RT-PCR (Clonación acelular de moléculas de ARN)

¿QUE ES?
se trata de una amplificación de RNA (especialmente mRNA de células asequibles, un de ellas son las células
sanguíneas con expresiones elevadas de ciertos genes por ejemplo la globina una proteína que forma parte de la
hemoglobina encargada del transporte de oxígeno y CO2 en el proceso de respiración celular) a través de la
síntesis previa de su cDNA, que después de amplifica por PCR.
Se utiliza para la detección y amplificación de ARN. Permite estudiar la expresión de determinados genes (su
traducción a proteínas). En primer lugar se extrae el ARNtotal de las células en estudio y se separa la fracción
correspondiente al mensajero (ARNm). Tras purificarlo el ARN se transcribe a ADN mediante una transcriptasa
inversa, por cada molécula de ARNm se sintetiza una molécula de cADN monocatenaria que posteriormente se
ha de convertir en bicatenaria utilizando una ADN polimerasa (la rTth ADN polimerasa de Thermus
thermophilus es un enzima recombinante y termoestable que actúa como transcritasa inversa y como ADN
polimerasa simultáneamente). A partir de aquí se aplica la técnica de PCR lo que permite una detección de la
expresión de ARNm mucho más sensible que con Northern blot o con hibridación in situl76. La,80. secuencia
del fragmento amplificado se determina mediante secuenciación automática de ADN. Existen diversos kits
comerciales, como Gene Amp de ARN-PCR (Pekin-Elmer, Alemania) que pueden ser utilizados para RT-PCR.
La transcriptasa inversa, (tipo de enzima ADN pol) transcriptasa reversa o retrotranscriptasa es una enzima de
tipo ADN-polimerasa, que tiene como función sintetizar ADN de doble cadena utilizando como
molde ARN monocatenario, es decir, catalizar la retrotranscripción o transcripción inversa. Esta enzima se
encuentra presente en los retrovirus.
La transcriptasa inversa fue descubierta por Howard Temin en la Universidad de Wisconsin-Madison, y de forma
independiente por David Baltimore en 1970 en el MIT. Los dos compartieron el Premio Nobel de Fisiología o
Medicina en 1975 con Renato Dulbecco por su descubrimiento.
Aplicaciones

 Determinar expresión génica en distintas muestras (aplicable a casi todo tipo de área e industria)
 Detección o diagnóstico de enfermedades inmunológicas
El PRRS es una de las enfermedades infecciosas más importantes por el impacto económico que supone
para la industria porcina nacional e internacional. Va a estar producida por un virus ARN cuyas
principales características son la variabilidad genética y antigénica, sus propiedades inmunomoduladoras
y su capacidad para inducir infecciones persistentes. Hasta el momento se han reconocido dos genotipos
principales del virus de PRRS, el europeo (EU) y el americano (NA). RT-PCR en tiempo real para el
diagnóstico y el control del virus del Síndrome Respiratorio y Reproductor Porcino.
 Aplicación en dermatología: la RT-PCR es muy útil para detectar la presencia de virus ARN (como el
virus del sarampión).
 detectar la expresión proteica de antígeno específico prostático en células: Micrometástasis: es una
pequeña colección de células cancerosas que se desprendió del tumor original y se diseminó a otra parte
del cuerpo a través del sistema linfovascular (para el cáncer de mama).
 Diagnóstico de cáncer; el análisis citogenético molecular de translocaciones cromosómicas: Las
translocaciones en los tumores de piel y partes blandas son detectadas mediante RT-PCR. En el
liposarcoma mixoide y en sus variantes pobremente diferenciadas, la translocación t(12,16) origina un
gen de fusión entre el gen CHOP gene y el gen FUS; y en los lipomas, el gen HMGI-C se reordena por
alteraciones estructurales que afectan a la región 12q 14-15, un hecho que puede ser utilizado en el
diagnóstico diferencial de este tipo de tumores.

