Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de

Biotecnología

Laboratorio de Biotecnología Molecular

Profesoras:
Flor Selene Villalobos Escobedo
Aida Margarita Zamora Contreras

Bitácora: Práctica 8 “Reacción en cadena de la Polimerasa

(PCR)”

Alumno: Cano Pérez Jeimy Melanie

Equipo: 5

Fecha de entrega: 07/12/2022

Objetivos:
Generales
 Obtener un producto amplificado por la técnica de Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR).
Específicos
 Realizar la metodología básica para amplificar una cadena de interés por medio de
la PCR.
 Identificar la correcta o incorrecta inserción de una cadena de interés en un vector
en base al tamaño del amplificado por medio de PCR.

Tabla de reactivos
Tabla 1. Función de reactivos Práctica 8

Reactivo Función
ADN molde Contiene la región de ADN que se va a amplificar. La cantidad
de este molde puede ser de tan sólo 1ng en caso de material
genético clonado o de un mínimo de 20ng cuando se utiliza
ADN genómico proveniente de células eucariotas. El molde
puede ser también ARN previamente transformado en ADNc
mediante transcripción reversa. (Bolivar, 2014)
Oligonucleótidos iniciadores Delimitan la zona de ADN a amplificar. Al ser reconocidos por
(primers): sentido y anti la enzima permiten iniciar la reacción. (Bolivar, 2014)
sentido
Taq DNA polimerasa Esta enzima replica el DNA a 72 ° C. La enzima cataliza la
polimerización de nucleótidos en DNA de doble hebra en
dirección 5' → 3', en presencia de iones de magnesio, y muestra
actividad exonucleasa 5' → 3'. La enzima está altamente
purificada y libre de exonucleasas endonucleasas o nucleasas
inespecíficas. (winkler, 2017)
10X PCR buffer Mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN
polimerasa. (Bolivar, 2014)
MgCl2 Los iones divalentes actúan como cofactores de la enzima por
tanto tienen una función crítica en la reacción. Se suele usar
Mg2+, agregado comúnmente como cloruro de magnesio
(MgCl2), requiriéndose que sea usado a una concentración que
oscila regularmente entre 0,5 y 2,5mM. (Bolivar, 2014)
dNTPs Los cuatro dNTPs son necesarios para construir las nuevas
 1 mM dATP cadenas de ADN.
 1 mM dGTP Variaciones en su concentración afectan especificidad y
 1 mM dCTP fidelidad. Concentraciones altas hacen disminuir la actividad de
 0.65 mM dTTP la enzima e incluso pueden llegar a inhibirla. El uso de
concentraciones desbalanceadas también afecta la fidelidad,
siendo las concentraciones utilizadas en la mayoría de los casos
entre 0,2 a 1Mm. Los dNTPs pueden captar iones de magnesio
(Mg2+) por lo tanto las concentraciones de ambos deben guardar
siempre la misma relación. (Bolivar, 2014)
Metodología
 Ilustración 1. Metodología para la Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).

Tabla 2. Composición de la Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).

Concentración final Muestra (µL) Control negativo ( μL

)
ADN molde 10pg-1 µg 1 µL* -----
Iniciador Sentido 0.1-1 µM 2.5 µL 2.5 µL
10µM
Iniciador Antisentido 0.1-1 µM 2.5 µL 2.5 µL
10 µM
Buffer PCR 10X 1X 5 µL 5 µL
25 mM Mg Cl 2 1-4 mM 6 µL* 6 µL*
dNTPs 0.2 mM de cada uno 5 µL 5 µL
Agua MilliQ estéril 27.6 µL* 28.6 µL*
Taq polimerasa (5U/ 1.25 U / 50 µL 0.2 µL** 0.2 µL**
µL)

*El volumen depende de la concentración final requerida.

