas de realizar la extracción: manual o mecánica. (González , 2021)
3. Separación por electroforesis

La técnica de la electroforesis está basada en la propiedad que tienen algunas de las moléculas
biológicas de presentar grupos que pueden ionizarse, y por tanto convertirse en aniones o
cationes, que pueden desplazarse en un campo eléctrico en función de su carga neta.

Las proteínas se desplazan disueltas en un medio tamponado, sobre un soporte, a través del cual
circula la corriente eléctrica. Los extractos vegetales que contienen todas las proteínas se colocan
sobre ese medio soporte. En consecuencia 3 aspectos importantes en una electroforesis son: el
medio tamponado, el soporte y los parámetros eléctricos.
4. Visualización de los isoenzimas por tinción

Existen tintes inespecíficos como el azul de Coomasie, que tiñe todo tipo de proteínas, lo que
suele llevar a la aparición de un gran número de bandas, de difícil interpretación. Gracias a esto
se desarrollaron las tinciones específicas que solamente tienen un sistema enzimático.
Se basa en que al sumergir el gel en la solución de revelado, que también está tamponada, los
substratos y otros reactivos se difunden en el interior del gel, donde aquellos son transformados
por efecto de la actividad del enzima en cuestión, seguido de la precipitación del colorante en
las zonas de actividad.

Sistemas de tinción Dependiendo del tipo de enzima que se tiñan:

◦ Sistema de acoplamiento azo.

◦ Sistema del tetrazolio.
◦ Sistema almidón-yodo.
◦ Colorantes redox .
5. Interpretación de los resultados

◦ El patrón de bandas isoenzimáticas obtenido en un gel recibe el nombre de zimograma.

Existen dos formas fundamentales para analizar un zimograma: desde el punto de vista
puramente fenotípico o desde un punto de vista genético.
◦ Fenotípico: Cada banda se trata como un carácter independiente de los demás coma
considerándose simplemente la presencia o ausencia de cada banda en cada O.T.U. analizada.
Lo deseable es conseguir el mayor número de bandas. Dado que el gel de poliacrilamida, Es el
que proporciona el nivel de resolución más alto y por tanto origina mayor número de bandas.
◦ Genético: Suelde restringirse a 1 o pocos loci por cava sistema isoenzimatico, que son aquellos
en los que se ha llevado a cabo un laborioso estudio genético previo, que permita interpretar
las bandas que aparecen en términos de alelos.
INTERPRETACIÓN DE
LOS RESULTADOS
VENTAJAS.
◦ Permite separar moléculas cargadas y explota
diferencias en movilidad cuando se les somete
a la acción de un campo eléctrico.
DESVENTAJAS.
◦ Si el papel es fino, se puede desgarrar con
facilidad.
◦ Si el papel es grueso, las bandas se
distorsionan.
◦ Se produce una interacción entre las proteínas
y los grupos hidroxilos por lo tanto la
migración se frena.
◦ Calidad del papel: 90% de celulosa absorción
de agua y conductividad eléctrica.
 PROTEÍNAS DE RESERVA
El uso de proteínas de almacenamiento en estudios de diversidad genética sistemática, se basa en el
hecho que las proteínas de diferentes individuos, poblaciones y especies son homólogas, y que al
separarse en un gel producirán bandas similares o diferentes. Debido a que las proteínas de reserva
carecen de actividad enzimática, ellas son detectadas en el gel por medio de técnicas generales de
teñido. (Becerra & Paredes, 2000)

Un ejemplo de marcador bioquímico que todavía es

utilizado para identificación son las proteínas de
almacenamiento de las semillas de algunos cereales
como el trigo. (Pascual, 2019)
Separación electroforética (SDS-PAGE) en
gradientes de geles de poliacrilamida

◦ La técnica permite separar moléculas cargadas y explota

diferencias en movilidad cuando se les somete a la acción de
un campo eléctrico.
◦ Se lleva a cabo sobre un soporte inerte, generalmente sobre
geles de poliacrilamida (PAGE). En la electroforesis
desnaturalizante (SDS-PAGE), como su propio nombre
indica, se utilizan agentes desnaturalizantes de proteínas,
como pueden ser: detergentes (p.e. SDS), caótropos (p.e. urea)
y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT).
◦ Para la visualización de las proteínas se utilizan diferentes
métodos de tinción, siendo el más habitual el azul de
coomassie.
El ensayo de Bradford

◦ Es un método rápido y sensible para cuantificar proteínas.

◦ Se basa en el cambio de color que experimenta el colorante azul "coomassie" en medio ácido en
presencia de proteínas.
◦ Las proteínas producen el cambio de la coloración anaranjada del reactivo a una tonalidad azulada,
cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas.

La proteína de la disolución forma con el reactivo

un complejo coloreado, cuyo máximo de
absorción varía de 495 a 595 nm. La recta de
calibrado y la determinación de proteína en la
muestra se realizan a la vez. (Solís, 2018)
Ventajas.
◦ Fáciles de detectar y posibilidad de ver un
amplio número de locus en un único ensayo.
◦ Permite un análisis rápido Es un método
simple y de bajo costo comparado con otras
técnicas.
◦ Material fácil de obtener y de almacenar.
Desventajas.
◦ Los distintos patrones electroforéticos
detectados pueden tener una base molecular
compleja que puede incluir sustituciones,
inserciones y pérdidas nucleotídicas (Becerra
& Paredes, 2000).
◦ Las diferencias pueden ser causadas por
modificaciones pre y post transcripción y/o
traducción (Becerra & Paredes, 2000).
BIBLIOGRAFÍA
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