TABLA 6. Cambios cromosómicos de tumores en

 Dermatología
Tumor Anomalía cromosómica

  Translocacions
Leiomioma t(12;14)(q14-15;q23-24)
Liposarcoma mixoide t(12:16)(113;p11)
Lipoma 12q14-15
Liposarcoma mixoide t(12;16)
Lipoblastomas Reordenamientos 8q
Sarcoma de células claras
(melanoma maligno de partes t(12;22)(q13;q12,2ó12)
blandas)
Tumor desmoplásico de células
t(12;22)(q13;q11,2 ó 12)
redondas pequeñas
Dermatofibrosarcoma
protuberans y fibroblastoma de t(17;22)
células gigantes
Linfoma anaplásico t(2;5)
Linfoma linfoblástico T t(1;14)
Deleciones u otros
  cambios
Tumores lipomatosos atípicos Cromosomas en anillo
Alteraciones en 12q, 6p y
Lipomas intramusculares
13q
Lipomas fusocelulares y
Alteraciones en 16q
pleomórficos
Hibernomas Alteraciones en 11q
Carcinoma epidermoide
Trisomía 7
cutáneo
Queratoacantoma Trisomía 7
pérdidas en 6q, 9p
Melanoma
y 10q
Alteraciones en 7p, 7q ó
Linfomas T
14q

 La identificación de células tumorales circulantes en la sangre periférica de pacientes con melanoma es

posible mediante la utilización de RT-PCR para analizar transcripciones (ARNm) de proteínas asociadas
al melanoma (tirosinasa, Melan-A/ MART-1, MAGE-3, gp100, y p97). En el estadio II un 23,8% y en el
estadio IV un 37,5% de los pacientes presentan muestras positivas para al menos uno de esos
marcadores en RT-PCR. Aunque el análisis de la proteína S-l00 en suero (LIA análisis de
inmunoluminometría) parece ser más sensible, RT-PCR podría ser útil para la detección de
micrometástasis en tejidos184.

 Perfil de la citosina: El estudio de ARNm y de su expresión proteica se utiliza para conocer mejor los
mecanismos inmunológicos y de la inflamación. Las citocinas son un grupo de glucoproteínas
producidas por células inmunocompetentes, las cuales regulan y controlan la actividad funcional de los
linfocitos y de los macrófagos, así como también otras células altamente especializadas que participan
en los eventos biológicos de toda respuesta inmune específica. Dentro de sus principales acciones
biológicas se destaca la activación y la inducción de la diferenciación celular de las células blanco, la
amplificación de la reacción inflamatoria, presente en la fisiopatología de enfermedades con un fondo
inmunológico, y su papel regulatorio de la respuesta inmune.
 Respuesta a medicamentos oncologicos; (Utilización terapéutica)

En el estudio de nuevas dianas para la inmunoterapia del melanoma, se estudia la expresión de ARNm
de determinados antígenos, como el Melan-A196, para comprobar que este producto sea específico de
 células melánicas, lo que a su vez proporciona una herramienta útil de diagnóstico, gracias al desarrollo
de anticuerpos monoclonales aplicables a tejido en fresco y fdado en parafina, muy útiles para detectar
micrometástasis en el estudio de ganglios linfáticos centinelas197.

En el estudio de enfermedades inflamatorias de la piel, puede utilizarse RT-PCR para valorar el efecto y
mecanismo de acción de determinados fármacos. Así, se ha demostrado que los corticosteroides tópicos
disminuyen la expresión de ARNm de E-selectina, segregada por las células endoteliales en el proceso
inflamatorio198.

El análisis de citoquinas mediante RT-PCR en alopecia areata demuestra que el patrón de citoquinas es
Th1 y se modifica (aumento de IL-2, IL-8, IL- 10, y factor de necrosis tumoral alfa) durante el
tratamiento inmunoterápico tópico (difenilciclopropenona), por lo que el tratamiento con IL-10
recombinante podría ser útil en estos pacientes199.