**Se coloca al final en la reacción en frío.

Cuestionario
1. ¿Qué criterios deben considerarse en el diseño de oligos (primers)?
  Tamaño: Deben ser oligonucleótidos mayores de 18 nucleótidos.
 Es deseable que tengan un contenido de G/C (40 a 60%) o ligeramente
superior, sobre todo hacia el extremo 3', pero evitando largas repeticiones de
G (>4).
 Deben tener una temperatura de desnaturalización (o melting) de entre 50 y 60
°C, y no debe diferir entre ambos en más de 5 °C.
 Deben ser específicos de un solo sitio, evitando regiones con secuencias
altamente repetitivas.
 La auto-complementaridad debe ser evitada para que no formen estructuras
secundarias internas (hairpin) o dímeros entre ellos.
2. ¿Cuál es la importancia de la Tm? Si los primers tienen Tm diferente ¿Cuál de
las dos se usa y por qué?
Tm o melting temperature es la temperatura a la que se hibridan o se pegan los
oligonucleótidos en los sitios que son complementarios. Este proceso dependerá
principalmente del tipo de uniones (dobles o triples enlaces de hidrógeno) que
formarán sus bases, y por eso la secuencia de cada oligo es la que se toma en cuenta
para conocer cuál es la temperatura óptima para su alineamiento.
3. ¿De dónde se aislaron las primeras polimerasas? ¿Qué características son
deseables para el empleo de esta enzima?
En 1976 se aisló la primera polimerasa termoestable conocida como Taq
polimerasa, a partir de la bacteria Thermus aquaticus que vive en ambientes
acuáticos con temperaturas cercana a los 100 °C. En la mayoría de las reacciones, la
etapa de extensión se realiza a 72 ºC porque es la temperatura a la cual la Taq
polimerasa alcanza su mayor actividad. El tiempo de extensión depende de la
longitud del fragmento a amplificar, la Taq polimerasa añade de 500 a 1000
nucleótidos por minuto.
4. ¿Por qué son necesarios los pasos extendidos de desnaturalización inicial y
polimerización final?
La PCR inicia con la desnaturalización o separación de la doble hélice de ADN
mediante el calentamiento de la muestra durante 5-10 minutos a una temperatura
entre 94 y 96°C para romper los puentes de hidrógeno que las unían, de esta manera
cada cadena queda como molde para la síntesis de una nueva cadena
complementaria de ADN.
Generalmente, al terminar los ciclos, se realiza una última extensión de
aproximadamente 5minutos a 72ºC para permitir que la polimerasa termine de
sintetizar todos los fragmentos que pueden haber quedado incompletos.
5. ¿Qué se puede modificar si no se observa amplificación?
En caso de que no haya producto amplificado o que éste tenga un bajo rendimiento,
se recomienda cambiar las condiciones de la PCR (temperatura y concentraciones
de los reactivos), así como supervisar el correcto funcionamiento del termociclador
6. ¿Qué se puede modificar si hay amplificación inespecífica?
La especificidad de la PCR depende principalmente de la temperatura empleada en
la fase de hibridación y de la cantidad de iones divalentes que se incorporan a la
 reacción (además de depender de la secuencia de los cebadores). Entonces cuanto
mayor sea la temperatura utilizada en la fase de hibridación, más específica es la
reacción, esto se debe a que a mayor temperatura más dificultada se ve la unión
entre el cebador y la cadena molde; en condiciones de temperaturas de hibridación
elevadas el cebador sólo se unirá a la cadena molde si son complementarios en
todos sus nucleótidos. Por otra parte, en un determinado rango, incrementos en la
concentración de MgCl2 hacen disminuir la especificidad de la reacción; los iones
facilitan la unión del cebador a la cadena molde y permiten la incorporación de los
nucleótidos a la cadena creciente.
7. ¿En qué consisten y para qué se usan la RT-PCR y qRT-PCR?
 RT-PCR: Método de laboratorio que se usa para hacer muchas copias de una
secuencia genética específica con el fin de analizarla. Se usa una enzima
llamada retrotranscriptasa que convierte un trozo específico de ARN en un
trozo de ADN compatible. Luego, otra enzima llamada ADN–polimerasa
amplifica (produce en grandes cantidades) ese trozo de ADN. Las copias de
ADN amplificadas ayudan a identificar si hay un gen que produce la
molécula específica de ARNm. Es posible usar la RT-PCR para detectar
ciertos cambios en un gen o cromosoma, o para identificar la activación de
ciertos genes, lo que ayuda a diagnosticar enfermedades, como el cáncer.
También sirve para estudiar el ARN de ciertos virus, como el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus de la hepatitis C, y de esta
manera facilita el diagnóstico y control de la infección.
 qRT-PCR: Método estándar para detectar y cuantificar una secuencia blanco
específica, o para cuantificar los niveles de expresión génica en una muestra.
En la qPCR, se incorporan a la reacción de PCR sondas o ácidos nucleicos
marcados con fluorescencia, o colorantes fluorescentes de unión al ADN de
doble cadena, y la formación del producto se monitoriza en tiempo real tras
cada ciclo de PCR.
8. Investigar al menos tres aplicaciones adicionales de la PCR: Gibbson, SLIC,
Mutagénesis, Secuenciación, RAPD, etc.
 La mutagénesis se basa en la extensión enzimática por PCR de dos
cebadores que incluyen, dentro de sus secuencias, las mutaciones deseadas.
Se utiliza como molde el DNA plasmídico que se debe mutar.
 El ensamble Gibson permite ensamblar múltiples fragmentos de ADN que
pueden clonarse de manera sencilla dentro de un vector. El protocolo
consiste en tener fragmentos de ADN con extremos complementarios que
pueden ser creados por PCR, posteriormente estos fragmentos se incuban
junto a un master mix de enzimas que contiene tres diferentes enzimas: una
exonucleasa que “mastica” los extremos 5’ del fragmento generando
extremos voladizos largos que permiten que las regiones monocatenarias se
unan por homología, una polimerasa de alta fidelidad para rellenar los
huecos y una ADN ligasa para sellar los huecos recocidos y rellenados.
  El analizador de DNA ABIPrism 377 es un instrumento automático
combinado con programas computacionales cuyo funcionamiento consiste
en una separación electroforética de los productos de PCR, luego los
productos de PCR (que han sido marcados con una marca fluorescente) son
detectados espectralmente. Finalmente, mediante programas
computacionales se analizan los datos obtenidos.