METODOLOGIA

 ARN como material de partida: La PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR) se utiliza
cuando el material de partida es ARN. En este método, el ARN se transcribe primero en ADN
complementario (ADNc) por transcriptasa inversa del ARN total o ARN mensajero (ARNm). El cDNA
se usa como plantilla para la reacción de qPCR.

 RT-qPCR de un paso vs. dos pasos

La RT-qPCR se puede realizar en un ensayo de uno o dos pasos. Los ensayos de un solo paso combinan
la transcripción inversa y la PCR en un solo tubo y tampón, utilizando una transcriptasa inversa junto
con una ADN polimerasa. La RT-qPCR de un solo paso solo utiliza cebadores específicos de secuencia.
En ensayos de dos pasos, la transcripción inversa y los pasos de la PCR se realizan en tubos separados,
con diferentes tampones optimizados, condiciones de reacción y estrategias de cebado.

Ventajas desventajas
One-step -Menos variación experimental ya -Menos sensible que two-step
que ambas reacciones tienen lugar porque las condiciones de
en el mismo tubo. reacción son un compromiso
-Menos pasos de pipeteo reduce el entre las dos reacciones
riesgo de contaminación combinadas.
-Adecuado para la -Detección de menos blancos por
amplificación /alto rendimiento muestra.
-Rápido y altamente reproducible.
Two- -ADNc estable, puede -El uso de varios tubos y pasos
step almacenarse durante largos de pipeteo expone la reacción a
períodos de tiempo y usarse para un mayor riesgo de
múltiples reacciones. contaminación del ADN
-Los genes de referencia se -Pérdida de tiempo
pueden amplificar a partir de la -Requiere más optimización que
misma agrupación de ADNc. un solo paso
 -Se pueden usar tampones de
reacción optimizados.

Eligiendo ARN total vs. ARNm

Cuando se diseña un ensayo RT-qPCR, es importante decidir si usar ARN total o ARNm purificado como la
plantilla para la transcripción inversa. El ARNm puede proporcionar un poco más de sensibilidad, pero el
ARN total se usa a menudo porque tiene importantes ventajas sobre el ARNm como material de partida.
Primero, se requieren menos pasos de purificación, lo que garantiza una recuperación más cuantitativa de la
plantilla y una mejor capacidad para normalizar los resultados al número inicial de células. En segundo
lugar, al evitar cualquier paso de enriquecimiento de ARNm, se evita la posibilidad de resultados sesgados
debido a diferentes rendimientos de recuperación para diferentes ARNm. En conjunto, el ARN total es más
adecuado para usar en la mayoría de los casos, ya que la cuantificación relativa de los objetivos es más
importante para la mayoría de las aplicaciones que la sensibilidad absoluta de detección.

primers para la transcripción inversa

Se pueden usar tres enfoques diferentes para cebar reacciones de ADNc en ensayos de dos pasos: cebadores
oligo (dT), cebadores aleatorios o cebadores específicos de secuencia (Figura 2, Tabla 2). A menudo, se
utiliza una mezcla de oligo (dT) y cebadores aleatorios. Estos cebadores se complementan con la cadena de
ARNm de la plantilla y proporcionan a las enzimas transcriptasas inversas un punto de partida para la
síntesis.

cebador Función y estructura

cebadores oligo Estiramiento de los residuos de timina que se hibridan con la
(dT) cola poli (A) del ARNm; los oligo anclados (dT) s contienen
un residuo de G, C o A (el ancla) en el extremo 3 ' (Solo
amplificar el gen con una cola poli (A).
ADNc truncado de los sitios internos de poli (A) * 2
Sesgo hacia el extremo 3 ′ *
* Minimizado si se utilizan oligo (dT) anclados)
Random primers De seis a nueve bases de largo, recocen en múltiples puntos a
lo largo de la transcripción del ARN
Sequence Specific Cebadores hechos a medida que apuntan a una secuencia de
Primers ARNm específica (La síntesis está limitada a un gen de
interés.)