Referencias
Bolivar A. M., Rojas A., Garcia-Lugo P. (2014). PCR y PCR-Múltiple: parámetros críticos
y protocolo de estandarización. Avan Biomed; 3: 25-33. Recuperado de:
https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/4796903.pdf
winkler. (2017). Taq DNA Polimerasa. Recuperado de: http://winklerltda.cl/quimicav2/wp-
content/uploads/2017/04/polimerasas.pdf
Pregunta 1: Pachón, D. M. R. (s/f). Diseño de oligonucleotidos iniciadores (Primers).
EMBnetColombia. Recuperado de:
http://bioinf.ibun.unal.edu.co/documentos/primers/primer.php
Pregunta 2: Asuar, L. E. (s/f). Guía práctica sobre la técnica de PCR. Recuperado de:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/530/cap17.pdf
Pregunta 3: Díaz, A. S., Rentería, L. F., Cortez, J. A., & Palacios, E. S. (s/f). PCR:
reacción en cadena de la polimerasa. Recuperado de:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcr.pdf
Pregunta 4: Díaz, A. S., Rentería, L. F., Cortez, J. A., & Palacios, E. S. (s/f). PCR:
reacción en cadena de la polimerasa. Recuperado de:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcr.pdf
Pregunta 5: Díaz, A. S., Rentería, L. F., Cortez, J. A., & Palacios, E. S. (s/f). PCR:
reacción en cadena de la polimerasa. Recuperado de:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcr.pdf
Pregunta 6: Pérez, A. M. (s/f). Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain
Reaction, PCR). Recuperado de:
https://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena
%20de%20la%20polimerasa.pdf
Pregunta 7: qPCR and RT-qPCR. (s/f). Promega. Recuperado de:
https://worldwide.promega.com/products/pcr/qpcr-and-rt-qpcr/#related-resources
Jawerth, N. (2020). Detección del virus de la COVID-19 mediante la RT-PCR en tiempo
real. IAEA. Recuperado de: https://www.iaea.org/es/newscenter/news/pcr-en-tiempo-real-
covid-19#
Pregunta 8: Vallejo, J. A. (2016). MODIFICACIÓN DE VECTORES PLASMÍDICOS Y
SU APLICACIÓN EN POLÍMEROS ELR PARA APLICACIONES BIOMÉDICAS.
Recuperado de: https://uvadoc.uva.es/bitstream/handle/10324/19683/TFM-M314.pdf
Mastranzo, E. R. (2020). Diseño y construcción de vectores de expresión genética para
plantas [Benemérita Universidad Autónoma de Puebla]. Recuperado de:
https://repositorioinstitucional.buap.mx/bitstream/handle/20.500.12371/11265/2020081120
1651-TL.pdf?sequence=1
Introducción al diagnóstico por PCR y aplicaciones. (2001). Recuperado de:
https://bibliotecadigital.fia.cl/bitstream/handle/20.500.11944/144842/F01-1-BT-
080_MA.pdf?