Enzimas de transcriptasa inversa

La transcriptasa inversa es la enzima que produce el ADN a partir del ARN. Algunas enzimas tienen
actividad de ARNasa para degradar la cadena de ARN en el híbrido ARN-ADN después de la transcripción.
Si una enzima no posee actividad de ARNasa, se puede agregar una ARNasaH para mejorar la eficiencia de
la qPCR. Las enzimas de uso común incluyen el virus de la leucemia murina Moloney, la transcriptasa
inversa y el virus de la mieloblastosis aviar, la transcriptasa inversa. Para RT-qPCR, es ideal elegir una
transcriptasa inversa con alta estabilidad térmica, ya que esto permite que la síntesis de ADNc se realice a
temperaturas más altas, lo que garantiza una transcripción exitosa del ARN con altos niveles de estructura
secundaria, mientras mantiene su actividad completa durante toda la reacción produciendo mayores
rendimientos de cDNA.
Actividad de la ARNasa H de la transcriptasa inversa
La actividad de la ARNasa H degrada el ARN de los dúplex de ARN-ADN para permitir una síntesis
eficiente de ADN de doble cadena. Sin embargo, con plantillas de ARNm largas, el ARN puede degradarse
prematuramente, lo que da como resultado un ADNc truncado. Por lo tanto, generalmente es beneficioso
minimizar la actividad de la ARNasa H cuando se pretende producir transcripciones largas para la clonación
de ADNc. Por el contrario, las transcriptasas inversas con actividad de ARNasa H intrínseca a menudo se
favorecen en las aplicaciones de qPCR porque mejoran la fusión del dúplex de ARN-ADN durante los
primeros ciclos de PCR (Figura 3).
Metodología

1. Plantilla de ARNm poliadeninado. Antes de iniciar la transcripción inversa, la platilla de ARN debe
aislarse de la muestra analizar.

2. Cebado para la transcripción inversa. Para generar ADNc utilizando la enzima transcriptasa inversa
(RT), un cebador se une al ARN plantilla. Los Primers pueden ser; Primers específicos de genes,
Random Primers y Oligo-dT. En este ejemplo se utilizan Oligo-dT para iniciar la síntesis de ADNc a
partir de ARNm.

3. (A) la transcriptasa inversa comienza (desde el primers) a sintetizar la primera hebra de ADNc.
(Retrotranscripción) (B) la RT agrega bases de nucleótidos complementarios a la cadena de ARNm
creando una cadena de ADNc. (ejemplo 45min-48°C)

4. Eliminación de la plantilla de ARNm mediante la actividad ARNasa H. y el ADNc ahora se puede usar
para la amplificación por PCR.

5. En la reacción de PCR, el primer de oligonucleótidos, se hibrida con la plantilla de ADNc (A). la taq
polimerasa agrega nucleótidos complementarios a partir del sitio de reconocimiento del primer (ejemplo
2min a 94°C- para inactivación de la RT y activación de la ADNpol o taq pol) (B). el producto resultante
es un ADNc de doble cadena (C). el proceso de tres etapas de desnaturalización, templado del primer y
extensión se repite para obtener un producto de PCR detectable, el cual se puede visualizar en un gel de
agarosa teñido con bromuro de etidio después de la electroforesis(D).
PRINCIPIO DEL MÉTODO DE PCR
1. Desnaturalización del ADNc de doble cadena: Temperatura entre 68-97°C (debe ser superior a la Tm) entre 30-
120s (por ejemplo; protocolo para PRRS 95°C/15s).
2. Hibridación o Templado: especifica de la hebra sencilla con un oligonucleótido, se lleva a cabo un enfriamiento
rápido por debajo de la Tm, de 37.-65°C entre 10-120s (por ejemplo; protocolo para PRRS 60°C/120s).
3. Replicación de la hebra sencilla por una ADN pol. a partir del primer (elongación o extensión del cebador, o
polimerización). Temperaturas entre 72-75°C durante 1-3min.(por ejemplo; protocolo para PRRS 72°C/7min)
Duración total de 2 horas, generalmente se hacen de 20-40 ciclos de 1.5-5min de duración cada uno.
protocolo para PRRS (virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino)-40 ciclos